吞噬动力运动轨迹检测是一种用于评估细胞运动的方法。具体而言，该检测以定量方式随时间测量趋化运动（即细胞的随机运动）。该检测利用了细胞在胶体金包被的盖玻片上留下可测量运动轨迹的能力。
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本文内容
摘要
摘要
细胞运动性对于单细胞和多细胞生物而言都是一项重要的生物学过程。它不仅对单细胞生物向营养源移动或逃离不适宜环境至关重要，也在多细胞生物的组织发育、免疫监视和伤口愈合等过程中发挥关键作用1,2,3。该过程的失调可导致严重的神经、心血管和免疫系统疾病，并加剧肿瘤的形成与扩散4,5。在分子层面，肌动蛋白聚合和受体再循环已被证实对细胞前缘突起（片状伪足）的形成具有重要作用，从而驱动细胞向前迁移6,7,8。然而，关于细胞迁移的许多生物学问题仍有待解答。
细胞运动在人类健康与疾病中的核心作用凸显了理解该过程所涉及的具体机制的重要性，也使得评估细胞运动的准确方法尤为关键。通常使用显微镜来观察细胞的移动。然而，细胞移动速度较慢，使得细胞迁移的定量测量成为一项耗时耗力的过程，需要昂贵的相机和软件来生成运动细胞的定量延时影像。因此，许多研究人员迫切需要一种经济高效、操作简便且能够利用常规实验室设备进行细胞迁移定量测量的方法。
吞噬动力轨迹运动性检测利用移动细胞清除其路径上金颗粒的能力，在涂有胶体金的玻璃盖玻片上形成可测量的轨迹9,10。通过使用免费软件，可对每种处理条件下的多条轨迹进行分析，以满足统计学要求。该检测可用于评估多种细胞类型的运动性，例如癌细胞11,12、成纤维细胞9、中性粒细胞13、骨骼肌细胞14、角质形成细胞15、滋养层细胞16、内皮细胞17和单核细胞10,18-22。该实验方案包括制备涂有金纳米颗粒（Au°）的载玻片，这些金纳米颗粒是通过柠檬酸钠还原氯金酸（Au3+）生成的。该方法最初由Turkevich et al. 于1951年建立23，随后在20世纪70年代由Frens et al. 进行了改进24,25。经过该化学还原步骤后，金颗粒（直径10–20 nm）从反应混合物中析出，并可涂布于玻璃盖玻片上，随后即可用于细胞迁移分析9,26,27。
总体而言，吞噬动力学轨迹运动性测定是一种快速、定量且简便的细胞运动性检测方法。此外，该方法还可作为一种简单的高通量检测手段，适用于不适合进行延时成像的细胞类型，也可根据研究者的需求用于其他用途。结合无需昂贵显微镜和软件即可对多种细胞类型的运动性进行定量测量的优势，以及可使用常规实验设备和试剂的特点，吞噬动力学轨迹运动性测定成为致力于研究细胞运动性的科研人员的理想选择。
方案
1. 明胶包被盖玻片的制备
- 将酸洗过的玻璃盖玻片（直径 15 mm）放入无菌的塑料培养皿（100 mm）中。每皿放置 8–9 个盖玻片，并确保盖玻片彼此之间及与培养皿壁之间均不接触。
注意：盖玻片、针头和镊子必须保持无菌，以消除可能污染的微生物以及会影响细胞功能（包括细胞运动性）的内毒素。
- 称取明胶粉末，并将其悬浮于去离子水中，配制成终浓度为 0.5 g/300 ml 的明胶溶液。随后，该明胶溶液需进行高压灭菌。
- 用移液器将 2–3 滴明胶（约 100–150 ml）滴加至每张盖玻片上。
注意：需小心避免明胶接触培养皿，否则将无法从培养皿中取出盖玻片。
- 将涂有明胶的盖玻片放入100 mm培养皿中，在90 °C烘箱中烘烤10分钟。
- 用移液器轻轻吸除多余的明胶。
- 将盖玻片留在100 mm培养皿中，在70 °C烘箱中干燥45分钟。
- 干燥后，使用无菌、无内毒素的针头和镊子从100 mm培养皿中取出盖玻片（先用针头轻轻推动盖玻片边缘使其翘起，便于镊子轻柔取出）。
- 将单个明胶包被的盖玻片分别放入24孔板的各个孔中。
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结果
图中显示了在光学显微镜下拍摄的示例图像，展示单个细胞（本实验中的单核细胞）迁移后形成的轨迹区域（见图2）。非运动性细胞在其周围形成特征性的小型椭圆形或圆形轨迹，表明这些未受刺激的细胞具有较低的基础运动水平（见图2A和2B）。相比之下，高运动性细胞（在本系统中为人类巨细胞病毒（HCMV）感染的细胞）表现出定向迁移，在图2C和2D中可见拉长的轨迹区域。使用40倍物镜的倒置显微镜获取多个轨迹区域图像后，可利用ImageJ软件标记总轨迹面积（见图3）；其他软件也可获得类似结果。我们推荐使用ImageJ软件，因其免费且易于操作。运动性细胞在迁移过程中不会形成标准的几何形状轨迹，因此，使用ImageJ软件中的“自由手绘工具”（freehand tool）来标记运动细胞所形成的轨迹轮廓是一种便捷的分析方法（见图3）。在划定待分析的轨迹区域后，可通过点击ImageJ菜单栏中的“分析”（Analysis），然后从下拉菜单中选择“测量”（Measure），实现数据的定量测定。对
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讨论
本文介绍的吞噬动力轨迹运动性检测法是一种简单且高效的细胞迁移定量分析方法。由于可同时分析多种细胞类型9-17该方法在多个学科领域具有广泛的应用潜力。使用胶体金镀膜的玻璃盖玻片可测量运动细胞清除的轨迹面积。该检测方法能够测定不同刺激因素的影响（即 生长因子、纯化的细胞外基质配体、病毒、细菌）对细胞迁移能力的影响。此外，由于无需固定细胞，该实验方法可实现对细胞迁移过程在不同实验时间点的动态监测。同时，该方法仅需使用常规光学显微镜、配备电荷耦合器件（CCD）图像传感器的标准相机以及免费可用的软件，因此无需配备复杂的显微镜系统、高端相机或专用软件套件。尽管该实验设计简单，却是一种在多种实验条件下对多种细胞类型的迁移行为进行统计学分析的有力工具。例如，在这方面，该方法既可有效用于少量实验样本的研究，也可作为高通量筛选实验的有效手段。由于盖玻片上的细胞可在未固定状态下直接观察，该方法还可实现对活细胞运动行为的长时间动态分析，而无需配备带有封闭式恒温恒湿二氧化碳培养环境的显微镜系统。2 培养箱。此外，噬动轨迹运动性检测法有助于研究那些不适合进行延时成像的细胞的运动性，因为在基于胶体金的运.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（AI050677、HD-051998 和 GM103433）、Malcolm Feist 心血管研究奖学金以及美国心脏协会博士前奖学金（10PRE4200007）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃盖玻片（15 mm） | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| 明胶 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| 三水合四氯金酸 | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM（工作液终浓度） |
| 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5%（工作液终浓度） |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | O4042 | 3%（工作液终浓度） |
| 100 mm 组织培养皿 | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12 孔板 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 孔板 | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | 标准实验室烘箱即可满足要求 |
| 10 ml 刻度移液管 | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid 移液器填充/分配装置 | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 单通道手动移液器 | Rainin | PR-200 | |
| 200 μl 防污染吸头 | CLP | BT200 | |
| ImageJ 软件 | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | 许可：公共领域 | |
| 配备 Photometrics CoolSNAP fx 单色 12 位 CCD 相机的 Nikon Eclipse TE300 显微镜 | Nikon | 已停产；最接近的替代型号为 Nikon Eclipse Ti，但较低端的 Nikon 80i 也可适用。其他品牌也提供性能相当的显微镜。 | |
| 注意：以下列出的试剂和设备已在我们的多项研究中使用。只要具有相似规格，也可使用其他供应商提供的同类耗材、试剂和设备。 |
参考文献
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J.
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