本文描述了一种制备具有可特异性结合蛋白质功能基团的纳米纤维的高效方法。该方法首先需要制备带有适当功能基团的聚合物。通过静电纺丝技术将该功能化聚合物加工成纳米纤维。采用共聚焦显微镜研究纳米纤维与蛋白质结合的有效性。
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摘要
摘要
静电纺丝是一种用于制备负载功能基团纳米纤维的有效加工方法。负载功能基团的纳米纤维可用于研究材料与生物标志物之间的相互作用 即 可作为生物传感器，在单分子检测方面具有潜在应用价值。我们开发了一种制备功能性聚合物的有效方法，其中功能基团具有特异性结合模型蛋白的能力。在本模型系统中，功能基团为2,4-二硝基苯基（DNP），蛋白为抗DNP IgE（免疫球蛋白E）。该功能性聚合物， α,ω通过阴离子活性聚合制备双[2,4-二硝基苯基己酸][聚（环氧乙烷）-b-聚（2-甲氧基苯乙烯）-b-聚（环氧乙烷）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）。聚合反应中使用的双功能引发剂是通过电子转移反应制备的 α甲基苯乙烯和钾（镜面）金属。首先将2-甲氧基苯乙烯单体加入引发剂中，随后加入第二种单体环氧乙烷，最后通过甲醇终止活性聚合物的反应。 α,ω二羟基聚合物[HO-PEO-P2MS-PEO-OH]与N-2,4-二硝基苯肼（N-2,4-DNP-）反应∈-氨基己酸，通过DCC偶联反应，生成 α,ω-双[2,4-二硝基苯基己酸][聚（环氧乙烷）-b-聚（2-甲氧基苯乙烯）-b-聚（环氧乙烷）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对聚合物进行了表征， 1氢核磁共振（H NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）。聚合物的分子量分布较窄（1.1–1.2），本研究中所用聚合物的分子量均大于50,000。这些聚合物呈黄色粉末状，可溶于四氢呋喃。一种水溶性CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/DMEG（二甲氧基乙二醇）复合物能够与溶液中的IgE在数秒内结合并达到稳态结合。较高分子量（不溶于水） 即 约50,000条CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP聚合物，含有1%单壁碳纳米管（SWCNT），在硅基底上加工成电活性纳米纤维（直径100 nm至500 nm）。荧光光谱显示，抗DNP IgE通过与纤维表面修饰的DNP功能基团结合而与纳米纤维发生相互作用。这些结果表明，经过适当功能化的纳米纤维在生物标志物检测器件的开发方面具有应用前景。
方案
1. α,ω-二羟基聚合物[HO-PEO-P2MS-PEO-OH]的合成
- 按照图1所示组装聚合反应器。本实验所用反应器包括一个100 ml圆底双颈烧瓶（带标准磨口外接头，Chemglass）、两个带活塞的流量控制接头（Chemglass）以及一根聚四氟乙烯（Teflon）搅拌棒。接头A（图1）用于通入超纯氮气（UHP Nitrogen），以防止空气和水分进入惰性体系；接头B（图1）用于向反应烧瓶中注入溶剂、单体和引发剂。
- 使用钠金属干燥200 ml四氢呋喃（THF），以二苯甲酮作为指示剂，在干燥氮气氛围下至少干燥6小时。
- 将10 ml 2-甲氧基苯乙烯在氢化钙中干燥24小时。
- 使用异丙醇与液氮混合物配制浆状冷却浴，并维持在-78 °C。
- 在氮气氛围下向聚合反应烧瓶中加入25 ml THF，并在整个聚合过程中始终保持反应器处于氮气氛围中（见图1）。
- 将100 ml圆底烧瓶浸入上述浆状冷却浴中。
- 向反应烧瓶中加入2 ml引发剂溶液（0.27 mmol/ml）。
- 注入第一种单体——2-甲氧基苯乙烯（4 ml）至反应烧瓶中。
- 让反应持续进行40分钟。
- 加入1 ml第二种单体——环氧乙烷。
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讨论
在本报告中，我们介绍了一种制备生物功能化纳米纤维的强有力方法。该纳米纤维被修饰上可特异性结合模型蛋白的功能基团。本文所报道的实验步骤与方法具有普适性，可用于制备携带任意所需功能基团的纳米纤维。阴离子活性聚合是一种强大的技术，可用于合成结构可控的聚合物，并通过共价键连接任意数量的特定功能基团，这些功能基团可针对特定的生物标志物。对于单体2-甲氧基苯乙烯而言，阴离子活性聚合技术已十分成熟。2 静电纺丝是一种多功能技术，通过改变电压以及调节待纺溶液的浓度，可轻松控制纤维的尺寸。5 纳米纤维表现出电阻型I-V特性，因此有望作为生物传感器中的活性元件发挥作用 即 该报道的方法在开发生物标志物检测装置方面具有前景。6,7
第一种单体2-甲氧基苯乙烯的聚合在40分钟内完成100% 即 100%的单体已转化为聚合物，第二种单体的聚合反应较慢，需要2天才能完成聚合。也就是说，单体一的聚合速度比单体二快。反应结束时不存在未反应的单体一，但在2天结束时仍残留少量未反应的单体二，但这不会影响聚合物的多分.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）HRD-0630456项目、NSF CREST计划以及NSF DMR-0934142项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钠金属 | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| 二苯甲酮 | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-甲氧基苯乙烯 | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| 四氢呋喃 | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| 氯苯 | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| 单壁碳纳米管 | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| 聚苯乙烯 | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| 硅片 | 硅 Quest 公司’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | 卡尔·蔡司公司 | Ultra 60 | |
| Bausch 探测站 & Lomb MicroZoom II 高性能显微镜 | 博士伦 | ||
| 徕卡共聚焦扫描系统 | 徕卡显微系统 | TCS SP2 | |
| 亚飞安远程源表 | 吉时利仪器公司 | 6430 | |
| 自动量程数字万用表 | Keithley Instruments | 175A | |
| 注射泵 | Chemyx 公司 | Fusion 200 | |
| 蔡司光学显微镜 | 卡尔·蔡司公司 | Zeiss/Axiotech |
参考文献
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
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