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高通量纯化亲和标签重组蛋白

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DOI：

10.3791/4110

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2012年8月26日

 , 
1Department of Life Sciences, Imperial College London

本文内容

摘要

我们介绍一种利用液体处理机器人进行亲和标签纯化重组蛋白的方法。该方法通常适用于高通量模式下小规模纯化可溶性His标签蛋白。

摘要

X射线晶体学是获取蛋白质结构详细信息的首选方法。此类研究需要结合进一步的生物化学分析，以深入理解结构与功能之间的关系。随着寡核苷酸和基因合成技术的进步，大规模的定点突变策略变得越来越可行，包括将目标残基逐一替换为其余19种氨基酸。通过观察功能获得或功能丧失的表型，可系统性地得出结论，例如特定残基对催化活性、蛋白质稳定性或蛋白质-蛋白质相互作用特异性所起的作用。

为了将不同的表型归因于突变的性质，而非实验条件的波动，以可控且可重复的方式纯化和分析蛋白质至关重要。高通量策略以及在机器人液体处理平台上对人工操作流程的自动化，使得在极少人为干预和极低错误率的情况下开展此类复杂的分子生物学实验成为可能1-5。

本文介绍了一种高通量纯化带组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白的通用方法。在最近的一项研究中，我们将该方法应用于基础转录机制组分TFIIB的结构与功能的详细分析。TFIIB对于体外启动子导向的转录至关重要，并且在将RNA聚合酶招募至转录起始前复合物的过程中发挥必需作用in vitro6-8。TFIIB含有一个可伸展的连接域，该结构域能够深入RNA聚合酶的活性位点裂隙9-11。该连接域赋予TFIIB两种可被生物化学定量检测的功能活性：（i）在转录起始的“流产性”阶段刺激RNA聚合酶的催化活性；（ii）进一步促进RNA聚合酶特异性地招募至转录起始前复合物4,5,12。我们利用该高通量纯化方法，在TFIIB连接域内构建了单点、双点及三点取代突变和缺失突变，并在功能实验中系统分析了这些突变体对RNA聚合酶催化活性的刺激作用4。总计，我们构建、纯化并分析了381个突变体——若采用手动操作，这项工作将极为耗时且劳动强度巨大。我们对蛋白质进行了多次重复制备与检测，从而能够评估实验中的变异情况，并清晰了解结果的可重复性。

该方法是一种用于纯化His标签蛋白的通用方案，已成功用于纯化其他重组蛋白。目前该方法已优化用于24种蛋白的纯化，但也可调整适用于多达96种蛋白的纯化。

方案

A 部分：细菌培养物的高通量培养。

1. 使用24孔板，在2 ml自动诱导培养基中过夜培养细菌

  1. 通过微波炉对24孔板进行灭菌。
  2. 在1.5 ml自诱导培养基（Overnight Express Medium）中接种新鲜培养的细菌菌落或冻存的甘油菌种。我们通常每个突变体接种三个独立的克隆菌落，共三孔。预留六孔用于阳性对照和阴性对照。阳性对照中培养三个野生型克隆，阴性对照中培养两个转化了非表达质粒的克隆。通过留出一孔仅加培养基作为空白对照，以检测培养板灭菌是否充分。
  3. 在37 °C、250 rpm振荡条件下培养细胞18小时。我们使用lac诱导型BL21 (DE3) Rosetta 2细胞。自诱导培养基含有葡萄糖和乳糖的混合物。细菌首先利用葡萄糖生长，随后开始利用乳糖，后者同时诱导重组蛋白的表达。
  4. 取下盖子，将培养板放置于机器人平台上。

第二部分：重组蛋白的机器人纯化。

2. 准备机器人平台

  1. 配制洗涤缓冲液，包含 20 mM 咪唑、0.1% Triton X-100、0.5 M NaCl、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.9）、10 mM MgOAc2、0.7 mM ZnOAc2、10% 甘油；以及洗脱缓冲液，包含 0.5 M 咪唑、0.1% Triton X-100、0.5 M NaCl、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.9）、10 mM MgOAc2、0.7 mM ZnOAc2、10% 甘油。这些缓冲液将分别用于在目的蛋白结合磁珠后洗涤磁珠，或从磁珠上洗脱蛋白。
  2. 配制细菌稀释液（100 ml 蒸馏水中加入 15 μl 消泡剂）。该溶液用于对细菌过夜培养物进行稀释，以进行光密度（A600）测定。稀释液中的消泡剂可防止产生气泡，避免干扰酶标仪的测量结果。
  3. 配制裂解液，包含 10x FastBreak 裂解试剂、每样品 2 μl Lysonase 及 15 mM MgOAc2。FastBreak 含有可破坏细菌细胞壁并促进胞内蛋白释放的去垢剂与盐类混合物。Lysonase 是一种专有的溶菌酶与核酸酶混合物。溶菌酶有助于破坏细胞壁，而核酸酶可降解释放出的细菌核酸。
  4. 可选：配制 6 M 盐酸胍溶液。某些重组蛋白容易黏附在特氟龙涂层的移液针上。盐酸胍溶液可使蛋白变性，从而比常规用于清洗机器人移液针头的水更有效地去除残留蛋白。
  5. 通过混合双辛可宁酸溶液（试剂 A）与硫酸铜溶液（试剂 B）配制 BCA（双辛可宁酸）蛋白定量试剂：肽键将BCA试剂中的CuSO4组分所含的Cu2+还原为Cu1+，生成的Cu1+量与溶液中肽键的数量成正比。在第二步反应中，两个双辛可宁酸分子螯合一个Cu1+，导致吸光度转移至562 nm，产生紫色。该显色反应具有时间依赖性，通常需要数小时才能完全显色，之后颜色可在数小时内保持稳定。
  6. 将适当尺寸的储液槽或板放入机器人平台预设的位置。
  7. 在平台指定位置放置一个24孔板用于盛放盐酸胍废液，两个透明96孔板用于OD600和吸光度测定，一个蓝色96孔板用于存放纯化后的蛋白。将一个96深孔板置于磁力架上。
  8. 将可与蛋白His标签形成螯合物的MagneHis Ni-磁珠用蒸馏水稀释5倍后，加入磁珠搅拌装置中。开启搅拌器以保持磁珠处于悬浮状态。
  9. 开启机器人平台，并对移液针进行数分钟的冲洗，以去除可能影响移液准确性的气泡。在每次移液操作之间均需对可重复使用的移液针进行冲洗。也可选择使用一次性移液头。所有后续步骤均由机器人自动完成。机器人操作程序可根据要求提供。

3. 通过测量OD600检测细胞生长

  1. 将10 μl过夜培养物用90 μl稀释液进行稀释。
  2. 测定OD600，以确保细菌已生长至相近的密度（图1）。

4. 裂解细胞以释放蛋白质并允许磁珠结合

  1. 将100 μl磁性Ni-珠悬浮液分配至另一个24孔板的每个孔中。
  2. 将每种小规模细菌培养物900 μl转移至含有珠子的24孔板中。加入100 μl的10倍FastBreak/lysonase混合液。
  3. 将24孔板转移至摇床上，室温下快速振荡（800 rpm）30分钟。细菌细胞壁通过机械力与化学作用共同被破坏，重组表达的蛋白质释放到溶液中。这些蛋白质凭借其亲和标签立即结合到顺磁性镍螯合珠上。

5. 磁珠的洗涤

  1. 将含有重悬磁珠的细胞裂解液转移至置于带有磁棒支架上的96深孔板中，磁棒可在各孔之间滑动。96孔板具有方形锥形底部，便于去除上清液。各孔最大容纳体积为2.1 ml，但实际加入的液体体积要小得多，从而可在剧烈振荡时防止液体飞溅导致的样品交叉污染。
  2. 在每次移液操作之间，用6 M盐酸胍清洗移液吸头。此步骤对于TFIIB及其他“黏性”蛋白的纯化至关重要，可避免交叉污染。而对于其他蛋白，移液步骤之间可能只需用大量水充分冲洗针头即可。
  3. 磁力架的磁棒吸引顺磁性磁珠，使其移至孔的边缘，从而让移液针可自由接触上清液。随后弃去上清液。
  4. 首先将500 μl洗涤缓冲液加入24孔板，再转移至96孔板，以确保磁珠完全转移。随后将24孔板从振荡器上取下。
  5. 直接向96孔板中加入另外500 μl洗涤缓冲液，将该板转移至振荡器上，剧烈振荡1分钟。然后将板移回磁力架，并弃去洗涤缓冲液。
  6. 此步骤重复两次，最后通过去除板中残留的缓冲液完成洗涤程序。

6. 用洗脱缓冲液洗脱蛋白质

  1. 向珠子中加入 100 μl 洗脱缓冲液，将板放入摇床，在室温下剧烈振荡 30 分钟。
  2. 将板重新放回摇床，收集含有纯化重组蛋白的洗脱液，并转移至新板中。

7. 测定纯化蛋白质的浓度

  1. 将190 μl BCA试剂混合液转移至透明的96孔板中，再加入10 μl蛋白质溶液。
  2. 孵育数小时（通常为5-6小时或过夜）后，测定吸光度，并与BSA标准品比较，以确定各纯化蛋白质样品的浓度(图2)。
  3. 纯化后的蛋白质现在可在适当浓度下用于后续实验应用(图3)。

8. 典型结果

纯化方案包含两个质量控制阶段，文中展示了相应的示例。我们能够在细菌生长阶段（图1）识别并记录潜在问题，随后在评估纯化蛋白产量时进一步确认（图2）。我们通常对蛋白进行三份平行纯化并进行检测。结合上述两个质量控制步骤，可确保在功能实验中观察到的任何差异均源于突变体表型（图3），而非实验误差或纯化失败所致。通常获得的蛋白产量范围为50–200 μg，足以满足多种功能实验的需求。

Substitution effect of mjTFIIB residues A81-C91; bar chart; OD600 measurement; eukaryotic sequences.
图1. 24孔板中过夜培养物OD测量值的直方图。 培养了六种TFIIB突变体变体以及野生型TFIIB的三个克隆。两个携带非表达质粒的克隆以及一个仅含培养基的孔作为阴性对照。OD测量结果显示，不同培养物之间的生长速率存在较小差异。

蛋白质浓度；柱状图；SDS-PAGE凝胶；电泳；蛋白质分析；研究数据。
图 2. 通过BCA法测定并经SDS-PAGE验证的各培养物中获得的蛋白质产量。其中一种变异体的表达水平较低。结合图 1，我们可以得出结论：这种现象并非由细胞生长差异所致，而是由于蛋白质表达未能被有效诱导。

氨基酸替换对蛋白质活性的影响；下方为条形图和凝胶电泳结果。
图3. 转录实验的代表性结果。我们测定了TFIIB变体对RNA聚合酶（RNAP）产生短截转录产物的刺激活性。此处展示了TFIIB第87位赖氨酸（K87）所有单氨基酸替换突变体的刺激效应。较小的误差范围表明实验具有高度可重复性。下方显示了一块凝胶图像，比较了三种突变体与野生型（wt）、阴性对照（NC）以及仅洗脱缓冲液对照的实验结果。

讨论

本文所述的自动化重组蛋白纯化方法可在高度可重复的条件下，以小规模形式大量生产并纯化多种突变蛋白，且所需人工干预极少。图1和图2展示了系统性质量控制的结果以及纯化蛋白的示例。图3显示，在本示例中使用的纯化转录因子在功能检测中表现出高度可重复的性能。

尽管该实验流程最初是为古菌TFIIB的纯化而开发，但它广泛适用于带有亲和标签的蛋白质纯化。采用此类自动化纯化方案将显著促进对重组蛋白的生物化学分析，从而在难以通过人工操作实现的规模上加深我们对蛋白质-蛋白质相互作用的理解。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得了惠康基金会项目资助（078043/Z/05/Z）的支持，授予 R.O.J.W.。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
过夜速效即时TB培养基Merck Chemicals Ltd71491-4
FastBreakPromega Ltd.V8573
Lysonase生物加工试剂/1 mlMerck Chemicals Ltd71230
消泡剂204Sigma-Aldrich Company LtdA6426
MagneHis Ni-颗粒PromegaV8565
咪唑Sigma-Aldrich Company Ltd56750
Trizma碱Sigma-Aldrich Company Ltd.93362
NaClVWR27810.295
双辛可宁酸蛋白测定试剂Sigma-Aldrich Company LtdBCA1-1KT
深孔板 2.2 ml 方孔 聚丙烯 包装10个Anachem Ltd1810-00
微孔板 MicroWell 96孔 平底 聚苯乙烯 未经处理 每包5板 共12包 透明 每孔体积0.4 ml 尺寸128 mm × 86 mm Thermo Scientific NuncFisher Scientific Ltd.DIS-984-090M
蓝色微孔板VWRNUNC367001
24孔块 RB (24)Qiagen19583
盐酸胍VWRALFAA13543.0B
TheOnyx可清洗针头Aviso GmbH8152-317001
磁珠用试剂架Aviso GmbH8152-035003
酶标仪 Synergy HTBioTek4200-000043
机器人平台 TheOnyx 44OH/150/100Aviso GmbH8145-050046
微孔板振荡器 Variomag TeleshakerInheco3800047
96孔磁铁 类型AQiagen36915

参考文献

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