肠道运动功能及肠壁炎症在啮齿类动物中的功能评估：标准化肠道操作模型中的分析

摘要

术后肠梗阻（POI）是腹部手术后的一种并发症，可导致发病率升高和住院时间延长。由于目前缺乏有效的预防或治疗策略，亟需加强相关研究。因此，我们建立了一种标准化且可行的小鼠模型，用于研究POI的病理生理机制，并探索潜在的治疗方案。

摘要

胃肠道炎症是多种人类疾病的常见原因。动物研究模型对于探究肠道病理中复杂的细胞和分子机制至关重要。尽管在许多炎症性疾病中，黏膜层常常是研究关注的器官，但近期研究表明，肠肌层（ME）也是一个高度具备免疫能力的器官，其中含有密集的常驻免疫细胞网络^1,2。这些研究是在标准化的肠道操作（IM）模型中进行的，该模型可诱导肠壁炎症，且炎症主要局限于ME。临床上，这种炎症会导致持续性的肠道运动功能障碍，称为术后肠麻痹（POI），这是腹部手术后常见且难以避免的并发症³。该炎症的特征是释放促炎介质，如IL-6⁴或IL-1β，以及抑制性神经递质如一氧化氮（NO）⁵。随后，大量免疫细胞渗出至ME，以多形核中性粒细胞（PMN）和单核细胞为主，最终维持POI状态²。这种肠道麻痹可持续数天，增加误吸、细菌移位及感染性并发症（直至败血症和多器官功能衰竭）的风险，并带来巨大的经济负担⁶。

在本文中，我们展示了标准化的IM模型 体内 胃肠道传输（GIT）和结肠传输的评估。此外，我们展示了一种将肌间神经丛（ME）与黏膜层分离的方法，随后进行免疫学分析，这对于区分这两个高度免疫活性的肠壁结构区室中的炎症反应至关重要。所有分析方法均可轻松应用于任何其他影响胃肠道功能的研究模型。

方案

1. 动物

雄性C57Bl6/J小鼠，平均体重25 g，购自德国博兴的Harlan Winkelmann公司。所有实验均遵循联邦动物保护相关法律法规，并按照实验室动物护理原则进行操作。小鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由摄取商品化啮齿类动物饲料和自来水。 随意摄取动物在进入实验动物设施后，应至少饲养 7 天方可开始实验。 请注意，所有实验均可轻松适用于大鼠或其他物种，并可通过稍作修改应用于大型动物模型。

2. 手术操作步骤

1. 使用异氟烷（Abbott，Wiesbaden，德国）在氧气中诱导并维持麻醉。动物麻醉起效后，将其置于仰卧位，并用胶带（Leukosilk，Beiersdorf，Hamburg，德国）固定四肢。
2. 剃除腹部毛发并进行外科消毒后，沿腹壁正中切开长约2厘米的切口。沿白线切开进入腹腔。放置两个无菌拉钩以保持腹腔开放。轻柔地将小肠向左外翻，并置于湿棉纱布上。
3. 使用两个湿润且无菌的棉签（MaiMed，Neunkirchen，德国）从幽门向盲肠方向同步滚动，清除整个小肠腔内容物。注意：避免小肠壁出血或肠管血管损伤。将肠道复位至腹膜腔内时避免扭转，以防发生缺血或机械性梗阻，随后使用两层连续的5/0聚酰胺不可吸收缝线（Ethicon，Norderstedt，德国）关闭腹壁切口。

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讨论

一项比较研究分析了不同程度的肠操作（小肠膨出10分钟、使用两个棉签轻轻检查小肠、以及将小肠内容物排空至盲肠的肠操作）对术后肠麻痹（POI）的影响，结果显示手术操作程度与POI之间存在相关性。与其他组相比，实施肠操作（IM）组在肠壁固有层（ME）中出现最多数量的白细胞（中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞），导致更持久且更严重的POI⁸。

建立肠梗阻模型时，标准化操作和肠管操作的强度是关键步骤。操作过程中必须严格避免接触肠系膜，以防出血。肠管操作强度不足会导致小肠扩张不充分。不同外科医生在肠管操作技术和强度上的差异，可能导致术后肠麻痹（POI）发生率出现显著差异。同一实验中应由同一操作者完成所有动物的操作。

分析胃肠道及结肠传输功能 体内 至关重要，必须谨慎操作。实验过程中，每只动物应饲养在避光的笼具中，并置于安静的房间内。动物在进入动物房后应至少饲养7天，以适应环境（食物、水、房间、明暗周期、免疫条件）。同时测量胃肠道和结肠传输时间，还可用于区分治疗区域与非治疗区域的肠道炎症与肠麻痹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ethilon 5/0	Ethicon	1666H
棉签	MaiMed	71010
动脉导管	Vygon	115-798
96孔板（黑色）	Greiner Bio One	655096
玻璃珠（直径2 mm）	Worf	按需提供
昆虫针	Fine Science Tools	26000-25
Hanker Yates 试剂	Polyscience	560694
Aquatek	Merck	HC109850
DMEM	Lonza	BE12-604 F
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（分子量70000）	Sigma Aldrich	46945-500MG-F