斑马鱼（Danio rerio）实验室的常规护理与维护：入门指南

摘要

本方案概述了斑马鱼养殖过程中为维持最佳条件所需的常规维护与护理措施。视频演示了系统维护、日常饲养、喂食、繁殖以及斑马鱼幼体培育的操作流程。

摘要

本方案描述了斑马鱼实验室的常规护理与维护。斑马鱼目前在遗传学、药理学和行为学研究中日益受到关注。作为一种脊椎动物，斑马鱼在基因序列上与人类具有高度相似性，正被用作多种人类疾病状态的动物模型。与其他常见的脊椎动物模型相比，斑马鱼具有繁殖力高、维护成本低、胚胎透明以及发育迅速等优势。由于斑马鱼研究兴趣的迅速增长，建立并维持一个高效的斑马鱼饲养设施的需求也在不断增加。尽管已有相关文献介绍斑马鱼实验室的维护，但尚缺乏简明的视频方案。本视频展示了斑马鱼常规饲养、喂食、繁殖及幼鱼培育的操作流程。该过程将帮助研究人员理解斑马鱼饲养中的自然行为和最佳条件，从而排查源于饲养条件的实验问题。本方案对于计划建立斑马鱼实验室的研究人员，以及打算将斑马鱼作为动物模型的研究生而言，具有极大的帮助。

方案

1. 系统维护

1. 斑马鱼饲养在循环水系统中，该系统持续过滤和充氧，以维持健康水生环境所需的水质。循环系统还有助于过滤多余的食物和鱼类排泄物。不同公司提供斑马鱼养殖系统，但本实验室使用的是美国 Aquatic Habitats 公司的系统。房间温度或水箱温度通常维持在 26–28.5 °C 之间，光照条件为 14:10 小时（光:暗）。一套 Aquatic Habitats 的斑马鱼系统（例如，台式系统）价格约为 9,000 美元。该台式系统具有两层搁架，每层可容纳六个 10 升、十二个 3 升或二十个 1.5 升的水箱。同一系统中也可同时饲养多种品系的鱼类（例如，转基因型、突变型、野生型）。
2. 系统中使用多种类型的过滤器。在本系统中，所有水箱的水在循环回水箱前，需依次经过 120 微米滤垫、50 微米筒式滤芯、生物过滤器、活性炭吸附滤芯和紫外线消毒滤芯。斑马鱼系统中使用脱氯/陈化水。水可通过静置至少 48 小时实现脱氯。在理想条件下，应将水储存在带有水泵的储水箱中，使水保持温暖并加速脱氯过程。
3. 应每日检测系统水的 pH 值，并维持在 6.8 至 7.5 之间。必要时，应使用碳酸氢钠提高 pH 值。
4. 鱼箱应定期清洁。清洁鱼箱时，先关闭该水箱的进水，将水箱向后倾斜以排干多余水分，然后小心地将水箱从系统中取出。水箱底部和侧壁上可见污垢和藻类生长。
5. 将挡板放入一个干净的水箱中，并加入脱氯水（又称系统水）。用鱼网小心地将鱼转移到该水箱中。盖上盖子，并转移水箱的标签。小心地将干净的水箱放回系统中，然后打开供水。
6. 为对鱼网进行去污处理，需喷洒 70% 乙醇，用水冲洗，晾干后方可再次使用。从脏水箱中取出挡板，并对挡板和水箱两部分均喷洒 70% 乙醇。用自来水彻底冲洗，并让水箱和挡板完全干燥后方可再次使用。
7. 循环系统的过滤器需定期检查并更换，以确保其正常运行。应定期更换这些过滤器，以保证向所有鱼箱提供清洁、充足的水源。
8. 120 微米滤垫通常每日重新调整位置或更换；在更换新滤垫前，应将其朝水流方向调整，以充分利用其过滤能力。
9. 筒式滤芯应每周更换一次。更换时，用扳手或徒手逆时针旋转取下滤芯单元。在下方铺设塑料布或毛巾，以防或吸收漏水。更换新的筒式滤芯后，将滤芯单元重新安装回系统中，必要时用手或扳手小心拧紧。
10. 活性炭滤芯应每两周更换一次（即每两星期一次）。更换时，用扳手小心拆下活性炭滤芯单元。丢弃使用过的活性炭，并更换为新的活性炭。重新安装活性炭支架，并将其放回滤芯单元中。将滤芯单元重新装回系统。开启系统，检查水流是否进入滤芯。必要时，在安装滤芯前，可让水流经管道以冲洗管道内的污物。
11. 生物过滤器应每六个月清洗一次。在循环系统中，生物过滤器通常位于筒式滤芯和活性炭滤芯之间。更换生物过滤器时，先将滤芯单元从系统中移除。通过按压泄压按钮释放滤芯内的压力。使用扳手拧开滤芯。此步骤通常需要两人配合操作。打开滤芯单元的盖子。将滤芯内容物倒入带筛网的容器中，以分离 siporax 与水。注：Siporax 是一种微孔生物过滤介质，具有同时进行硝化和反硝化的能力。
12. 若 siporax 污染严重，应更换为新的。用系统水（脱氯水）注满滤芯单元，盖上盖子，将滤芯单元放回系统，并打开供水。 注：在已适应的水族系统中，siporax 是多种硝化细菌的栖息地。这些微生物对维持水族箱内的氮循环至关重要。若完全移除生物过滤器的主要载体（即脏的 siporax），可能导致严重的氨浓度升高，随后在新的生物过滤器（含新 siporax）重建过程中出现亚硝酸盐浓度升高。氮循环的这两个中间阶段均可能对水生生物产生毒性，若未及时应对，可能导致斑马鱼死亡。因此，必须在斑马鱼饲养系统的其他位置设置次级生物过滤器（例如，Aquatic Habitats 系统中的集水箱），以便重要微生物能迅速在新的 siporax 上重新定植。
13. 紫外线滤芯用于控制系统的生物污染物（如细菌），应每九至十个月更换一次。需注意，紫外线滤芯在灯管寿命初期的消毒剂量率约为 110 mJ/cm²，随着时间推移，剂量率会逐渐下降，因此即使灯管外观仍能正常工作，也必须按时更换灯管。

2. 喂养

1. 斑马鱼可喂食干饲料（幼鱼饲料粒径为100微米，成鱼为300/400微米）或活体饲料（卤虫）。卤虫（Artemia sp.）卵可从当地宠物商店购买，并按照以下简单步骤在实验室中孵化。
   1. 将红海盐溶解于陈化水中，可将盛有盐的烧杯置于磁力搅拌器上以提高溶解度。或者，也可通过曝气管对水进行充气来溶解盐。若无红海盐，也可使用Instant Ocean盐作为孵化液。卤虫可耐受较宽范围的盐度；然而，我们通常将卤虫卵（10–15 g）孵化于30–35 g/L的红海盐水中。注意：若当地宠物商店不易获得卤虫卵，也可使用包囊卤虫，在加入孵化装置前分批进行“脱壳”处理。此方法还可避免频繁前往宠物商店采购。
   2. 用盐水注满卤虫孵化器，并以每升1.2汤匙的浓度加入卤虫卵。使用气泵对孵化器进行充分曝气，使卤虫卵孵化约48小时。
      注意：需注意未强化的卤虫在孵化后每小时都会损失营养成分。因此，为获得最大营养价值，建议选择在24小时内完成孵化，或在48小时内完成营养强化。
   3. 孵化系统产生的废水应排入检疫废物容器中，用漂白剂消毒后妥善处理。
2. 收集卤虫时，先移除气管，让培养液静置4–5分钟，但不得超过10分钟。孵化后的卤虫会聚集在孵化器底部。
   1. 使用孵化器底部的出水口收集卤虫。弃去初始流出的液体，其中含有未孵化的卤虫卵。
   2. 弃去未孵化的卤虫卵后，收集已孵化的卤虫，用于喂养斑马鱼。
   3. 使用卤虫收集网（约350微米尼龙网孔）将卤虫与盐水分离。用系统用水将网中的卤虫冲洗至容器中。
3. 收集后的卤虫通常以高浓度聚集在容器底部，呈现明显的橙色。
4. 使用移液器或滴管/挤压瓶将卤虫喂给斑马鱼。投喂量应根据各鱼缸中鱼类的数量而定。斑马鱼的一般公认投喂比例为每日摄食量达到其体重的4%。切勿过度投喂，否则可能导致水中硝酸盐水平升高，影响其繁殖能力或存活率，部分鱼类可能因暴食而死亡。
   1. 将饲料投入水中后，饥饿的鱼会游动捕食卤虫。
5. 干饲料投喂可使用Aquatic Eco-Systems/Aquatic Habitats公司生产的基于弹簧的简易鱼类喂食器。或者，也可使用普通勺子，或用剪刀将塑料滴管斜向剪开，使其形成小勺状进行投喂。

3. 繁殖

1. 斑马鱼在光照开始时启动繁殖。受精卵可通过鱼缸内繁殖或配对繁殖获得。尽管在本实验室中，鱼缸内繁殖更节省人力，常用于常规胚胎收集，但在需要对个体鱼的基因或突变进行筛选时，优先采用配对繁殖。
2. 进行鱼缸内繁殖时，应在光照开始后将鱼缸繁殖装置组装好并缓慢放入鱼缸中。或者，也可在前一晚将鱼缸繁殖装置预先放置于鱼缸内。
3. 让鱼缸繁殖装置在鱼缸中停留约15分钟，使鱼类完成交配，随后将装置从鱼缸中取出并收集卵子。
4. 配对繁殖通常在下午晚些时候喂食后设置。
5. 组装繁殖用鱼缸并用陈化过的系统水注满。
6. 将一条雌鱼和一条雄鱼分别转移到繁殖鱼缸的两侧。雌鱼因腹部较大而易于与雄鱼区分；雄鱼则体型更纤细、体色更深，且其臀鳍的黄色比雌鱼更明显（见图1）。若不确定，可观察斑马鱼雌鱼的产卵管（见图4）。
7. 次日清晨光照开始后不久移除隔板。让交配过程不受干扰地持续20分钟，或直至鱼缸底部产出足够数量的胚胎。
8. 繁殖结束后，将鱼放回原鱼缸，并用滤网收集卵子。
9. 用系统水充分清洗胚胎。
10. 用胚胎培养基（又称EM3：NaCl 13.7 mM；KCl 0.54 mM；MgSO₄ 1.0 mM；CaCl₂ 1.3 mM；Na₂HPO₄ 0.025 mM；KH₂PO₄ 0.044 mM；NaHCO₃ 4.2 mM）冲洗滤网，将胚胎转移至培养皿中。
11. 可在显微镜下观察胚胎，并使用针头和移液器将受精卵与未受精卵分离（见图3）。

4. 幼虫培育

1. 受精卵在孵化箱中（约28.5 °C）培养72小时，直至幼体孵化。
2. 现在幼鱼已脱离卵膜并能自由游动，可以转移到主养鱼缸中。幼鱼从受精后第5天（dpf）开始需要喂食，并可继续保留在胚胎培养液（成分见第3部分，10）或系统养殖用水中。幼鱼可饲养在圆形培养皿中，每天更换约50%或更多的水。换水过程中应清除死亡或患病的幼鱼以及其他碎屑。
3. 将幼虫轻轻转移至含有小型挡板（约300-400微米）的水箱中。应去除死亡和患病的幼虫，并每天缓慢添加数毫升水。
4. 14天后，可将幼虫养殖箱放入系统中，并供应少量循环水（每秒1-2滴）。随着幼虫的生长，可逐渐增加水流速度。可根据幼虫的大小选用不同规格的挡板（例如 挡板尺寸应为300-400、500、700-750和1000微米，并且成年鱼应使用普通塑料挡板。
5. 胚胎通常需要3个月时间发育为性成熟的成体。

结果

与传统啮齿类动物模型相比，斑马鱼的饲养和维护更加简便且成本更低。数千条斑马鱼可在小型实验室中进行饲养。通过本方案，研究人员将能够管理斑马鱼养殖设施，为斑马鱼提供健康的生长环境。此外，以下图示将有助于识别受精卵、成年斑马鱼及其食物。图示展示了雄性斑马鱼（图1A）和雌性斑马鱼（图1B 和 1C），以帮助研究人员在繁殖过程中区分雌雄个体。图2展示了显微镜下的图像：12倍放大下的卤虫（图2A）、90倍放大下的单个卤虫（图2B）以及90倍放大下的未受精卤虫卵（图2C）。这些图像有助于理解未受精与受精卤虫之间的差异，从而实现科学喂养。受精卵与未受精卵的对比见于图3。图3A展示了受精和未受精胚胎的显微图像。未受精胚胎通常呈不透明状和/或卵膜内细胞破裂（黑箭头所示），而受精胚胎则形态完整，并持续发育进入下一次细胞分裂阶段（有关斑马鱼胚胎各发育阶段的详细描述参见文献¹）。受精卵和未受精卵的高倍放大图像分别显示于图3B 和 3C。图4展示了雌性斑马鱼的产卵器，以帮助研究人员区分雌雄个体。

斑马鱼实验室中可能出现的几个关键问题包括养殖系统中单个或所有水箱的供水堵塞、水质不佳以及循环系统的管道或储水罐发生泄漏。此外，繁殖过程中无法获得胚胎也可能是另一个需要关注的问题。以下将讨论这些问题的故障排除方法。

图1. 雄性斑马鱼（A）与雌性斑马鱼（B，C）的示意图。

图 2. 盐水虾在 12X 下的显微图像（A），单个盐水虾在 90X 下的显微图像（B），以及未受精盐水虾卵在 90X 下的显微图像（C）。

图3. 受精卵与未受精卵的显微图像（16X），其中仅有两个为未受精卵，未受精卵以黑色箭头标示（A）。受精卵（B）和未受精卵（C）的高倍放大图像（90X）。

图 4. 雌性斑马鱼产卵器（以黑色箭头指示）示意图。

参数	最佳范围
碱度	50-150 mg/L CaCO3
pH	6.8-7.5 (耐受范围 6.0-8.5)
温度	26-28.5 °C
硬度	50-100 mg/L CaCO3
非离子化氨	<0.02 mg/L
硝酸盐 (NO3-)	<50 mg/L
亚硝酸盐 (NO2-)	<0.1 mg/L
溶解氧	>6.0 mg/L
盐度	0.5-1 g/L
电导率	300 -1,500 μS

表2. 水质参数。 水质参数。斑马鱼养殖水族箱中环境参数的最适范围¹¹。

讨论

斑马鱼源自印度北部的恒河，在科研中其成体和幼体阶段均日益受到关注，Spence 等³对此已有综述²。斑马鱼相较于其他动物模型具有多项优势，包括繁殖力高、易于饲养、胚胎透明、胚胎发育迅速以及维护成本低。它们适用于遗传操作⁶，并可用于高通量药物筛选^4,5。其体外受精的特性有利于发育生物学研究。由于这些优良特性，斑马鱼在遗传学⁷、药理学⁸和行为学研究^9,10中正越来越受欢迎。然而，维持斑马鱼养殖设施并获取胚胎仍面临诸多挑战。本文中，我们总结了应对这些挑战的经验与建议，并概述了一套系统维护、喂养、繁殖及幼体培育的操作方案。

系统维护

为了保持斑马鱼的健康状态，必须为其提供清洁的环境和正常运行的水族系统。其中重要的一环是定期更换系统滤芯，以确保所有鱼缸都能获得适当的水流和洁净的水体。必须避免因管道堵塞导致循环水供应中断。如果发生堵塞，可通过高于正常水平的水压和水流来清洗管道。理想情况下，每天应更换系统总水量的约10%，以维持良好的水质。或者，可在更换筒式滤芯或活性炭滤芯的同时进行换水，以清除沉积在连接这些滤芯的管道中的污物。水质应定期检测，碱度、pH值、温度、硬度、氨、溶解氧、盐度和电导率等参数是反映系统水质的重要指标（详见表2）。至少应定期监测硝酸盐、pH值和温度，以确保斑马鱼饲养环境的水质良好。理想的硝酸盐（NO^3-）浓度应<50 mg/L¹¹；若浓度过高，可通过用新鲜系统水替换循环系统中的水来降低。有时滤芯安装不严密会导致泄漏，因此建议在更换滤芯后检查是否存在泄漏。如果在更换水泵或滤芯后，主储水罐的水流受阻，可通过短暂松开或移除滤芯几秒钟，以释放管道中产生的负压，从而恢复水流。更换滤芯所需的时间可能因多种因素而异，例如系统的总生物负荷、其他滤芯的清洁程度以及管道中沉积的污物量。因此，一旦发现滤芯明显脏污，或所有鱼缸未能获得正常供水，应立即更换滤芯。还建议使用70%乙醇清洗鱼网，并用水冲洗以去污，之后晾干再重复使用。晾干可确保乙醇完全挥发，避免残留乙醇对鱼类产生毒性。

大多数斑马鱼养殖系统使用脱氯的自来水；然而，一些系统使用去离子水。保持系统水的电导率在300至约1,500 μS之间非常重要，因为这可以减少鱼类维持体内盐分所需的能量。因此，除非添加盐类以维持最佳电导率水平，斑马鱼不能饲养在去离子水中。如果使用自来水，系统水中可能存在铜浓度过高的风险，因为碳过滤器无法去除铜。因此，使用者应检测水中铜的浓度，并尽可能避免使用铜管。

喂养

饲养斑马鱼时切勿过度喂食，因为这可能会增加水中硝酸盐含量，进而影响其繁殖能力¹¹或存活率，部分斑马鱼可能因进食过量而死亡。建议每次投喂的饲料量不应超过一缸鱼在10分钟内能够摄食完毕的量。在将丰年虾投喂给斑马鱼之前，必须彻底去除其中的盐分，因为过高的盐浓度会导致斑马鱼死亡。若需要获得更多斑马鱼卵，可将喂食频率增加至每天三次。每天清洁繁殖用斑马鱼饲养缸也有助于提高产卵量。

在喂食水生栖息地系统时，我们通常会关闭水泵和气泵，使鱼类有10分钟时间进食。这样可以减少食物被冲入过滤器的量。然而，使用者必须注意，之后务必记得重新开启这些泵。

繁殖

斑马鱼通常在约3至18个月龄之间处于最佳繁殖状态。成对繁殖不应连续两天进行¹¹；然而，可以在同一水族箱中每天进行群体繁殖，因为一个水族箱可容纳多条鱼，从而降低了同一对鱼连续两天交配的可能性。即使不需要鱼卵，也应定期进行繁殖操作，以维持斑马鱼的繁殖周期。建议在繁殖组合中雌鱼数量多于雄鱼。雄性斑马鱼每天会更换雌性配偶¹²，这进一步支持了该建议。此外，我们实验室最初曾遇到繁殖困难的问题，但通过在繁殖组合中使用更多的雌鱼，成功解决了这一问题。另外，每天喂食两到三次高蛋白饲料和丰年虾、混合来自不同水族箱（不同亲本）的鱼、将繁殖环境的温度维持在27至28 °C之间，以及通过轻柔按摩挤压卵巢管阻塞的雌鱼腹部，均可进一步提高产卵量。建议记录鱼系/来源信息，以避免兄弟姐妹之间的近亲繁殖，这也有助于提高胚胎产量。同时建议记录每个水族箱中鱼类所产胚胎的数量，以便追踪最佳繁殖水族箱，并对不产卵或产卵量低的鱼类采取措施改善其繁殖性能。

幼虫培育

应从受精后第5天（dpf）开始喂养幼鱼。早期幼鱼可投喂约100微米大小的干饲料（例如，ZM100），或草履虫、轮虫等活体饲料（可促进生长）。饲料粒径可逐渐增加至200微米（例如 ZM200）或300/400微米（例如 ZM300）。成年鱼的饲养密度建议为每升水体6–7尾。该密度有助于更好地维持水体生化需氧量（BOD）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斑马鱼循环系统	Aquatic Habitats，美国	AHAB 独立式台面系统
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6297
鱼食分配器/干饲料喂食器	Aquatic Habitats，美国	AH19
显微镜	Olympus	SZX12
干燥食物	ZM 鱼食，英国	ZM100, ZM200, ZM300
卤虫卵	Salt Creek, Inc., USA	优质级
缸内繁殖装置	Aquatic Habitats，美国	ITSTS-A
活性炭	Penn-Plax Pro-crab，美国	PBC3MF
繁殖用鱼缸	Aquatic Habitats，美国	SBTANK（1 L） 亲鱼繁育缸-2（2L）
红海盐	Red sea盐，美国	当地宠物商店/ www.redseafish.com
过滤器（筒式过滤器、滤棉垫和紫外灯）	Aquatic Habitats，美国	aquatichabitats.com
Siporax 媒介物	Aquatic Habitats，美国	BF 820
卤虫网	Aquatic Habitats，美国	BSN 1
卤虫孵化器	Aquatic Habitats，美国	BS252
挡板	Aquatic Habitats，美国	aquatichabitats.com
表1. 本方案所用特定试剂与设备列表