方法文章

非等离子体键合PDMS用于低成本微流控器件的制备

35.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/410

⸱

2007年11月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine (UCI), 2Stem Cell Research Center, University of California, Irvine (UCI), 3Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine (UCI)

本文内容

摘要

在本视频中，我们演示如何在不使用等离子体键合的情况下使用神经元微流控装置。

摘要

在本视频中，我们演示如何在不使用等离子体键合的情况下使用神经元微流控装置。在某些情况下，可能需要将装置可逆地键合到Corning No. 1盖玻片上。这可能是由于缺乏等离子体清洗仪所致。在其他情况下，可能在神经元培养完成后，为了进行某些类型的显微镜观察或免疫染色而需要将装置从玻璃上移除；尽管实际上无需移除装置即可完成免疫染色，因为神经元可在装置内直接染色。然而，部分研究人员仍倾向于移除装置。此时，将装置可逆地键合至盖玻片便成为必要条件。非等离子体键合方式存在一些缺点，例如密封性较差。在某些情况下，轴突可能在沟槽下方生长，而非穿过沟槽。此外，由于玻璃和PDMS具有疏水性，液体难以进入装置，有时需要施加外力将培养基或其他试剂推入装置。液体虽可通过毛细作用进入装置，但所需时间显著长于经过等离子体键合的装置。等离子体清洗仪会在玻璃和装置表面产生短暂的亲水性电荷，从而在键合后数秒内促进液体流过装置。而对于非等离子体键合的装置，液体流过通常需要数分钟。还需注意的是，用于非等离子体键合的装置必须预先灭菌，而经等离子体处理的装置则无需在使用前额外灭菌，因为等离子体清洗过程本身具有灭菌作用。

方案

制备用于神经元细胞培养的微流控装置

1) 清洁 Corning No.1 24 mm × 40 mm 玻璃载玻片

  • 将玻片置于水浴超声仪中，超声处理 30 分钟
  • 用 70% EtOH 冲洗玻片
  • 用 dH2O 洗涤玻片三次
  • 将玻片在组织培养罩中干燥数小时，最好过夜

注意：我们有专门的金属托盘用于装载载玻片。将载玻片单独分开后放入该金属架的槽中。然后可将这些金属装载托盘置于一个玻璃皿中，加入水后放入水浴超声波清洗器中，超声处理30分钟。后续的洗涤步骤也在该玻璃皿中进行。

2）制备PDMS装置

  • 从硅晶圆上切下PDMS模具，在PDMS铸件上打孔并将其分为四等份
  • 首先用惰性气体（氩气或氮气）吹扫PDMS器件进行清洁，然后使用3M Scotch Brand 471胶带去除任何残留的碎屑

注意：必须将器件正面朝上放置。最初，当我们把PDMS从硅片上切下时，与硅片接触的一面是干净的一面：这一面含有微流控通道。我们应尽可能小心，避免损坏器件，并在准备进行等离子体键合前，始终保持干净的一面朝上。

  • 将设备放入塑料容器中进行高压灭菌
  • 灭菌后，使用Harrick品牌的等离子清洗机清洁Corning 1号玻璃载片并对设备进行等离子处理，www.harrickplasma.com
  • 将设备清洁面朝下放置在玻璃载片上。

该装置现已通过等离子体键合至玻璃载片上。

3）用多聚-L-赖氨酸（PLL）包被装置

  • 将PLL加入装置每侧的孔中，并使其流入下一个孔

=> 大孔中加入 150 µl PLL，小孔中加入 30 µl PLL。只要孔内加满即可，无需完全精确。

注意：如果观察该装置，您会看到4个孔，每两个孔相互连通。您需要将PLL加入其中一个孔，使其流经装置进入下一个孔。

  • 让PLL流经装置约10分钟，然后向孔中补充PLL至充满
  • 将含有PLL的装置置于37°C培养箱中孵育至少4小时（过夜孵育更佳）
  • 处理后用真空泵吸除多余的PLL，但需注意不要将装置内的液体完全吸干

注意：切勿向通道或腔室中引入气泡。仅需将孔中多余的 PLL 抽走即可。

  • 向装置两侧的每个孔中加入经高压灭菌的 dH2O，通过毛细作用使其流入另一侧的孔中

图1是微流控装置的示意图。请注意蓝色（胞体侧）和红色（轴突侧）部分的连接方式。当我们提到在装置每侧的一个孔中加入PLL、水或培养基时，具体操作例如：在其中一个蓝色孔中加入150 µl经高压灭菌的dH2O，然后在其中一个红色孔中加入150 µl经高压灭菌的dH2O。水（或PLL、培养基、细胞）将通过装置流向另一侧对应的孔。

神经科学研究用静态平衡示意图，标注有胞体侧和轴突侧，450 µm。

  图1

注意：请注意，从现在开始，当我说“将培养基、细胞、水或PLL加入上层小室”时，指的是上方示意图中胞体位于左侧、轴突向右侧生长的情况。

  • 吸去水分（再次注意不要完全移除装置中的所有液体），然后向每对相连孔中的一个加入150 µl灭菌去离子水（dH2O），使其流至对应的孔中。
  • 将含有去离子水（dH2O）的装置置于37°C培养箱中孵育1小时，然后重复洗涤步骤一次。总共用去离子水（dH2O）洗涤装置三次，每次一小时。

注意：由于PLL中的硼酸盐可能被PDMS吸收，Jeon实验室的一些研究人员建议在初步快速冲洗几次后，将装置用灭菌去离子水（dH2O）孵育过夜。这将确保在接种细胞之前，所有游离的硼酸盐均已从PDMS中浸出。如果未执行此步骤，硼酸盐可能会随时间逐渐释放到培养基中，从而导致细胞毒性。

  • 向顶部孔中加入含有必要因子（GlutaMax、B27、青霉素-链霉素）的神经基础培养基（NBM）

注意：设备可过夜孵育，次日接种细胞；或在接种细胞前，使用NMB加因子至少孵育3小时。

准备将神经元载入装置

我们使用18天大的胎鼠大脑皮层，这些组织可从名为Brain Bits的公司购买，也可由我们校园内自行制备。我们更倾向于获取新鲜的组织。

  1. 获取保存在 Hibernate E 中的1个胎儿脑皮层（2块组织）
  2. 取3根长玻璃移液管，使用酒精灯将其依次烧制成逐渐变细的尖端
  3. 用玻璃移液管从Hibernate E中取出组织，放入无菌15 ml离心管中，加入2 ml NMB + Factors。
  4. 吹打混悬 使用移液球和玻璃移液管将皮质组织上下吹打约5至10次。随后，换用下一个更小的移液管对组织进行上下吹打。最后，使用最小的移液管再次对组织进行上下吹打。我们通常确保组织中无可见的块状物。

    注意： 最近，Jeon 实验室开始比较从保存在 Hibernate E 中的组织获取的细胞与从最初用 0.125% 胰蛋白酶在 50% 无钙、无镁解离缓冲液中处理的组织制备的细胞。共识认为，使用胰蛋白酶处理的组织比直接放入 Hibernate E 的组织能获得更高活力的细胞。如果你不打算立即使用组织，则需要将组织保存在 Hibernate E 中。

    如果需要立即使用组织并希望提高细胞活性，则在机械吹打前用胰蛋白酶处理组织，步骤如下：1）将1 ml 0.25%胰蛋白酶（Gibco, Invitrogen）与1 ml无钙无镁解剖缓冲液混合，加入15 ml离心管中（终浓度为0.125%，保持冰上低温）；2）将组织放入该缓冲液中，立即于 37°C 8分钟；3）加入10 ml DMEM/10% FBS以终止胰蛋白酶反应，并继续执行以下实验步骤。

  5. 以1100 rpm离心细胞1分钟
  6. 小心吸去细胞沉淀上方的培养基
  7. 向沉淀中加入1 ml NMB + 因子，用移液器上下吹打重悬
  8. 通过重力流将重悬的细胞经滤器过滤，以去除任何团块（BD Falcon 细胞筛，40 μm 尼龙）
  9. 计数并接种细胞：
    • 向微量离心管中加入 60 µl NMB + 因子， 20 µl 细胞悬液的量，以及 20 µl 台盼蓝染色后混匀
    • 添加约 10 µl 将此溶液加入血细胞计数板，计数活细胞（未染成蓝色的细胞）
    • 调整浓度至 2.5 - 4.5 x106 细胞/毫升

      注意： 我们通常获得的细胞浓度约为 2.5 - 4.5 x 106 个细胞/毫升，具体取决于细胞重悬的体积（通常为 1 毫升 NBM + B27/Glutamax/PenStrep 每皮层）。如果组织制备过程中使用了胰蛋白酶，细胞得率可能会提高。

装置的包被

  1. 将细胞（原代神经元）加入装置的一个小孔中
  2. 每个小型装置加入 5 µl，每个大型装置加入 20 µl

    注意：可将 10 µl 细胞悬液加在装置顶部，另 10 µl 加在底部（各占总体积的一半），或直接将全部 20 µl 细胞悬液加入顶部胞体孔中（小型装置则在顶部胞体孔中加入 5 µl）。

  3. 在 37°C 培养箱中孵育 10 分钟，使细胞开始贴附
  4. 根据装置大小，向每个孔中加入约 150/30 µl 的 NMB 培养基加因子

    注意：体积可能因 PDMS 层厚度不同而有所变化。关键是要确保孔内液体完全充满。

使用设备时无需等离子体键合的补充说明

无需进行等离子处理，每周不使用等离子体都能成功操作的技术员Christina Tu表示，可直接立即加载细胞。

请记得移除胞体侧两个孔道中的培养基（轴突侧的培养基是否移除无关紧要）。正是液体流动促使细胞进入主通道。如果孔道中残留培养基，将无法形成液体流动。

讨论

本文展示了如何在无需使用等离子清洗仪的情况下使用神经元微流控装置，我们将此方法称为非等离子体键合。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PDMS试剂Dow CorningSylgard 184 及固化剂。请咨询 Dow Corning 以查找您附近的供应商
Cornig No. 1 Cover Glass盖玻片CorningCorning No. X2935 244可通过 Fisher Scientific 购买，Fisher 目录号 12-531D
B27试剂Invitrogen17504-044B27 是 Invitrogen 公司 Gibco 细胞培养试剂系列中的专有添加剂。
Glutamax试剂Invitrogen35050-061Glutamax 可通过 Invitrogen 公司的 Gibco 细胞培养试剂系列获得。
60 mm 培养皿工具Fisher Scientific08-757-13A60 mm 聚苯乙烯无菌培养皿用于承载固定在玻璃上的装置。
Poly-L-Lysine试剂Sigma-AldrichP-1274
BD Falcon 50 ml 离心管工具BD BiosciencesFalcon No. 352098可通过 Fisher Scientific 目录号 14-959-49A 购买
BD Falcon 15 ml 离心管工具BD BiosciencesFalcon No. 352097可通过 Fisher Scientific 目录号 14-959-70C 购买

参考文献

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PDMS

相关文章