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方法文章

基于吞噬动力轨迹运动测定法对细胞迁移的定量评估

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DOI：

10.3791/4165

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2012年12月4日

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1Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

本文内容

摘要

吞噬动力运动轨迹检测是一种用于评估细胞运动的方法。具体而言，该检测以定量方式随时间测量趋化运动（即细胞的随机运动）。该检测利用了细胞在胶体金包被的盖玻片上留下可测量运动轨迹的能力。

摘要

细胞运动性对于单细胞和多细胞生物而言都是一项重要的生物学过程。它不仅对单细胞生物向营养源移动或逃离不适宜环境至关重要，也在多细胞生物的组织发育、免疫监视和伤口愈合等过程中发挥关键作用1,2,3。该过程的失调可导致严重的神经、心血管和免疫系统疾病，并加剧肿瘤的形成与扩散4,5。在分子层面，肌动蛋白聚合和受体再循环已被证实对细胞前缘突起（片状伪足）的形成具有重要作用，从而驱动细胞向前迁移6,7,8。然而，关于细胞迁移的许多生物学问题仍有待解答。

细胞运动在人类健康与疾病中的核心作用凸显了理解该过程所涉及的具体机制的重要性，也使得评估细胞运动的准确方法尤为关键。通常使用显微镜来观察细胞的移动。然而，细胞移动速度较慢，使得细胞迁移的定量测量成为一项耗时耗力的过程，需要昂贵的相机和软件来生成运动细胞的定量延时影像。因此，许多研究人员迫切需要一种经济高效、操作简便且能够利用常规实验室设备进行细胞迁移定量测量的方法。

吞噬动力轨迹运动性检测利用移动细胞清除其路径上金颗粒的能力，在涂有胶体金的玻璃盖玻片上形成可测量的轨迹9,10。通过使用免费软件，可对每种处理条件下的多条轨迹进行分析，以满足统计学要求。该检测可用于评估多种细胞类型的运动性，例如癌细胞11,12、成纤维细胞9、中性粒细胞13、骨骼肌细胞14、角质形成细胞15、滋养层细胞16、内皮细胞17和单核细胞10,18-22。该实验方案包括制备涂有金纳米颗粒（Au°）的载玻片，这些金纳米颗粒是通过柠檬酸钠还原氯金酸（Au3+）生成的。该方法最初由Turkevich et al. 于1951年建立23，随后在20世纪70年代由Frens et al. 进行了改进24,25。经过该化学还原步骤后，金颗粒（直径10–20 nm）从反应混合物中析出，并可涂布于玻璃盖玻片上，随后即可用于细胞迁移分析9,26,27。

总体而言，吞噬动力学轨迹运动性测定是一种快速、定量且简便的细胞运动性检测方法。此外，该方法还可作为一种简单的高通量检测手段，适用于不适合进行延时成像的细胞类型，也可根据研究者的需求用于其他用途。结合无需昂贵显微镜和软件即可对多种细胞类型的运动性进行定量测量的优势，以及可使用常规实验设备和试剂的特点，吞噬动力学轨迹运动性测定成为致力于研究细胞运动性的科研人员的理想选择。

方案

1. 明胶包被盖玻片的制备

  1. 将酸洗过的玻璃盖玻片（直径 15 mm）放入无菌的塑料培养皿（100 mm）中。每皿放置 8–9 个盖玻片，并确保盖玻片彼此之间及与培养皿壁之间均不接触。

注意：盖玻片、针头和镊子必须保持无菌，以消除可能污染的微生物以及会影响细胞功能（包括细胞运动性）的内毒素。

  1. 称取明胶粉末，并将其悬浮于去离子水中，配制成终浓度为 0.5 g/300 ml 的明胶溶液。随后，该明胶溶液需进行高压灭菌。
  2. 用移液器将 2–3 滴明胶（约 100–150 ml）滴加至每张盖玻片上。

注意：需小心避免明胶接触培养皿，否则将无法从培养皿中取出盖玻片。

  1. 将涂有明胶的盖玻片放入100 mm培养皿中，在90 °C烘箱中烘烤10分钟。
  2. 用移液器轻轻吸除多余的明胶。
  3. 将盖玻片留在100 mm培养皿中，在70 °C烘箱中干燥45分钟。
  4. 干燥后，使用无菌、无内毒素的针头和镊子从100 mm培养皿中取出盖玻片（先用针头轻轻推动盖玻片边缘使其翘起，便于镊子轻柔取出）。
  5. 将单个明胶包被的盖玻片分别放入24孔板的各个孔中。

2. 胶体金包被盖玻片的制备

  1. 称取适量氯金酸（四氯金酸三水合物；HAuCl4·3H2O），然后溶于无菌去离子水中，配制成终浓度为 14.5 mM 的溶液（有毒）。每 8–9 张盖玻片准备 1.5 ml 该溶液。

警告：氯金酸如吞食有害，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，可能引起过敏性皮肤反应。吞食后有毒。

  1. 称取适量柠檬酸钠（三钠二氢 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸盐；Na3C6H5O7），然后将粉末重悬于去离子水中，配制成终浓度为 0.5% 的溶液。每 8–9 张盖玻片配制 1 ml 溶液。

警告：柠檬酸钠可能引起眼睛和皮肤刺激。还可能引起呼吸道和消化道刺激。

  1. 在无菌、无内毒素的烧杯中，加入 1.5 ml 无菌的 14.5 mM HAuCl4 溶液和 13.5 ml 无菌去离子水，混合后应得到淡黄色溶液。上述体积可制备 8–9 片胶体金盖玻片。
  2. 在持续搅拌下，将溶液置于加热板上加热至沸腾。

警告：溶液加热必须在通风橱中进行，因为蒸气可能有害或有毒。这些蒸气对黏膜和上呼吸道组织具有破坏性。

  1. 将烧杯从加热板上取下。
  2. 在搅拌的同时，加入 0.7 ml 的 0.5% 柠檬酸钠溶液。上述体积可制备 8–9 张胶体金盖玻片。
  3. 继续搅拌该混合溶液约 2 分钟（注意：溶液颜色将逐渐由浅黄色变为无色，再变为灰色、紫色、深紫色，最终变为红酒色或更理想的铁锈色）。此产物即为胶体金溶液。
  4. 将胶体金溶液在 10 ml 移液管中冷却 1–2 分钟（以防止加入胶体金溶液时盖玻片上的明胶层融化），然后将 1.0–2.0 ml 胶体金溶液分别加入先前置于 24 孔板中的明胶包被盖玻片上（加入明胶包被盖玻片的胶体金溶液量取决于溶液中金颗粒的沉淀情况——见下文注释）。

注意：由于金颗粒沉淀的效率可能存在差异，建议首先向明胶包被的盖玻片中加入 0.5–1 ml 胶体金溶液，然后将 24 孔板置于培养箱中孵育 0.5 小时。孵育结束后，应在光学显微镜下检查盖玻片上金颗粒的密度是否合适。金颗粒浓度过低或过高时的示例可参见 图 1 中的 20 倍显微图像。理想的金颗粒浓度（至少适用于单核细胞）可参见 图 2 中的 40 倍显微图像。由于不同细胞在盖玻片上的运动能力各异，因此每种细胞类型所需的金纳米颗粒最佳密度需通过实验确定。若金颗粒浓度不足，可向明胶包被的盖玻片中再添加 0.5–1 ml 胶体金溶液。

根据细胞大小的不同，金颗粒的合适浓度也会有所变化，因此最终取决于所检测运动性的细胞尺寸。例如，由于人单核细胞属于较小的细胞（约10-20 μm28），在我们的分析中需要较高浓度的金颗粒。适当分布的金纳米颗粒可使研究人员能够快速且高效地识别细胞轨迹的边缘。金颗粒浓度过高会阻碍细胞移动，从而影响对其运动性的准确测量；而浓度过低则会限制对细胞运动轨迹进行精确勾画的能力。

重要提示：如果金纳米颗粒的合成存在问题，可商业购买粒径范围为 5 nm 至 400 nm 的金纳米颗粒。此外，荧光微球也已被用于细胞运动性研究29。然而，使用这些微球需要荧光显微镜来分析细胞迁移。

  1. 将覆盖有胶体金的盖玻片放入24孔板中，置于37 °C培养箱内孵育，孵育时间从1小时至过夜。
  2. 孵育结束后，通过将盖玻片浸入无菌磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）中三次，冲洗并去除未结合的金颗粒。
  3. 将这些涂有胶体金的盖玻片转移至含有PBS的洁净12孔板中。
  4. 将盖玻片于4 °C保存直至使用（放入冰箱前用封口膜密封培养板）。

重要提示：始终将胶体金包被的盖玻片保存在某种液体/培养基中，因为如果盖玻片干燥，金颗粒可能会从表面剥落。胶体金盖玻片应在制备后2-3个月内使用。

质量控制：在单次噬动轨迹运动实验中，关键是要使用金颗粒浓度相似的盖玻片。这一简单要点可确保不同样本间细胞运动性的定量差异仅源于处理因素本身，而非胶体金涂层盖玻片的物理特性。我们倾向于在单个实验中仅使用同时制备的盖玻片，但已有研究表明，只要金纳米颗粒的密度一致，使用不同批次制备的盖玻片也是合适的。

3. 细胞运动性分析

  1. 将胶体金包被的盖玻片置于适合目标细胞的细胞培养基中。
  2. 将经过适当处理的细胞转移至置于24孔板中的胶体金包被盖玻片上。

注意：每种研究的细胞类型需要确定转移至单个孔中的细胞数量。理想情况下，细胞应均匀分布在涂有胶体金的盖玻片上，从而确保仅分析由单个细胞产生的轨迹，以便进行统计分析。若细胞接种密度过高，则很可能出现多个细胞轨迹重叠的现象。重叠的轨迹无法被准确量化，因此在最终分析测试细胞运动时不能将其纳入考虑。由于多个细胞共同作用导致的轨迹重叠通常易于观察，表现为合并或交叉的轨迹（在分析区域内），其中可在同一连续的无细胞区域中观察到两个或更多细胞。

  1. 在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 24 小时（或任何合适的时间；e.g. 我们曾分析过处理后 6 至 24 小时之间的单核细胞运动能力，以及处理后 12 小时的内皮细胞）。确定和测量细胞运动能力的最佳时间范围将因所研究的细胞类型而异，因此应针对每种细胞类型通过实验确定（但一个良好的起始点是处理后 6 至 12 小时）。

注意：如果需要在后续时间储存和/或分析实验用胶体金包被的盖玻片，则需将细胞和金纳米颗粒固定在盖玻片上。为完成此固定步骤，在执行完步骤 3.3 后，首先用 1× PBS 小心清洗盖玻片 2 次（建议采用浸入式清洗，以避免金纳米颗粒从盖玻片上脱落），然后使用标准的细胞固定方法，例如在室温下用 3% 多聚甲醛孵育。在孵育 15 分钟后，应移除 3% 多聚甲醛，并用 1× PBS 小心清洗盖玻片 3 次。固定后的盖玻片可储存在冰箱中。

  1. 使用光学显微镜，拍摄单个运动细胞形成的轨迹图像（注意：拍摄细胞轨迹所用的放大倍数将根据所研究的细胞类型而有所不同）。非运动性细胞和运动性细胞在胶体金包被的盖玻片上形成的细胞轨迹示例如图2所示。

注意：在吞噬动力轨迹运动分析中所用尺寸的金纳米颗粒已被证实对细胞完全无毒30。如有必要，可通过台盼蓝染色或检测其他细胞活力标志物来评估待测细胞的活力。若需进行此步骤，需考虑是否需要固定、固定方式等条件。

  1. 使用美国国立卫生研究院开发的免费软件，例如 ImageJ 软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或 NIH Image（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/），或由圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心开发的 ImageTool（http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html），根据所采集的图像，测定每个实验组中 10 至 20 个或更多细胞（每样本）清除的胶体金平均面积（以任意单位表示）。随后可对收集的结果进行统计学分析。例如，结果可表示为均值 ± 均值标准误（SEM），并进行 Student's t 检验，以 P 值 <0.05 作为判断样本间差异具有统计学意义的标准。图 3 和图 4 展示了分析细胞清除胶体金面积的操作步骤。

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结果

图中显示了在光学显微镜下拍摄的示例图像，展示单个细胞（本实验中的单核细胞）迁移后形成的轨迹区域（见图2）。非运动性细胞在其周围形成特征性的小型椭圆形或圆形轨迹，表明这些未受刺激的细胞具有较低的基础运动水平（见图2A和2B）。相比之下，高运动性细胞（在本系统中为人类巨细胞病毒（HCMV）感染的细胞）表现出定向迁移，在图2C和2D中可见拉长的轨迹区域。使用40倍物镜的倒置显微镜获取多个轨迹区域图像后，可利用ImageJ软件标记总轨迹面积（见图3）；其他软件也可获得类似结果。我们推荐使用ImageJ软件，因其免费且易于操作。运动性细胞在迁移过程中不会形成标准的几何形状轨迹，因此，使用ImageJ软件中的“自由手绘工具”（freehand tool）来标记运动细胞所形成的轨迹轮廓是一种便捷的分析方法（见图3）。在划定待分析的轨迹区域后，可通过点击ImageJ菜单栏中的“分析”（Analysis），然后从下拉菜单中选择“测量”（Measure），实现数据的定量测定。对

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讨论

本文介绍的吞噬动力轨迹运动性检测法是一种简单且高效的细胞迁移定量分析方法。由于可同时分析多种细胞类型9-17该方法在多个学科领域具有广泛的应用潜力。使用胶体金镀膜的玻璃盖玻片可测量运动细胞清除的轨迹面积。该检测方法能够测定不同刺激因素的影响（即 生长因子、纯化的细胞外基质配体、病毒、细菌）对细胞迁移能力的影响。此外，由于无需固定细胞，该实验方法可实现对细胞迁移过程在不同实验时间点的动态监测。同时，该方法仅需使用常规光学显微镜、配备电荷耦合器件（CCD）图像传感器的标准相机以及免费可用的软件，因此无需配备复杂的显微镜系统、高端相机或专用软件套件。尽管该实验设计简单，却是一种在多种实验条件下对多种细胞类型的迁移行为进行统计学分析的有力工具。例如，在这方面，该方法既可有效用于少量实验样本的研究，也可作为高通量筛选实验的有效手段。由于盖玻片上的细胞可在未固定状态下直接观察，该方法还可实现对活细胞运动行为的长时间动态分析，而无需配备带有封闭式恒温恒湿二氧化碳培养环境的显微镜系统。2 培养箱。此外，噬动轨迹运动性检测法有助于研究那些不适合进行延时成像的细胞的运动性，因为在基于胶体金的运...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（AI050677、HD-051998 和 GM103433）、Malcolm Feist 心血管研究奖学金以及美国心脏协会博士前奖学金（10PRE4200007）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃盖玻片（15 mm）Fisher Scientific12-545-83
明胶 300 BloomSigma-AldrichG-1890
三水合四氯金酸Fisher ChemicalG54-114.5 mM（工作液终浓度）
柠檬酸钠Fisher ScientificBP327-5000.5%（工作液终浓度）
多聚甲醛Fisher ScientificO40423%（工作液终浓度）
100 mm 组织培养皿Sarstedt83.1802
12 孔板Fisher Scientific08-772-29
24 孔板Fisher Scientific07-200-84
Techne Oven Hybridiser HB-1DLabPlanet2040500标准实验室烘箱即可满足要求
10 ml 刻度移液管Sarstedt86.1254.001
Pipet-Aid 移液器填充/分配装置Drummond13-681-15
P200 单通道手动移液器RaininPR-200
200 μl 防污染吸头CLPBT200
ImageJ 软件http://rsb.info.nih.gov/ij/许可：公共领域
配备 Photometrics CoolSNAP fx 单色 12 位 CCD 相机的 Nikon Eclipse TE300 显微镜Nikon已停产；最接近的替代型号为 Nikon Eclipse Ti，但较低端的 Nikon 80i 也可适用。其他品牌也提供性能相当的显微镜。
注意：以下列出的试剂和设备已在我们的多项研究中使用。只要具有相似规格，也可使用其他供应商提供的同类耗材、试剂和设备。

参考文献

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