方法文章

BLT人性化的鼠标使用一个基于干细胞的基因治疗肿瘤模型的建立

DOI：

10.3791/4181

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2012年12月18日

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1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

本文内容

摘要

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这里描述的是使用人源化小鼠的肿瘤特异性T细胞的产生和表征。人胸腺组织和转基因的人类造血干细胞移植到免疫功能低下小鼠。这将导致在一个精心设计的人体免疫系统在体内的抗肿瘤免疫反应的检查允许的重组。

摘要

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如老鼠的小动物模型已被广泛用于研究人类疾病和开发新的治疗干预措施。尽管从这些研究中获得的大量信息，别具特色的种属特异性的病毒引起的疾病，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染小鼠免疫功能以及人性化的小鼠模型的发展。早期型号使用C. B 17 SCID / SCID小鼠体内移植的人胎胸腺，胎肝称为你的/ LIV（SCID-胡）1，2或过继的人外周血白细胞（SCID-huPBL ）3。这两种型号，主要用于HIV感染的研究。

这两种模式的主要限制之一是缺乏稳定的重建人体免疫细胞的外围，使他们更有关生理模型来研究HIV疾病。为此，BLT嗡嗡声anized小鼠模型的开发。 BLT代表骨髓/肝/胸腺。在这个模型中，6〜8周老NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ（NSG）免疫功能低下小鼠收到你的/ LIV植入的SCID-hu的小鼠模型，但随后第二次人类造血干细胞移植4。这个系统的优点是在外围人体免疫系统的完整的重组。这个模型已被用于研究艾滋病病毒感染者和潜伏期5-8。

我们已经产生了一个修改后的版本，这个模型中，我们使用转基因造血干细胞（HHSC）构建你 ​​的/ LIV植入的自体注射转HHSC的7,9。这种方法会导致产生的转基因谱系。更重要的是，我们适于此系统，以检查表达黑素瘤特异性T细胞受体的功能性细胞毒性T细胞（CTL）产生的电位。使用这个模型，我们能够评估我们的转基因CTL利用的现场正电子发射断层扫描（PET）成像，以确定肿瘤消退（9）的功能。

此协议的目的是描述的过程中，这些转基因小鼠，用活PET成像在体内的疗效和评估。作为一个说明，因为我们使用的人体组织和​​慢病毒载体，我们的设施符合C​​DC美国国立卫生研究院生物安全2级（BSL2）的指引，有特殊的预防措施（BSL2 +）。此外，核供应国集团的小鼠有严重免疫功能低下，因此，他们的住房和维护必须符合最高的健康的标准（ http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ）。

方案

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A.生成的BLT小鼠

代的BLT小鼠分为三（3）部分:（1）处理的CD34人类造血干细胞的胎儿组织和制备，（2）移植的人体组织，和（3）二次移植。对于所有的协议，我们已经提供了表1与试剂信息。

1。组织处理和CD34造血干细胞的分离

新鲜的胎儿组织快递的冰从各机关采购机构或组织都可以使用。胎儿组织通常是没有出息的，证明1000菌落每毫升血液琼脂周围介质的生产。我们经常在组织洗两次，在40毫升的无菌PBS中。虽然这并不能消除所有的细菌，它可以使一个区别，其中最屈从于细菌中的受体小鼠移植成功的系列和结果fection。作为一个附加的步骤，以进一步消毒的组织，培养细胞悬浮液中抗生素的存在。

1.1胎儿胸腺组织的处理

  1. 浇灭介质进入的漂白剂的烧杯中，并使用手术刀滑入漂白剂，以防止组织洗净胸腺。填充管，用PBS。盖上盖子，颠倒几次，洗胸腺。弃去上清液漂白剂。重复以上步骤。
  2. 将胸腺组织在8毫升的RPMI + 10％小牛血清，在60毫米的培养皿和剪切成1.5至2毫米的片具有两个解剖刀。剪切与手术刀，最大限度地减少撕裂和破坏的组织位。受损的组织会变得肿胀，发粘，难以绘制成的留置针。获得的比特的数量是第一上限时，对移植的小鼠。
  3. 暂停位与25毫升移液管（以....

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结果

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移植过程的流程图是在图1A中所示。 如图1B所示的图片，你的/ LIV植入的。胸腺组织发展通常并具有生理人类CD4 +和CD8 + T细胞的分布。经过重组，动物携带人体免疫系统的与正态分布的CD4，CD8 T细胞和其他免疫细胞谱系。

肿瘤大小和活组织之间的差异，是在图2中所示。虽然CT扫描（灰色区域）显示肿瘤的生长， 在体内 PET成像显示，这是大部分坏死和疤痕组织（ 图2）。这强调了实用的PET成像更敏感和准确的方法来评估肿瘤的回归和通关。

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讨论

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加上在体内的 PET成像BLT人性化的小鼠模型研究人类慢性疾病的有力工具。该系统以BLT小鼠模型及垫款超出限定范围为艾滋病研究。此外，它是一个伟大的系统中，我们可以研究各种基因治疗方案以及诊断技术，才可以达到临床上。后者成本低，再加上利用老鼠与灵长类动物，这是一个非常有用的模型。

PET成像技术使我们能够评估我们的方法的疗效。如果我们完全依赖于物理测量的肿瘤，我们会低估我们的转基因T细胞的抗肿瘤反应，生成的效力。广泛的疤痕及坏死组织了一个大肿瘤的外观，这在现实中是死的组织。

最后，该实用程序改性BLT小鼠米ODEL可以扩展到其他疾病模型。虽然仍然存在一些缺点，如小鼠的寿命较短，这可能是一个非常强大的工具在体内的许多方面进行评估人体免疫力，测试和开发新的治疗干预。

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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我们要感谢阿尔文·韦尔奇和拉里·庞的技术援助。这项工作是由部分由美国国立卫生研究院（NIH）奖P50 CA086306，加州再生医学研究所（CIRM）补助RC1-00149-1和RS1-00203-1 CIRM新进教师奖RN2-00902-1 ，加州理工学院，加州大学洛杉矶分校联合转化医学中心，加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR）NIH / NIAID AI028697，加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，CIRM工具和技术奖RT1-01126，和加州大学多校区研究计划和计划从加利福尼亚州中心抗病毒药物的发现（数量MRPI 143226）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
的试剂的名称 公司 目录编号 评论（可选）
PBS Invitrogen公司 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove氏 12440061
胎牛血清 16000085
胶原酶IV型 Sigma Aldrich公司 C5138
透明质酸酶 H3506
DNA酶I 罗氏诊断 10104159001
Piptazo（Zosyn） 辉瑞公司 哌拉西林/他唑巴坦组合
FICOLL（的Ficoll-Paque加） 通用电气医疗集团生命科学 17-1440-02
MACS缓冲美天旎生物技术查看评论 MACS缓冲液:PBS补充有0.5％胎牛血清和2mM柠檬酸葡萄糖式-A
CD34微珠试剂盒 130-046-702
LS列 130-042-401
Retronectin进行宝 T100A
基底膜 BD Biosciences公司 354263
异氟烷巴克斯特 http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
卡洛芬（Rimadyl） 辉瑞动物保健 https://www.rimadyl.com/default.aspx

参考文献

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  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A.

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标签

T PET NOD SCID Gamma TCR T

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