小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。
本文内容
摘要
摘要
小胶质细胞是属于骨髓细胞系并驻留在中枢神经系统（CNS）中的细胞1这些细胞在与神经炎症相关的多种疾病的病理过程中发挥着重要作用，例如多发性硬化症（MS）。2在正常中枢神经系统中，小胶质细胞表达巨噬细胞标志物 CD11b，并通过低水平表达 CD45 等活化标志物而呈现静息表型。当中枢神经系统发生病理事件时，小胶质细胞被激活，表现为 CD45 及其他标志物的表达上调。3影响中枢神经系统中小胶质细胞表型和功能的因素尚未得到充分研究。微小RNA（miRNAs）是一类长度约22个核苷酸、不断扩展的保守分子家族，参与多种正常的生理过程，如细胞生长和分化。4 以及炎症等病理状况5miRNA 通过与靶 mRNA 的互补序列结合，下调特定靶基因的表达，在包括巨噬细胞在内的天然免疫细胞活化过程中发挥重要作用6 和小胶质细胞7为了研究定义小胶质细胞表型和生物学功能以及区分小胶质细胞与其他类型巨噬细胞的miRNA介导通路，对中枢神经系统（CNS）驻留小胶质细胞不同亚群中特定microRNA的表达水平进行定量评估至关重要。目前用于检测中枢神经系统中miRNA表达的常用方法包括对全脑组织进行定量PCR以及 原位 杂交。然而，对整个组织匀浆进行定量PCR无法评估小胶质细胞中miRNA的表达，因为小胶质细胞仅占神经组织细胞的5–15%。杂交 原位 可在组织切片中评估特定细胞类型内microRNA的表达，但该方法并非完全定量。本文报道一种定量且灵敏的方法，通过实时PCR检测从正常中枢神经系统（CNS）或实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种多发性硬化症的小鼠模型）诱导的神经炎症状态下分离的小胶质细胞中的miRNA。该方法可用于测量在正常中枢神经系统或与多种病理状态（包括多发性硬化症、脑卒中、创伤性损伤、阿尔茨海默病和脑肿瘤）相关的神经炎症过程中，小胶质细胞内microRNA的表达水平。
方案
1. 从正常中枢神经系统中分离小胶质细胞
小胶质细胞的分离按照先前所述方法进行修改后操作3。
- 准备解剖和灌注所需的器械：剪刀、镊子、带有27G针头的10 ml注射器、15 ml Dounce匀浆器（特氟龙/玻璃）、40 μm尼龙细胞筛、40%和70% Percoll溶液、1X PBS。
- 通过在CO2麻醉舱中快速窒息（缺氧）处死小鼠，并立即转移至实验台进行手术操作和灌注。
- 进行手术操作（使用剪刀和镊子，并以70%乙醇作为消毒剂）：切开腹腔，剪开膈肌，打开胸腔，并用剪刀剪开右心房。
- 通过将10 ml注射器插入左心室并施加压力，进行全身心内灌注。以缓慢而稳定的速度将8–10 ml的1X PBS经血液循环灌注。
- 对组内所有小鼠重复步骤1.2–1.4（通常为5–10只小鼠）。灌注完成后，将小鼠置于冰上，直至所有小鼠均完成灌注。
- 所有小鼠灌注完成后，分离脑组织和脊髓。（可选：若需研究miRNA在脑不同区域的表达情况，可分别解剖5–10只小鼠脑中的特定区域，如小脑、海马等，并将组织合并后进行匀浆。）
- 使用15 ml Dounce匀浆器匀浆脑组织和脊髓。将一只小鼠的脑组织和脊髓放入匀浆器中，加入5 ml 1X PBS，轻柔研磨10–20次；将匀浆液经细胞筛滤入50 ml锥形管中，在大离心机上以2000 rpm离心5–7分钟。
- 弃去上清液，将2–3只小鼠的脑/脊髓匀浆物重悬于5–7 ml 70% Percoll溶液中，然后在其上方覆盖7 ml 40% Percoll溶液。以2000 rpm（不启用刹车！）离心30分钟。
- 弃去70% Percoll上层的受损细胞/髓鞘碎片，收集40%/70% Percoll界面处的单个核细胞。用1X PBS至少以1:1比例稀释收集的细胞，2000 rpm离心5–7分钟。将细胞重悬于0.5 ml PBS中，转移至1.7 ml离心管。每只小鼠通常可获得约500 × 103个单个核细胞，由此2–3只小鼠脑和脊髓组织制备的细胞悬液中，小胶质细胞数量约为1 × 106个，总体积为0.5 ml。
2. 通过流式细胞术控制小胶质细胞的纯度
抗体染色按照先前所述方法进行，略有修改7,8。
- 准备FACS缓冲液（含2% FBS的1× PBS）、FcR封闭抗体、抗CD11b-PE、抗CD45-APC-Cy7抗体以及PBS中的1%多聚甲醛。
- 从步骤1.9中取出50 μl细胞，转移至新的1.7 ml离心管中，并加入350 μl FACS缓冲液。
- 加入5–10 μl抗FcR抗体，在冰上孵育10–15分钟。
- 将细胞分装至两个离心管中。向其中一管加入1 μl抗CD11b-PE和2 μl抗CD45-APC-Cy7抗体，在冰上孵育10–15分钟；另一管作为抗体染色的阴性对照。抗体孵育后，向两管中各加入1 ml FACS缓冲液，并在小型离心机中以5400 rpm离心5分钟。离心后，将细胞重悬于400 μl PBS中的1%多聚甲醛中，涡旋混匀以固定细胞。
- 使用流式细胞仪（LSR II，BD Biosciences）进行流式细胞术分析，并采用BD compubeads（BD Biosciences）进行补偿对照，方法如文献8所述。图1a、b展示了制备良好与不良的示例。
3. 从小鼠神经炎症模型中分离炎症中枢神经系统内的小胶质细胞和外周巨噬细胞
实验性自身免疫性脑炎（EAE）的诱导方法如我们之前发表的论文中所述7；FACS分选操作参照已发表的实验方案进行8。
- 通过皮下免疫注射，使用150 mg MOG35-55 肽段与4 mg/ml完全弗氏佐剂（CFA）混合物，对5-10只8-12周龄的C57BL/6小鼠进行EAE诱导。免疫后第0天和第2天应腹腔注射百日咳毒素（每只小鼠150 ng）。从免疫后第10天开始观察小鼠疾病症状，并按0-5的数值评分标准评估疾病严重程度：0）无疾病；1）尾巴无力或行走不稳；2）后肢轻瘫；3）后肢瘫痪；4）后肢和前肢瘫痪；5）死亡或因人道原因实施安乐死。实验使用免疫后第21天（疾病高峰期）的小鼠，其典型疾病评分为1.5至2.5。
- 按照步骤1.1-1.4的方法，从5-10只小鼠的中枢神经系统中分离单核细胞，并按照步骤2.1-2.4使用抗CD11b和抗CD45抗体对细胞进行染色。在步骤2.4中不要固定细胞，而是将细胞重悬于400 μl 1X PBS中，而非1%多聚甲醛溶液。
- 使用FACSAria对CD11b+CD45low的小胶质细胞和CD11b+CD45hi细胞群进行细胞分选（其中约80%为外周巨噬细胞，约20%为活化的小胶质细胞3；后续我们将此类细胞统称为“巨噬细胞”）。使用1.7 ml的Eppendorf管收集样品。为防止分选后细胞受损，应在收集管中加入300 μl含10%胎牛血清（FBS）的1X PBS。微胶质细胞、巨噬细胞和淋巴细胞三个细胞群的分选示例见图2a，相应的分选门控设置见图2b。通过重新分析分选后的微胶质细胞（图2c）和巨噬细胞（图2d）群体，确定典型的分选纯度为98-100%。从五只小鼠组成的组别中分离所得的典型产量为：微胶质细胞20-50 ×103，巨噬细胞50-100 ×103。
4. RNA 的提取
将采用 mirVana 试剂盒，按照生产商说明书进行RNA提取，并稍作修改。
- 将步骤1.9中从正常中枢神经系统获得的小胶质细胞或步骤3.3中分选的小胶质细胞与巨噬细胞亚群，置于1.7 ml离心管中，在小型离心机中以5400 rpm离心5–7分钟，小心弃去上清液，并将细胞沉淀在干冰上速冻。可继续进行步骤4.2，或将冷冻的细胞沉淀转移至-70 °C保存，可保存2–3个月。
- 将冷冻的细胞沉淀转移至普通冰上解冻。加入300 μl mirVana试剂盒中的裂解缓冲液，用移液器轻柔吹打5–7次混匀。
- 加入30 μl mirVana试剂盒中的匀浆添加剂，涡旋振荡30秒以混匀，冰上静置10分钟。
- 加入300 μl mirVana试剂盒中的酸性苯酚:氯仿溶液，涡旋振荡30秒，然后在小型离心机中以10,000 rpm离心5分钟。
- 小心吸取上层水相（300 μl），转移至另一支1.7 ml离心管中，加入375 μl 100%乙醇，混匀后转移至mirVana试剂盒中的过滤柱，以10,000 rpm离心1分钟。
- 弃去穿流液，加入700 μl mirVana试剂盒中的洗涤液I，以10,000 rpm离心1分钟。
- 再用500 μl mirVana试剂盒中的洗涤液II洗涤两次，最后用60 μl预热的无核酸酶水从过滤柱中洗脱RNA。
- 使用Nanodrop分光光度计测定RNA的浓度和质量。RNA浓度应在5–20 ng/μl之间，OD λ260/λ280比值应在1.7–2.0范围内。若RNA浓度低于3 ng/μl且OD 260/280比值低于1.6，则弃用样品。RNA样品可在-70 °C保存6–12个月。
- 为进一步评估RNA质量，使用15% TBE-尿素凝胶（Life Technologies）进行凝胶电泳分析。高质量与低质量RNA制备的典型示例分别如图3a和图3b所示。
5. 小胶质细胞和巨噬细胞中miRNA的检测
为了分析miRNA表达，采用TaqMan探针法进行实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析，使用针对特定microRNA以及一种普遍表达的小RNA（如snoRNA-55、snoRNA-135或U6）的引物和荧光探针进行标准化。针对特定人源或鼠源miRNA的引物和荧光探针可从Life Technologies Inc.公司购买。本文将以miR-124作为目标miRNA的示例，以snoRNA-55作为标准化的示例。
- 使用 TaqMan 逆转录试剂盒，对 RNA 样本进行逆转录反应以合成 cDNA：
| 项目 | 每样本体积 (μl) |
| 5x RT 引物 | 1.00 |
| RNA 样本 | 1.67 |
| RT 酶混合物 | |
| 每种 25 mM（总共 100 mM）dNTPs | 0.050 |
| MultiScribe 逆转录酶 | 0.333 |
| 10X RT 缓冲液 | 0.500 |
| AB RNase 抑制剂 | 0.063 |
| 无核酸酶水 | 1.388 |
| 总计 | 5.00 |
将RNA样品稀释至浓度为3 ng/μl。配制逆转录酶混合液，取3.33 μL加入PCR管中，再加入1.67 μl的RNA样品。在PCR仪（BioRad）中于16 °C孵育30分钟，42 °C孵育30分钟，85 °C孵育5分钟，最后设置为4 °C保存。
- 使用 TaqMan PCR 混合液进行实时 PCR 反应：
| 项目 | 每样本体积 (μl) |
| RT 产物 | 1.0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5.0 |
| 5X 探针 | 2.0 |
| 无核酸酶水 | 2.0 |
| 总量 | 10.0 |
每个反应使用一个384孔透明光学反应板（Life Technologies）和实时荧光定量PCR仪AB 7900 HT。扩增条件：95 °C 预变性10分钟，[95 °C 变性5秒，60 °C 退火延伸60秒] 40个循环。
- 显示了从小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）分离的RNA样本（每个样本设两个重复）中扩增snoRNA-55和miR-124的荧光标记特异性PCR产物量（y轴）随循环次数（x轴）变化的典型曲线 图 4a，b.
6. 标准化与数据分析
采用之前描述的ΔΔCT法7,9计算目标miRNA（miR-124）的相对表达水平，以snoRNA-55对初始RNA量进行标准化。
- 小胶质细胞和BMDM中miR-124表达相对水平的计算示例如表I所示。
- 第一步，根据qRT-PCR曲线确定小胶质细胞和BMDM中snoRNA-55和miR-124的Ct值（图4；表I，列：snoRNA-55 和 miR-124）。
- 第二步，通过从miR-124的Ct值（实验）中减去snoRNA-55的Ct值（归一化），计算每个样本重复孔的ΔCt值（表I，列：Ct (Norm)、Ct(Exp) 和 ΔCt）。
- 第三步，通过从其他样本的ΔCt值中减去参考样本的ΔCt值（ΔCt(Ref)），计算ΔΔCt值（表I，列：ΔΔCt）。其中一个样本被定义为参考样本，该样本中miRNA的表达相对水平将被设定为1.0，其余所有样本均与此参考样本进行比较。在本例中，我们将小胶质细胞第一个样本中miR-124的表达水平定义为1.0，因此ΔCt(Ref) = 0.49（表I第一行，以红色标记）。
- 最后，相对表达水平按2-ΔΔCt计算（表I，列：miR-124 expression）。
- 所有qRT-PCR实验均设置三复孔或双复孔，相对表达水平以三复孔的均值±标准差（S.D.）表示（图5a,b），或如图5c所示将双复孔结果并列展示。
7. 代表性结果
实时PCR的典型曲线以及miR-124（目标microRNA）和snoRNA-55（用于标准化）的CT值，还有miR-124的相对表达水平，如图4和表I所示。在我们的实验中，使用snoRNA-55作为标准化对照。如上所述，其他普遍表达的RNA也可用于标准化，例如snoRNA-135和U6。
成年小胶质细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中miR-124表达的示例显示于 图 5a （BMDMs 在 M-CSF 存在下培养，方法如前所述）7）。在 图 5b我们比较了分选后的CD45细胞群体中miR-124的表达水平低 小胶质细胞与CD45你好 小胶质细胞。在这两个实验中，我们均证明了小胶质细胞通过表达更高水平的miR-124而区别于其他巨噬细胞。未来可开展类似实验，以研究小胶质细胞活化的动力学过程。 在体内 或 体外.
不同发育阶段从C57BL/6小鼠中枢神经系统分离的小胶质细胞中miR-124的表达情况如图所示 图 5c这些数据表明，在发育早期阶段的小胶质细胞表达较低水平的miR-124，这与其活化表型相关。7可进行类似的分析以研究小胶质细胞在正常中枢神经系统中的功能，例如比较从中枢神经系统不同区域（如小脑、脊髓、海马等）分离的小胶质细胞中特定miRNA的表达情况。
图1. 通过流式细胞术确定的小胶质细胞良好与不良制备的示例。 在从小鼠正常中枢神经系统中“良好”分离小胶质细胞的情况下，95–98% 的细胞为 CD11b+CD45low 小胶质细胞，2–5% 为 CD11b+CD45hi 周血管巨噬细胞。CD11b-CD45hi 淋巴细胞或 CD11b-CD45- 星形胶质细胞、少突胶质细胞或细胞碎片的比例应低于 1%（a）。此处展示了一个“不良”制备的案例（b），其中存在 18% 的污染性 CD11b-CD45- 细胞（b，左下象限），提示 Percoll 梯度离心分离不充分。在良好制备的情况下，95–98% 的细胞应为 CD11b+CD45low 小胶质细胞（a，左上象限），所有细胞中 2–5% 应为 CD11b+CD45hi 周血管巨噬细胞（a，右上象限），而 CD11b 阴性的污染细胞应少于 1%（a，左下象限）。在“不良制备”的情况下，存在大量 CD11b-CD45- 污染细胞或细胞碎片（如星形胶质细胞、髓鞘颗粒等）（b，左下象限），导致细胞样本不适合用于 RNA 提取及后续分析。此外，“不良制备”样本中还可能出现 CD11b-CD45hi 细胞（b，右下象限），提示由于灌注不充分导致血液淋巴细胞污染。
图2. 来自病变中枢神经系统的小胶质细胞和外周巨噬细胞群体的流式细胞术分析与分选。（a）在神经炎症期间，中枢神经系统中存在三类细胞群体：CD11b+CD45low（小胶质细胞）、CD11b+CD45hi（巨噬细胞）和 CD11b-CD45hi（淋巴细胞），分别显示在左上、右上和右下象限。用于分选 CD11b+CD45low 小胶质细胞和 CD11b+CD45hi 巨噬细胞的设门策略如（b）所示，分选后重新分析的细胞群纯度如（c,d）所示。初步设门基于FSC/SSC参数选择活细胞。
图3. 小胶质细胞中分离的RNA经凝胶电泳分析后显示“良好”与“不良”质量的示例。 在质量良好的情况下，可见RNA标记物及核糖体RNA条带（a）。在质量不良的情况下，可见弥散条带及低分子量的降解产物（b）。
图4. 荧光标记的miR-124和snoRNA-55 PCR产物的实时定量qRT-PCR曲线。 显示了小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中snoRNA-55（a）和miR-124（b）的扩增曲线。实验重复两次。Ct值通过基线与qRT-PCR曲线线性范围下部的交点确定，如图（b）所示。 点击此处查看高清大图。
| snoRNA-55 | miR-124 | DCt=Ct(Exp)-Ct(Norm) | DDCt=DCt-DCt(Ref) | 相对表达水平=2-DDCt | |
| Ct (Norm) | Ct(Exp) | DCt | DDCt | miR-124 表达 | |
| 正常中枢神经系统来源的小胶质细胞 | 24.082 | 24.572 | 0.49(参考值) | 0 | 1.0 |
| 23.766 | 24.291 | 0.525 | 0.035 | 1.02 | |
| 骨髓来源巨噬细胞 (BMDMs) | 26.879 | 32.231 | 5.352 | 5.317 | 0.025 |
| 26.526 | 32.078 | 5.552 | 5.517 | 0.022 |
表 I. 基于 miR-124（目标 microRNA）和 snoRNA-55（标准化对照）的 Ct 值，计算小胶质细胞与骨髓来源巨噬细胞中 miR-124 表达水平的相对值。
图5. 小胶质细胞和巨噬细胞中miR-124表达的分析。 （a）显示了正常中枢神经系统中的小胶质细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中miR-124表达水平的比较。（b）显示了神经炎症小鼠中枢神经系统中小胶质细胞与外周巨噬细胞中miR-124表达的比较。（c）显示了1周、2周和4周龄小鼠的小胶质细胞中miR-124表达水平在发育过程中的变化，并与成年小鼠（8周龄）进行比较。在（a, b）中，实验重复三次，数据表示为三次独立PCR反应的平均值±标准差。在（c）中，实验按指示重复两次。
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讨论
近年来，小胶质细胞及其在与神经炎症和神经退行性病变相关多种病理过程中的作用受到广泛关注。此外，微小RNA（microRNA）在免疫细胞和癌细胞分化中的作用在过去几年中显著增加5,10。我们此前已报道miR-124在维持正常中枢神经系统中小胶质细胞非活化或静息表型中的作用7，但其他类型微小RNA在小胶质细胞表型及活化状态中的作用仍有待揭示。这需要开发新的方法，以特异性检测小胶质细胞中微小RNA的表达水平。
小胶质细胞在实验中难以处理，因为它们从中枢神经系统（CNS）分离后会迅速活化并发生显著改变。此前已有文献发表过从正常中枢神经系统分离小胶质细胞的方案11,12。尽管这些方案可用于RNA提取，但我们认为它们更适合mRNA表达分析，而不适用于microRNA表达的检测。首先，许多研究者采用对匀浆组织进行酶消化或磁珠分选纯化的方法，这些操作会激活小胶质细胞，导致microRNA表达发生显著变化（未发表观察结果）。其次，作者使用基于Trizol的方法提取RNA11，而这种方法在处理少量小胶质细胞时，尤其...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了 NIH R01 NS071039-01A1 研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | 可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | 可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4 |
| DMEM；FBS | GBCO | 11965；10438 | |
| miRVana 试剂盒 | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 通过将10 ml 10X PBS与90 ml Sigma公司的Percoll混合，配制100 ml 100% Percoll。通过将35 ml 100% Percoll与15 ml DMEM混合，配制50 ml 70% Percoll。通过将20 ml 100% Percoll与30 ml 1X PBS混合，配制50 ml 40% Percoll |
| MOG35-55 肽 | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| 百日咳毒素 | Sigma | P7208 | |
| FcR 封闭抗体 | BD Biosciences | 553142 | 克隆号 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE 单克隆抗体 | BD Biosciences | 553311 | 可使用不同荧光染料（例如 AF488）标记 |
| Anti-CD45-APC-Cy7 单克隆抗体 | Biolegend | 103116 | 可使用不同荧光染料（例如 APC）标记 |
| 多聚甲醛（16%） | EMS Inc | 15710 | 用1X PBS按1:15稀释 |
| 15% TBE-尿素凝胶 | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒 | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan 通用 PCR 主混合液 | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA 检测试剂 mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA 检测试剂 snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| 无核酸酶水 | Life Technologies Inc | AM9937 | 无核酸酶水 |
| 384孔透明光学反应板 | Life Technologies Inc. | 4309849 | 可根据不同实时PCR仪器替换为其他规格板（例如96孔板） |
| Dounce 匀浆器（15 ml） | Wheaton Science Products. | 358044 | 聚四氟乙烯/玻璃材质 |
| 40 μ 尼龙细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 大型离心机 | Sorval | RT 6000B | 转子直径 18.5 cm |
| 小型离心机 | Eppendorf | 5415 R | 转子直径 6.5 cm |
| 实时PCR仪 | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | 可替换为其他仪器 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciencess | LSR II | 可替换为其他仪器 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | 可替换为其他仪器 |
| Nanodrop 分光光度计 | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
参考文献
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