术后肠梗阻（POI）是腹部手术后的一种并发症，可导致发病率升高和住院时间延长。由于目前缺乏有效的预防或治疗策略，亟需加强相关研究。因此，我们建立了一种标准化且可行的小鼠模型，用于研究POI的病理生理机制，并探索潜在的治疗方案。
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本文内容
摘要
摘要
胃肠道炎症是多种人类疾病的常见原因。动物研究模型对于探究肠道病理中复杂的细胞和分子机制至关重要。尽管在许多炎症性疾病中，黏膜层常常是研究关注的器官，但近期研究表明，肠肌层（ME）也是一个高度具备免疫能力的器官，其中含有密集的常驻免疫细胞网络1,2。这些研究是在标准化的肠道操作（IM）模型中进行的，该模型可诱导肠壁炎症，且炎症主要局限于ME。临床上，这种炎症会导致持续性的肠道运动功能障碍，称为术后肠麻痹（POI），这是腹部手术后常见且难以避免的并发症3。该炎症的特征是释放促炎介质，如IL-64或IL-1β，以及抑制性神经递质如一氧化氮（NO）5。随后，大量免疫细胞渗出至ME，以多形核中性粒细胞（PMN）和单核细胞为主，最终维持POI状态2。这种肠道麻痹可持续数天，增加误吸、细菌移位及感染性并发症（直至败血症和多器官功能衰竭）的风险，并带来巨大的经济负担6。
在本文中，我们展示了标准化的IM模型 体内 胃肠道传输（GIT）和结肠传输的评估。此外，我们展示了一种将肌间神经丛（ME）与黏膜层分离的方法，随后进行免疫学分析，这对于区分这两个高度免疫活性的肠壁结构区室中的炎症反应至关重要。所有分析方法均可轻松应用于任何其他影响胃肠道功能的研究模型。
方案
1. 动物
雄性C57Bl6/J小鼠，平均体重25 g，购自德国博兴的Harlan Winkelmann公司。所有实验均遵循联邦动物保护相关法律法规，并按照实验室动物护理原则进行操作。小鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由摄取商品化啮齿类动物饲料和自来水。 随意摄取动物在进入实验动物设施后，应至少饲养 7 天方可开始实验。 请注意，所有实验均可轻松适用于大鼠或其他物种，并可通过稍作修改应用于大型动物模型。
2. 手术操作步骤
- 使用异氟烷（Abbott，Wiesbaden，德国）在氧气中诱导并维持麻醉。动物麻醉起效后，将其置于仰卧位，并用胶带（Leukosilk，Beiersdorf，Hamburg，德国）固定四肢。
- 剃除腹部毛发并进行外科消毒后，沿腹壁正中切开长约2厘米的切口。沿白线切开进入腹腔。放置两个无菌拉钩以保持腹腔开放。轻柔地将小肠向左外翻，并置于湿棉纱布上。
- 使用两个湿润且无菌的棉签（MaiMed，Neunkirchen，德国）从幽门向盲肠方向同步滚动，清除整个小肠腔内容物。注意：避免小肠壁出血或肠管血管损伤。将肠道复位至腹膜腔内时避免扭转，以防发生缺血或机械性梗阻，随后使用两层连续的5/0聚酰胺不可吸收缝线（Ethicon，Norderstedt，德国）关闭腹壁切口。
3. 术后护理
- 操作后将动物置于加热灯下，观察直至其从麻醉中恢复。将小鼠放回笼中，并提供水和食物。由于阿片类药物会影响肠蠕动，我们在围手术期通过饮水给予非甾体抗炎药（例如安乃近）进行镇痛。
4. 肌内注射后24小时的功能研究
- 胃肠传输（GIT）
- 在肌肉注射（IM）后22.5小时，用异氟烷在氧气中对小鼠进行轻度麻醉。小心地将小鼠头部过度伸展，并用钝头镊子拉出舌头。用至少100 μl荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖，70,000 MW，Sigma Aldrich，Taufkirchen，德国）填充1 ml注射器，连接至动脉导管（Vygon，Ecouen，法国），然后小心地将导管作为胃管插入胃中。
- 短暂注射100 μl FITC-葡聚糖后拔出导管。让动物苏醒，并等待90分钟。在此期间，小鼠可自由获取食物或水。
- 准备15个2 ml离心管，并依次编号。
- 在灌胃后90分钟处死小鼠，取出从胃到直肠的整个胃肠道。将肠道置于聚苯乙烯垫上，避免拉伸。注意：必须轻柔地取出肠道，以防止液态FITC-葡聚糖移位至相邻肠段。初学者可在每段的起始和末端使用夹子辅助操作。
- 测量小肠全长和结肠全长。通过使用套管将小肠固定在聚苯乙烯垫上，将其分为10个等长的节段。将结肠分为3个节段。共准备15个节段（胃为#1），10个等长的小肠节段（#2–11），盲肠（#12）以及3个等长的结肠节段（#13–15）。
- 在标记位置横切肠道，用镊子夹住后，用1.0 ml KHB冲洗一次，将冲洗液注入预先准备好的含2.0 ml KHB的离心管中，剧烈涡旋20秒。胃和盲肠直接放入已准备好的离心管中并剪碎。向这些管中加入1.0 ml KHB，从而将剪刀上的肠腔内容物残留冲洗入管中。
- 在台式离心机中，以12,000 rcf室温离心5分钟。离心期间，另准备15个依次编号的1.5 ml离心管。
- 将澄清的上清液转移至新的1.5 ml离心管中，避光保存于4 °C直至分析（下一步）。样品可在4 °C保存数天而FITC信号无明显损失。如需长期保存，可添加0.09%叠氮化钠或储存于< -18 °C。
- 将上清液100 μl重复取样加入黑色96孔板（Greiner Bio One，Frickenhausen，德国）。同时加入两份100 μl KHB作为空白对照。
- 使用荧光读板仪（Safire，Tecan，Crailsheim，德国）读取数据，在494 nm（激发波长）/521 nm（发射波长）下定量荧光强度。从样品值中减去空白值。
- 通过以下公式计算FITC-葡聚糖分布的几何中心（GC），即标记物分布的重心：GC = ∑（每个节段荧光信号占总信号的百分比 × 节段编号）/ 100
注意：通过将每个节段的荧光百分比乘以其节段编号，可评估标记物在肠道内分布的加权平均值。该数值同时受标记物分布范围和移动距离的影响，但不假设特定的分布模式。7 计算得到的GC值通常与展示FITC葡聚糖在胃肠道中分布情况的图表结合呈现（图1A）。 - 结肠传输
- 使用2%异氟烷在氧气中对小鼠进行轻度麻醉。注意：确保动物在40秒内能够苏醒。
- 通过将瘘管探针（金属棒，直径2 mm）经肛门插入结肠，仔细检查结肠通畅性。
- 使用瘘管探针将一颗直径2 mm的玻璃珠向前推进至结肠内3 cm处，然后立即拔出探针。将小鼠放入透明笼中，并从探针拔出结肠时开始计时。密切观察小鼠，一旦玻璃珠排出体外即刻停止计时。
5. 分离中脑标本的组织化学分析
- 将空肠中段从肠道中切下，置于含冷KHB的Sylgard培养皿中。
- 使用 0.2 mm 昆虫针（Fine Science Tools，德国海德堡）将肠系膜固定在培养皿中。
- 沿肠系膜缘切开肠段，并将其拉伸至原长度和宽度的约120%。在肠系膜对侧使用昆虫针固定。用新鲜的冰冻KHB小心冲洗硅胶培养皿，以彻底清除管腔内容物。
现在可以从肠系膜侧开始将肌间神经丛（ME）从黏膜层机械分离。制备过程中需多次更换新鲜的冷克氏液（KHB）。 - 分离的黏膜层可置于液氮中速冻，用于后续分析，或丢弃。
- 在室温下用100%乙醇固定分离的ME全组织10分钟。
用预冷的KHB洗涤整体样本三次。注意：其他固定剂（即 4% 甲醛、乙酸、丙酮）也可在测试其与后续分析的兼容性后使用。 - ME整体封片已可进行后续的组织化学或免疫组织化学染色：
- 组织化学：髓过氧化物酶（MPO）染色
可通过以下 MPO 染色方案检测浸润的中性粒细胞。- 将 10 mg Hanker Yates 试剂（Polyscience Europe, Eppelheim, Germany）溶于 10 ml KHB 中，并加入 100 μl 3% H2O2。使用前即刻新鲜配制，不可重复使用。
- 室温孵育整体封片 10 分钟。
- 用冷 KHB 充分冲洗标本，并孵育 10 分钟。
- 将标本封片于水性封片剂（Aquatek, Merck, Darmstadt, Germany）中，干燥 2 小时后在光学显微镜下观察切片。
- 计数 5 个随机选择视野中的细胞数量，并以 MPO 阳性细胞 / mm2 计算。
- 免疫组织化学染色：
参照组织化学 MPO 染色方法，可对整体封片进行免疫组织化学染色。原则上，您已建立的细胞培养或组织切片的免疫组织化学染色方案可轻松调整用于整体封片染色。然而，强烈建议针对特定抗体优化实验步骤。- 将标本切成 5 × 5 mm 的小片，并在 2.0 ml 圆底离心管中使用约 150 μl - 200 μl 抗体溶液进行染色。
- 固定和封闭步骤（例如，含 3% BSA 的 PBS，室温孵育 1 小时）可在“sylgard 培养皿”中进行。
- 在 12 孔板中进行 PBS 或其他缓冲液的洗涤步骤。
- 用尖头镊子小心地在染色管和洗涤板之间转移标本。
- 最终洗涤步骤后，将标本封片于抗荧光淬灭封片剂中，加盖盖玻片，并用荧光显微镜观察。
6. ME 的器官培养
- 在注射后24小时切除整个小肠，置于含有200 U/ml青霉素G的冷KHB溶液中 100 μg/ml 链霉素（KHB + P/S）
- 将肠道切成3 cm长的片段，并用大头针将每一段固定在盛有Sylgard的玻璃培养皿中。
- 用精细剪刀去除肠系膜，并将肠道套在编织针上。
- 用锋利的镊子轻轻切开中耳黏膜（ME），并用湿润的棉签将其从黏膜下层剥离。黏膜层（tunica mucosa）保留在编织针上，可立即冷冻以供进一步研究。收集的中耳黏膜置于预冷的KHB + P/S中。
- 将分离的ME条切成2-4 mm长的小段，在冰浴的KHB + P/S中孵育30分钟，并将标本反复冲洗数次。
- 将约 50–60 mg ME（至少一小段小肠的一半 ME）转移至无菌的 24 孔板中，孔内含有 500 μl 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）
- 孵育于 37 °C 和5% CO2 再继续培养24小时。
- 在显微镜下检查细胞培养物是否存在细菌或真菌污染。
- 收集上清液，在1,000 rcf条件下离心5分钟，然后在液氮中速冻。同时，将肌肉组织置于洁净的纸巾上干燥30秒并称重。
- 上清液可用于后续通过ELISA或其他方法分析释放的细胞因子（IL-6）或其它代谢物即 按照生产商说明书检测上清液中的亚硝酸盐（nitrite）。
- 根据ME组织重量对测得的浓度进行归一化处理。
7. 典型结果
- 功能研究
评估POI严重程度最重要的参数是对胃肠道（GIT）的检查 体内. 图1A 展示了未经处理的对照组和肠道手术小鼠在术后24小时沿胃肠道的FITC葡聚糖典型分布情况。“假手术”动物显示胃肠道功能正常，几何中心（GC）位于盲肠，而肠道操作（IM）导致胃肠道传输显著延迟，滞留于近端空肠图1B)
通过测量小鼠排出2 mm玻璃珠的时间，分别评估结肠运动功能。假手术小鼠的排出时间为48 - 200秒，而肠梗阻（IM）模型小鼠的排出时间显著延长，为470 - 775秒（图1C). - 形态学研究
为了描述中耳（ME）内炎症的范围，可利用组织化学或免疫组织化学方法分析多种白细胞表型。 图2A+B 假手术动物中观察到少量中性粒细胞（39±7 个细胞/mm2). 小肠的固有肌层（IM）导致了强烈的中性粒细胞（PMN）浸润（660±86 个细胞/mm²）2与假手术小鼠相比 - ME 器官培养
组织裂解液中难以检测到细胞释放的多种炎症介质。器官培养技术可使释放的介质在培养上清液中被检测到。在术后肠麻痹（POI）中，一典型介质是一氧化氮（NO），其为胃肠道中的主要抑制性神经递质。5
未手术对照动物的ME器官培养上清液中未检测到NO（5±6 μM/24 小时/毫克组织）。在假手术（剖腹术）小鼠中，基础 NO 水平为 53±36 μM/24 小时/毫克组织。手术后 24 小时取材的小鼠肠道组织 ME 培养物产生的 NO 显著增多（2254±853 μM/24 小时/毫克组织）在 24 小时 ME 器官培养期间（图3).
图1. 肠道操作（IM）对胃肠道传输（A+B）和结肠传输（C）的影响。胃肠道传输通过口服90分钟后，15个胃肠道节段（胃（Sto）、小肠（SI 1-9）、盲肠（Cec）和结肠（Co））中不可吸收的荧光素标记葡聚糖的百分比来测定。结肠传输时间定义为拔出瘘管探针至排出2 mm玻璃珠所需的时间。 (A) 假手术或肠道操作（IM）后异硫氰酸荧光素-葡聚糖在胃肠道的分布情况。与假手术动物相比，操作组动物体内的示踪剂主要位于近端空肠，而假手术组则主要位于盲肠或近端结肠。虚线表示计算所得的胃肠道半程点（GC）。(B) 胃肠道半程点（GC）的计算结果显示，IM术后胃肠道传输时间延长。(C) 与假手术动物相比，IM小鼠的结肠传输时间显著延迟。15个肠段的胃肠道半程点（GC）以均值表示（n=5）。结肠传输时间以均值及所有个体数值表示（n=6）。*** = p<0.001，Student's t检验。
图2. 小肠黏膜下层中MPO阳性细胞的检测。（A）在开腹手术（假手术）或肠梗阻（IM）处理后24小时，使用Hanker Yates试剂对小肠整装标本进行染色，以检测MPO阳性的中性粒细胞（PMN）。（B）每只小鼠随机选取5个视野，对MPO阳性细胞数量进行定量分析。每组n = 6只动物。*** = p<0.001，Student t检验。
图 3. ME培养上清液中一氧化氮（NO）的生成。分别取自未手术对照组、假手术组和肠梗阻（IM）小鼠术后24小时的肌肉标本，体外培养24小时。未经处理的小鼠仅显示极低的基础NO生成水平。开腹手术后，NO释放增加，但对照组与假手术组之间无显著差异。与未经处理组或假手术组小鼠相比，IM术后24小时NO生成显著增加。每组 n = 5 只动物。*** = p<0.001，单因素方差分析（1 way ANOVA）。
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讨论
一项比较研究分析了不同程度的肠操作（小肠膨出10分钟、使用两个棉签轻轻检查小肠、以及将小肠内容物排空至盲肠的肠操作）对术后肠麻痹（POI）的影响，结果显示手术操作程度与POI之间存在相关性。与其他组相比，实施肠操作（IM）组在肠壁固有层（ME）中出现最多数量的白细胞（中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞），导致更持久且更严重的POI8。
建立肠梗阻模型时，标准化操作和肠管操作的强度是关键步骤。操作过程中必须严格避免接触肠系膜，以防出血。肠管操作强度不足会导致小肠扩张不充分。不同外科医生在肠管操作技术和强度上的差异，可能导致术后肠麻痹（POI）发生率出现显著差异。同一实验中应由同一操作者完成所有动物的操作。
分析胃肠道及结肠传输功能 体内 至关重要，必须谨慎操作。实验过程中，每只动物应饲养在避光的笼具中，并置于安静的房间内。动物在进入动物房后应至少饲养7天，以适应环境（食物、水、房间、明暗周期、免疫条件）。同时测量胃肠道和结肠传输时间，还可用于区分治疗区域与非治疗区域的肠道炎症与肠麻痹。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，KA1270/3-1/2）和BONFOR（O-112.0040）基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ethilon 5/0 | Ethicon | 1666H | |
| 棉签 | MaiMed | 71010 | |
| 动脉导管 | Vygon | 115-798 | |
| 96孔板（黑色） | Greiner Bio One | 655096 | |
| 玻璃珠（直径2 mm） | Worf | 按需提供 | |
| 昆虫针 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Hanker Yates 试剂 | Polyscience | 560694 | |
| Aquatek | Merck | HC109850 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604 F | |
| 异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（分子量70000） | Sigma Aldrich | 46945-500MG-F |
参考文献
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