内向整流钾通道的小分子调节剂的高通量筛选

Summary

开发和验证测量活动的高通量化合物筛选的内向整流钾通道（基里巴斯）荧光定量检测方法。

Abstract

具体内向整流钾通道（基里巴斯）家庭成员的各种疾病，包括高血压，房颤，疼痛^1,2推测的药物靶标。然而，在大多数情况下，对理解他们的治疗潜力甚至连最基本的生理功能方面取得的进展已经放缓缺乏良好的药理工具。事实上，分 ​​子药理学的内向整流家庭的已经远远落后的S4家族的电压门控钾通道（KV），其中一些已发现的的纳摩尔亲和力和高度选择性的肽毒素调节^3。蜂毒的毒素tertiapin和其衍生物是有效的抑制剂的Kir1.1的Kir3通道^4,5，但肽是使用有限的治疗以及实验由于它们的抗原特性和生物利用度差，代谢稳定性和组织外显率。强效的发展改进的药理特性和选择性的小分子探针将是一个关键Kir通道的生理和治疗潜力的充分认识。

分子库探针生产中心网（MLPCN）的支持由美国国立卫生研究院（NIH）共同基金创造了机会学术界的科学家开始探测发现运动的分子靶点和信号转导通路需要更好的药理学^6。 MLPCN提供研究获得行业规模筛选中心，药物化学和信息支持开发小分子探针，以阐明基因和基因网络的功能。关键的一步在进入到MLPCN是一个强大的目标或途径的具体分析，是适合高通量筛选（HTS）的发展。

在这里，我们介绍了如何开发基于荧光的铊（TL ^+）通量阿萨y的高通量化合物筛选^7,8,9,10珥通道功能。该测定是基于的通透性上的K ⁺通道孔的K ⁺同源物铊^+。市售的荧光铊⁺报告染料是用来检测通过孔隙的Tl ⁺跨膜通量。有至少三个市售染料适合铊⁺磁通检测^{:BTC，FluoZin-2，7,8} FluxOR。该协议描述试验发展，使用FluoZin-2。虽然最初开发和销售锌指标，FluoZin-2是一个强大的和剂量依赖性增加，荧光发射后，TL ⁺结合。我们开始工作前与FluoZin-2 FluxOR是^7,8，并继续这样做^9,10。然而，分析发展中的步骤基本上是相同的所有三种染料，用户应确定染料是最适合其特定的N电火工品。我们还讨论了检测的性能基准测试，必须达到被认为是进入到MLPCN的。由于铊⁺容易渗透K ⁺通道，该法应适用于K ⁺通道的目标。

Protocol

1。生成稳定的多克隆细胞系

1. 高品质的稳定表达细胞系感兴趣的KIR通道的建立，是一个发展一个强大的高通量筛选分析的重要的第一步。构K ⁺通道的过度表达可导致细胞死亡的途径，稳定的细胞系的检测性能的变性和损失的激活。为了避免这些潜在的问题，并提供了一种方便的内部控制，研发分析（见下文），四环素诱导表达系统建议^8。
2. 文化的父母T-REX-HEK293细胞用标准技术在B-培养基（DMEM生长培养基中含有10％FBS，50 U / ml的青霉素，50微克/毫升链霉素和5微克/毫升杀稻瘟菌素小号）。使用早期传代细胞（ 如 3-4个通道，因为从液氮存储解冻），转染和稳定的克隆选择。
3. 铠甲4万T-REX-HEK293细胞中75cm ^2的烧瓶中，使烧瓶中的约80％汇合翌日。培养过夜，在5％CO ₂培养箱中，在37℃下
4. 根据生产商的方案，使用10-15微克pcDNA5/TO-Kir DNA与Lipofectamine LTX / Plus试剂转染细胞。 5小时后，更换转染培养基与B介质。
5. 在转染24小时后，与乙介质含有250微克/毫升潮霉素（BH-培养基），以开始稳定的克隆选择替换B介质。饲料的细胞每2-3天用新鲜的BH介质。
6. 大于90％的细胞死亡在未来7天里，留下一小部分的稳定转染细胞。允许殖民地成长为拆分前的10-14天，至175厘米<....

Results

四环素诱导表达系统的使用提供了一个方便的内部控制，用于区分铊⁺通量通过内源性途径和珥感兴趣通道的图1示出了一些实施例的不同类型的实验中使用的细胞接种地图。含有未诱导或四环素诱导的细胞的孔的位置用不同的颜色表示图2A显示了使用，以确定最佳的铊⁺浓度的检测开发和筛选化合物的源板图。渐变的颜色表示的3倍稀释系列，范围从100％到0.002％铊^+。有代表性的荧光强度图如图2B所示，冷到热的颜色⁺流量值，分别表示由低到高的铊。 图1C中所示的地图镀的细胞被用于这个实验。一件合身的四参数的逻辑功能为t他铊⁺ CRC（ 图2C）是用来确定的EC ₈₀值的15％铊⁺ 图3A示出的源板图，用于确定一个试验中的DMSO的公差。列1和24只包含测定缓冲液中，而渐变的颜色表示的2 - 倍稀释系列，范围从10.......

Discussion

数据处理:一旦数据被收集，在分析中的一个共同的步骤涉及到的各孔的荧光响应到其初始值，在开始的实验中，F _0，F，正常化。这通常被称为"静态比"和符号"F / F ^_0"。静态比操作将在F _0的情况下，主要是由指示剂染料基本上纠正许多因素，如照明，信号采集disuniformities，和细胞数。染料信号弱的情况下，或在系统中的的背景荧光或反射高，静态的比例将不生效，除非在后台可以计算静态比之前得到适当处理。数据归一化后，它是典型的，以减少到一个单一的值，该值将被用于量化活性和挑命中荧光波形。最常见的，这将通过拟合数据完成点在10秒以下，此外的Tl ⁺诱发的荧光增加，得到的初始斜率。对于命中采摘，一个流行的做法是，在测试中人口绝大多数的化合物处于非活动状态（零假设是力）。计算平均值和标准偏差的测试人口和命中的选择，三个标准差来表示。

议定书分割为长的化合物孵育:为了检测珥通道抑制剂，特别是那些作为在细胞内的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录号	评论
pcDNA5/TO	Invitrogen公司	V1033-20	四环素诱导表达载体
T-REX-HEK293细胞	Invitrogen公司	R71007	四环素诱导的细胞系
脂质体LTX /加试剂	Invitrogen公司	15338100	转染试剂
FBS	亚特兰大生物	S11550	细胞培养基
DMEM	Invitrogen公司	11965	细胞培养基
潮霉素B	Invitrogen公司	10687-010	细胞培养基
杀稻瘟小号	Invitrogen公司	R210-01	细胞培养基
青霉素/链霉素	Invitrogen公司	15140	细胞培养基
HBSS价免费	敏达	21022CV	细胞洗涤
胰蛋白酶-0.25％	敏达	25053CI	细胞分离
四环素盐酸	西格玛	T9823	感应试剂
透析FBS	亚特兰大生物	S12650	电镀媒体
FluoZin-2	Invitrogen公司	F24189	荧光染料
聚醚F-127	Invitrogen公司	P-3000MP	染料吸附量
HBSS	Invitrogen公司	14175	分析缓冲液
HEPES	Invitrogen公司	15630	分析缓冲液
碳酸氢钠	西格玛	S6297	TL +刺激缓冲
硫酸镁	西格玛	M2643	TL +刺激缓冲
硫酸钙4·2H 2 O	西格玛	C3771	TL +刺激缓冲
D-葡萄糖	西格玛	G7528	TL +刺激缓冲
硫酸铊	Aldrich公司	204625	TL +刺激缓冲
HEPES	西格玛	H4034	TL +刺激缓冲
DMSO	西格玛	D4540	溶剂
八通道电子移液器	百得	E300	在384细胞电镀 -孔板
BD PureCoat胺涂层的384孔板	BD Biosciences公司	356719	检测微孔板
回声合格384孔微孔板聚丙烯（384PP）	Labcyte公司	P-05525	复合源微孔板
384孔聚丙烯微孔板	格雷纳生物之一	781280
多点COMBI试剂分配器	Thermo Scientific的	5840300
ELx405洗板机	百特	ELx405HT	自动细胞清洗
回声液体处理	Labcyte公司	Labcyte公司回声550
Bravo自动化液体处理平台	安捷伦科技公司	标准模型
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