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方法文章

高通量筛选内向整流钾通道的小分子调节剂

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DOI：

10.3791/4209

⸱

2013年1月27日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

本文内容

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摘要

本文介绍了用于建立和验证定量荧光检测方法以测量内向整流钾（Kir）通道活性，进而用于高通量化合物筛选的技术方案。

摘要

内向整流钾（Kir）通道家族的特定成员被认为是多种疾病的潜在药物靶点，包括高血压、心房颤动和疼痛1,2。然而，由于缺乏良好的药理学工具，目前在理解其治疗潜力甚至基本生理功能方面的进展较为缓慢。事实上，与电压门控钾（Kv）通道S4超家族相比，内向整流通道家族的分子药理学研究远远落后；对于Kv通道，已发现多种具有纳摩尔亲和力且高度选择性的肽类毒素调节剂3。蜜蜂毒液毒素tertiapin及其衍生物是Kir1.1和Kir3通道的有效抑制剂4,5，但由于肽类具有抗原性以及生物利用度低、代谢稳定性差和组织穿透能力弱等缺点，其在治疗和实验应用中均受到限制。因此，开发具有优良药理学特性的高效且选择性的小分子探针，将是全面理解Kir通道生理功能及其治疗潜力的关键。

美国国立卫生研究院（NIH）共同基金支持的分子文库探针生产中心网络（MLPCN）为学术界科学家提供了开展探针发现研究的机会，以针对药理学研究尚不充分的分子靶点和信号通路进行探索6。MLPCN为研究人员提供进入工业级筛选中心的渠道，并提供药物化学和信息学支持，以开发小分子探针，阐明基因及其基因网络的功能。进入MLPCN的关键步骤是建立一种稳定、特异的靶点或通路特异性检测方法，该方法需适用于高通量筛选（HTS）。

在此，我们介绍如何建立一种基于荧光的铊（Tl+用于高通量化合物筛选的Kir通道功能通量测定7,8,9,10该检测基于K的通透性+ 通道孔至K+ 同系物 Tl+一种市售的荧光Tl+ 报告染料用于检测铊离子（Tl⁺）的跨膜通量+ 通过孔道。目前至少有三种市售染料适用于Tl+ 通量检测：BTC、FluoZin-2 和 FluxOR7,8本方案描述了使用FluoZin-2进行检测方法的开发。尽管FluoZin-2最初被开发并作为锌离子指示剂销售，但在Tl⁺存在时，其荧光发射也表现出显著且剂量依赖性的增强。+ 结合。在FluxOR问世之前，我们就开始使用FluoZin-27,8 并持续如此9,10然而，三种染料的检测方法开发步骤基本相同，用户应根据自身具体需求确定最适合的染料。我们还讨论了该检测方法必须达到的性能基准，方可被考虑纳入MLPCN。由于Tl+ 可轻松穿透大多数 K+ 通道，该检测方法应适用于大多数 K+ 通道靶点

方案

1. 稳定多克隆细胞系的构建

  1. 建立稳定、高质量表达目标Kir通道的细胞系，是开发稳健高通量筛选实验的重要第一步。持续性K+通道过表达可能导致细胞死亡通路激活、稳定细胞系退化以及实验性能下降。为避免这些潜在问题，并为实验开发提供方便的内部对照（见下文），建议采用四环素诱导表达系统8。
  2. 使用B培养基（含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素和5 μg/ml杀稻瘟菌素S的DMEM生长培养基），按照标准技术培养亲本T-REx-HEK293细胞。转染及稳定克隆筛选时应使用早期代次细胞（例如，自液氮保存复苏后3-4代）。
  3. 在75 cm2培养瓶中接种400万个T-REx-HEK293细胞，使次日细胞融合度约为80%。在37 °C、5% CO2培养箱中培养过夜。
  4. 按照生产商说明书，使用10–15 μg pcDNA5/TO-Kir质粒DNA与Lipofectamine LTX/Plus试剂进行转染。转染5小时后，更换为B培养基。
  5. 转染24小时后，将B培养基更换为含250 μg/ml潮霉素的B培养基（BH培养基），开始进行稳定克隆筛选。每隔2–3天用新鲜BH培养基更换培养液。
  6. 在接下来的7天内，超过90%的细胞应死亡，仅留下少数稳定转染的细胞克隆。待克隆继续生长10–14天后，传代至175 cm2培养瓶中扩大培养。
  7. 冻存时，将3 × 106个细胞/ml悬浮于含45%预 conditioned BH培养基、45%不含抗生素但含血清的DMEM以及10% DMSO的冻存液中。将细胞置于细胞冻存盒中，在-80 °C过夜冷冻，随后转移至液氮中长期保存。复苏时采用Invitrogen推荐的程序从液氮中解冻细胞。需注意，若细胞在处理时培养瓶融合度超过75%，其冻存后存活率将降低。

2. 稳定单克隆细胞系的建立

  1. 洗涤一个亚融合的75 cm²培养瓶2 含有稳定多克隆细胞的培养瓶用无二价阳离子的HBSS洗涤。加入1 ml胰蛋白酶，于5% CO₂培养箱中孵育3-5分钟。2 37 °C 培养箱中孵育。向培养瓶中加入 5 ml BH 培养基以抑制胰蛋白酶活性，并反复吹打混匀（例如，重复5次）以充分解离细胞。在显微镜下仔细检查细胞，确保悬液几乎完全由单细胞组成。这将提高获得单克隆细胞系的可能性。
  2. 确定细胞密度，并将细胞悬液稀释至每20 μl含0.7个细胞。使用多通道移液器，将20 μl细胞悬液加入BD PureCoat氨基包被（或等效的聚-D-赖氨酸包被）384孔板的每个孔中。理论上，在此接种条件下，约70%的孔将含有单个细胞。因此，每块384孔板应获得超过200个克隆用于分析。将细胞继续在5% CO₂培养箱中培养2 37 °C 培养箱
  3. 一周后，在显微镜下检查培养板，观察含有单个菌落的孔。用永久性记号笔在板盖上标记其位置，以备后续参考。同时注意识别并排除含有多个菌落的孔，这些孔通常表现为菌落从孔的多个边缘生长而出，较易辨认。需注意，靠近培养板边缘的孔更容易发生蒸发。若观察到明显蒸发的孔，应补充BH培养基。除此之外，无需额外换液或喂养细胞。
  4. 在接下来的7到10天内更频繁地观察培养孔。当目标孔的细胞融合度至少达到50%时，即可进行传代。
  5. 将细胞分至384孔板，每孔一式三份；其中一块板用于Tl检测+ 流速，并用于继续培养单克隆细胞系。吸除含有目标细胞系的孔中的培养基，用无二价离子的HBSS洗涤细胞，每孔加入20 μl胰蛋白酶，将培养板转移至37 °C培养箱中孵育15–20分钟。将培养板移回细胞培养操作台后，每孔加入20 μl BH培养基，反复吹打数次以充分解离细胞。在显微镜下观察各孔，确认细胞已完全解离；由于细胞贴壁较紧，可能需要多次吹打。待细胞解离后，将每种细胞悬液取10 μl转移至新的BD PureCoat胺涂层384孔板的两个重复孔中。务必记录源孔与对应重复孔之间的位置关系，以便后续可将表现出强健Kir通道活性（见下文）的克隆追溯至原始孔。向原始孔中加入20 μl BH培养基，以滋养残留细胞，并在5% CO₂条件下继续培养2 37 °C 培养箱中孵育。
  6. 让目的培养板中的细胞贴壁并生长至多一周时间。当大部分克隆的汇合度达到至少50%时，可使用Tl检测Kir通道活性+ 如下所述的通量测定。
  7. 实验前一天，吸除培养基，更换为含10%透析胎牛血清（FBS）的BH培养基。此举可防止因四环素污染血清导致的非预期通道表达。对于每个克隆的两份平行孔，仅在其中一份中加入1 μg/ml四环素以诱导Kir通道表达，另一份未诱导的平行孔作为“背景”对照。进行Tl++ 如下所述的通量测定实验。

3. 通用 Tl+ 流检测实验步骤

  1. 在进行 Tl+ 转运实验的前一天，按照第 2.1 和 2.2 节所述方法解离细胞，并定量细胞悬液的密度。使用 Thermo Multidrop Combi 或多通道移液器，将 20,000 个稳定转染了目标 Kir 通道基因的单克隆细胞接种至 BD PureCoat 胺涂层 384 孔板的每孔中。接种时使用含 10% 透析胎牛血清（FBS）的 BH 培养基。注意，部分细胞需在含 1 μg/ml 四环素的培养基中过夜培养以诱导 Kir 通道表达，而另一些则不加诱导剂。诱导与非诱导细胞在不同实验类型中的位置有所不同，详见图 1。
  2. 次日，在显微镜下检查培养板，确保细胞已贴壁并均匀分布在孔底。各孔细胞融合度应达到 80–90%。
  3. 使用 ELx405 微孔板洗涤仪将细胞培养基更换为每孔 20 μl 的 HBSS 检测缓冲液，该缓冲液含 20 mM HEPES，并用 NaOH 调节至 pH 7.3。也可采用“倾倒拍击”法：将板倒置后迅速向下拍击，使培养基弹入废液容器，随后轻拍于叠放的纸巾上以去除残留液体。立即向板中重新加入 HBSS 检测缓冲液，防止细胞干燥。
  4. 配制 FluoZin-2, AM 染料负载溶液。先短暂离心试剂管，然后将 50 μg FluoZin-2 粉末溶解于 100 μl 无水 DMSO 中。此时可将 1,000 倍储备液分装后于 -20 °C 保存以备后续使用。使用前，向染料中加入 50 μl 20%（质量/体积）Pluronic F-127/DMSO 溶液，并轻轻吹打混匀。一旦加入 Pluronic F-127 后，切勿冷冻染料溶液，因低温可能导致表面活性剂析出。将 150 μl FluoZin-2, AM/Pluronic F-127 混合液加入 100 ml HBSS 检测缓冲液中，轻轻混匀制成染料负载缓冲液。使用 Multidrop Combi 或多通道移液器，向每孔（已含 20 μl HBSS 检测缓冲液）加入 20 μl 染料负载缓冲液。室温避光孵育约 1 小时（通常建议避光孵育，尽管尚无直接证据表明其必要性）。
  5. 在细胞负载染料的同时，准备 Tl+ 刺激板。将 0.5 g 碳酸氢钠新鲜溶解于 50 ml 的 5 倍浓度 Tl+ 刺激缓冲液中，该缓冲液含 1 mM 硫酸镁、1.8 mM 硫酸钙、5 mM 葡萄糖、10 mM HEPES 和 12 mM 硫酸铊（Tl+）。若需将溶液 pH 控制在极窄范围内或担心二氧化碳逸失，可用葡萄糖酸钠替代碳酸氢钠。盖紧管盖以减少二氧化碳挥发，反复倒置混匀直至碳酸氢钠完全溶解。使用多通道移液器向聚丙烯材质的 384 孔板每孔加入 50 μl 上述溶液（表 1）。
  6. 细胞完成 FluoZin-2, AM 负载后，使用 ELx405 微孔板洗涤仪或如上文第 3.3 节所述的“倾倒拍击”法清洗培养板。根据所进行的 Tl+ 转运实验类型，向每孔重新加入 20 μl 或 40 μl HBSS 检测缓冲液。此时，培养板已准备好用于实验。
  7. 将细胞板和 Tl+ 刺激板放入 Hamamatsu 功能性药物筛选系统（FDSS）或具备整合液体分配功能的等效动力学成像微孔板读板仪中。使用适用于荧光素或基于荧光素的染料（如 Fluo-4）的适当滤光片。
  8. 设置单次加样程序，使 5 倍浓度的 Tl+ 溶液 10 μl 加入含 40 μl HBSS 检测缓冲液的细胞板对应孔中。以 1 Hz 的采样频率记录至少 10 秒的基础荧光信号。当细胞接种、洗涤及染料负载条件达到最优时，板内各孔间的荧光信号应均匀且稳定。使用集成的 384 通道移液器可实现向各孔同步添加 Tl+ 刺激缓冲液。
  9. 记录至少 2 分钟，以便完整捕获 Tl+ 引起的荧光上升速率与峰值，用于后续离线分析。

4. 确定最佳 Tl+ 浓度

  1. Tl+ 可轻易穿过大多数内向整流性 K+ 通道。为确保 Tl+ 浓度不超过 Tl+ 荧光探针染料 FluoZin-2 的动态检测范围，应通过实验确定在高通量筛选中使用的最佳 Tl+ 浓度。我们建议采用在通道被最大程度激活的条件下可引发最大荧光反应 80% 的 Tl+ 浓度（EC80）。
  2. 按照第 3 节所述方法，将细胞接种于 BD PureCoat 胺涂层或等效的多聚-D-赖氨酸涂层 384 孔板中，进行染料负载和洗涤，并在每孔中保留 40 μl HBSS 检测缓冲液。如 图 1A 所示，第 1 列以及 A1–A23 行应包含未用四环素诱导的细胞，因此不表达目标 Kir 通道。未诱导孔中的 FluoZin-2 荧光信号将用于评估通过内源性通路（如 Na+-K+-ATP 酶泵和电压门控 K+ 通道）介导的 Tl+ 流，这些通路在 HEK-293 细胞中通常正常表达。
  3. 使用安捷伦 Bravo 自动液体处理平台或手动移液，在 HBSS 检测缓冲液中配制十一浓度点的 Tl+ 梯度稀释系列。通常在实验中评估从 100% 到 0.002% 的 3 倍系列稀释 Tl+ 浓度。该稀释系列应配制成 5 倍浓度，因为在最终检测中 Tl+ 溶液将以 1:5 比例稀释。通过将第 3 节所述的标准 5x Tl+ 缓冲液与含有 1 mM 硫酸镁、1.8 mM 硫酸钙、5 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES 的 5x 无 Tl+ 缓冲液进行稀释来制备该系列。再次强调，应在接种前立即向最终 Tl+ 缓冲液 50 ml 中新鲜溶解 0.5 g 碳酸氢钠，并按照 图 2A 所示的板图将其加入聚丙烯 384 孔板中。
  4. 将细胞板和 Tl+ 刺激板装入 FDSS 仪器中。设置单次加样程序，使 10 μl 的 5x Tl+ 稀释系列加入含有 40 μl HBSS 检测缓冲液的细胞板对应孔中。在向板中加入 Tl+ 前，记录 10 秒的 FluoZin-2 荧光基线信号。在 3 个独立的实验日重复实验，以验证结果的可重复性。

5. 测定 DMSO 对检测的敏感性

  1. 在高通量筛选中检测的小分子通常溶解于有机溶剂二甲基亚砜（DMSO）中，而DMSO本身可能影响检测体系的性能。因此，必须首先评估该检测方法对DMSO的敏感性，以确定筛选中可允许的最高DMSO浓度。
  2. 按照上文第3节所述方法，将细胞接种于BD PureCoat胺基包被的384孔板中，进行染料加载和洗涤，并在每孔中保留20 μl HBSS检测缓冲液。整块板应包含经四环素诱导的细胞（图3A）。
  3. 使用Bravo自动化液体处理平台或手动移液，在HBSS检测缓冲液中配制十一浓度梯度的DMSO稀释系列。通常，在检测中评估从10%到0.01% v/v的2倍稀释系列DMSO。由于DMSO溶液在最终检测中会被稀释一半，因此应配制2倍浓度的稀释系列。该稀释系列应按照图3A所示的板图加样至聚丙烯材质的384孔板中。
  4. 根据第4节中确定的EC80或最适Tl+浓度，配制5倍浓度的Tl+刺激溶液，并将其加入刺激板中。
  5. 将细胞板、DMSO稀释板和Tl+刺激板装入FDSS仪器中。设置双加样程序，向含有20 μl HBSS检测缓冲液的细胞板各孔中加入20 μl 2倍浓度的DMSO稀释液。DMSO在细胞上的孵育时间应与筛选中小分子溶剂处理细胞的时间相同。在向细胞板各孔加入10 μl 5倍浓度Tl+缓冲液前，至少记录10秒的FluoZin-2基础荧光信号。该实验应在三个独立的时间点重复进行，以验证结果的可重复性。
  6. 对于化合物在10 μM浓度下进行测试的典型高通量筛选，该检测体系应能耐受至少0.1% v/v的DMSO浓度。

6. 已知药理学调节剂对检测灵敏度的影响测定

  1. 确定最佳 Tl 后+ 检测的浓度和DMSO耐受性，已知药理学活性物质对Kir通道介导的Tl+ 应检测通量。本系列实验将评估该检测方法的灵敏度、根据化合物效力进行排序的能力，以及根据其功效模式对化合物进行分类的能力。例如 激活剂、抑制剂），并鉴定出性能良好的对照化合物，用于后续的检测方法开发和筛选。
  2. 在BD PureCoat氨基包被的384孔板中，按照上述第3节所述方法接种、负载染料并洗涤细胞，每孔保留20 μl HBSS检测缓冲液。第1列以及A1-A23行应加入未经四环素诱导的细胞（图4A).
  3. 使用 Bravo 自动液体处理平台或手动移液，在 HBSS 检测缓冲液中配制已知调节剂的十一浓度梯度稀释系列。通常在检测中评估从 100 μM 到 2 nM 的 3 倍稀释系列的活性。由于 DMSO 溶液在最终检测中会被稀释一半，因此稀释系列应配制成 2 倍浓度。根据所示的板图，将稀释系列以三复孔形式加入聚丙烯 384 孔板中 图 4A确保稀释时各药物处理组的最终DMSO浓度相同，且不超过第5节中定义的最大允许DMSO浓度。
  4. 配制5x Tl+ 基于最佳 Tl 的刺激板+ 第4节中确定的浓度
  5. 加载细胞、化合物和Tl+ 将刺激板放入FDSS仪器中。设置双加样程序，将20 μl浓度为2倍的化合物系列加入含20 μl HBSS检测缓冲液的细胞板对应孔中。向细胞板中加入化合物后，孵育最多20分钟。请注意，为获得最佳信噪比，化合物的最佳孵育时间可通过一系列实验确定，其中选择几个不同的孵育时间进行测试。在加入10 μl 5倍浓度Tl之前，至少记录10秒的FluoZin-2荧光基线+ 向细胞板的每个孔中加入缓冲液。在3个不同的日期重复实验，以验证结果的可重复性。

7. 棋盘分析

  1. 在接下来的一系列实验中，将使用“棋盘法”分析来评估检测的均一性和可重复性。通常，将对照抑制剂以每隔一个孔的方式点样于384孔板的每列和每行中，如图5A所示。为严格评估检测中的背景噪声，应使用抑制剂的EC80浓度。其余孔中加入DMSO作为溶剂对照。通过测定DMSO处理组和药物处理组细胞中的Tl+流，计算Z'值，该值是衡量两组孔之间孔间变异性的统计指标。Z'值的计算公式如下：
    Z' = 1 - (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann|
    其中SD表示标准差，p代表未受抑制的离子流值，n代表完全抑制的离子流值。若在三个独立实验日中，检测的Z′值均大于或等于0.5，则认为该检测适用于高通量筛选。
  2. 按照第3节所述方法，在BD PureCoat氨基包被的384孔板中进行细胞铺板、染料加载和洗涤操作，每孔保留20 μl HBSS检测缓冲液。注意整个孔板均需用四环素诱导表达。
  3. 使用多通道移液器，将已知靶向Kir通道抑制剂（浓度依据第6.5节确定）和含0.1% v/v DMSO的溶剂对照，分别加入384孔聚丙烯板中，每孔80 μl，如图5A所示。从A1孔开始，用多通道移液器加入已知抑制剂，交替加入至B2孔，依此类推直至B24孔。随后从B1孔开始，用DMSO重复上述交替加样过程，直至A24孔。最终孔板布局应呈现棋盘状分布。
  4. 根据第4节确定的最佳Tl+浓度，制备5倍浓度的Tl+刺激液孔板。
  5. 将细胞板、化合物板和Tl+刺激板装入FDSS仪器中。设置双加样程序，将2倍浓度的化合物系列溶液各20 μl加入含有20 μl HBSS检测缓冲液的细胞板对应孔中。向细胞板中加入化合物后，在室温下孵育最多20分钟。在向细胞板各孔加入10 μl 5倍浓度Tl+缓冲液之前，至少记录10秒的FluoZin-2荧光基线信号。在三个独立实验日重复该实验，以验证结果的可重复性。

8. 预实验筛选

  1. 在检测方法开发的最后阶段，对数千种化合物进行初步筛选，以评估该检测方法在大规模高通量筛选中最终使用条件下的表现。
  2. 按照上述第3节所述方法，将细胞接种、染料负载并洗涤至BD PureCoat氨基包被的384孔板中，每孔保留20 μl HBSS检测缓冲液。请注意，整个板需在含四环素的条件下过夜培养，以诱导Kir通道的表达。
  3. 选择约2,000至3,000种结构多样的化合物进行测试。通常适宜且方便的做法是使用已知具有生物活性、可能富集了离子通道调节剂的化合物库，例如Spectrum Collection（MicroSource）和LOPAC collection（Sigma）。此外，在初步筛选中应合理地包含已知的靶向Kir通道调节剂。理想情况下，这些化合物应以盲法方式加入孔中，以便对后续描述的阳性信号筛选方法进行无偏倚的测试。使用Labcyte Echo液体处理系统或合适的针式移液工具，将来自MLPCN化合物库（源板）中以DMSO溶解的选定化合物转移至384孔聚丙烯板（目的板）中进行准备。注意：测试化合物仅位于第3–22列；在第1、2、23、24列的其他所有孔中加入已知浓度的抑制剂，该浓度根据第7节确定，足以完全抑制Kir通道活性。在第1、2、23和24列的其余孔中加入适当体积的DMSO，以制备与测试组DMSO浓度匹配的溶剂对照。使用Multidrop Combi将所有孔用检测缓冲液稀释。通常测试化合物浓度为20 μM，比目标筛选浓度高2倍。
  4. 根据第4节确定的最佳Tl+浓度制备Tl+刺激板。
  5. 执行初步筛选。在操作过程中注意合理安排各步骤的时间顺序，以确保在初步筛选运行期间各板之间的时间一致性。
  6. 初步筛选完成后，使用Z'因子公式分析第1、2、23和24列中的棋盘格对照孔。检查Z'因子值低于0.5的板，以确定对照组群分离效果不佳的原因。可通过多种方法选择阳性信号。对于初步筛选，通常计算溶剂对照组群的均值和标准差，并选择信号值>/= 溶剂对照均值3个标准差以上的孔作为阳性结果。
  7. 完成阳性信号筛选后，将选出的阳性化合物在两组板中分别重复测试两次。一组板中含有未添加四环素的稳定Kir细胞，另一组板中含有添加四环素的稳定Kir细胞系。若某化合物在两次重复测试板中至少一次呈阳性，且在未诱导表达的板中无显著活性，则可视为已验证的阳性化合物。检查已验证的阳性化合物列表，统计检测到的“隐藏”对照样品数量。若在初步筛选中未能检测到这些对照样品，表明需要进一步优化筛选条件或阳性信号筛选参数。

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结果

使用四环素诱导型表达系统可为区分内源性通路和目标Kir通道中的Tl+流提供便捷的内部对照。图1展示了一些在不同类型实验中使用的细胞铺板图示例，其中未诱导或四环素诱导的细胞孔位以不同颜色标示。图2A显示了用于确定检测开发和化合物筛选中最佳Tl+浓度的源板图，颜色梯度代表从100%到0.002%的3倍稀释系列Tl+浓度。图2B展示了一个代表性的荧光强度图，冷色调至暖色调分别表示低至高的Tl+流值。本实验使用了图1C所示的细胞铺板图。对Tl+浓度-反应曲线（CRC）拟合四参数逻辑函数（图2C），用于确定Tl+的EC80值为15%。图3A显示了用于测定检测体系对DMSO耐受性的源板图，第1列和第24列仅含有检测缓冲液，颜色梯度表示从10%到0.01%的2倍稀释系列DMSO浓度。...

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讨论

数据处理： 数据采集完成后，分析中的一个常见步骤是将每个孔的荧光响应值 F 对其在实验开始时的初始值 F0 进行归一化处理。这一操作通常被称为“静态比值”，记作“F/F0"。 当 F0 主要由指示剂染料信号主导时，静态比值法可在很大程度上校正诸如光照不均、信号采集差异以及细胞数量不一致等多种因素。然而，当染料信号较弱或系统中背景荧光或反射较强时，除非在计算静态比值前已对背景信号进行了适当处理，否则该方法将难以有效。数据归一化后，通常需将荧光波形简化为一个单一数值，用于量化活性并筛选阳性结果。最常用的方法是拟合加入 Tl+ 后 10 秒内的数据点，以获得诱导荧光上升的初始斜率。在阳性结果筛选中，一种常用策略是假设测试化合物群体中的绝大多数均为无活性化合物（即零假设成立）。据此计算测试群体的均值和标准差，并将偏离均值三个标准差以上的样本判定为阳性结果。

针对长时间化合物孵育的方案拆分：在检...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目1R21NS073097-01和1R01DK082884（J.S.D.）以及美国国立卫生研究院基金会资助项目PIER11VCTR的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pcDNA5/TOInvitrogenV1033-20四环素诱导型表达载体
T-REx-HEK293 细胞InvitrogenR71007四环素诱导型细胞系
Lipofectamine LTX/Plus 试剂Invitrogen15338100转染试剂
FBSATLANTA BiologicalsS11550细胞培养基
DMEMInvitrogen11965细胞培养基
潮霉素BInvitrogen10687-010细胞培养基
Blasticidin SInvitrogenR210-01细胞培养基
青霉素/链霉素Invitrogen15140细胞培养基
无钙镁HBSSMediatech21022CV细胞洗涤
胰蛋白酶-0.25%Mediatech25053CI细胞解离
四环素盐酸盐SigmaT9823诱导剂
透析胎牛血清ATLANTA BiologicalsS12650铺板培养基
FluoZin-2InvitrogenF24189荧光染料
Pluronic F-127InvitrogenP-3000MP染料负载
HBSSInvitrogen14175测定缓冲液
HEPESInvitrogen15630测定缓冲液
NaHCO₃3SigmaS6297Tl+ 刺激缓冲液
MgSO₄4SigmaM2643Tl+ 刺激缓冲液
CaSO4∙2H2OSigmaC3771Tl+ 刺激缓冲液
D-葡萄糖SigmaG7528Tl+ 刺激缓冲液
硫酸铊Aldrich204625Tl+ 刺激缓冲液
HEPESSigmaH4034Tl+ 刺激缓冲液
DMSOSigmaD4540溶剂
八通道电子移液器BiohitE300384孔板中的细胞铺板
BD PureCoat 氨基包被 384 孔板BD 生物科学356719检测用微孔板
Echo 认证的 384 孔聚丙烯微孔板（384PP）LabcyteP-05525化合物来源微孔板
384孔聚丙烯微孔板Greiner Bio-One781280
Multidrop Combi 试剂分配器赛默飞世尔科技5840300
ELx405 微孔板洗板机BioTekELx405HT自动细胞洗涤
Echo液体处理系统LabcyteLabcyte Echo 550
Bravo 自动化液体处理平台安捷伦科技标准模型
滨松 FDSS 6000滨松动力学成像板式读数仪

<强>表1材料与试剂清单

参考文献

  1. Ehrlich, J. R. Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy. J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).
  2. Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities. Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).
  3. Swartz, K. J. Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels. Toxicon. 49 (2), 213(2007).
  4. Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).
  5. Jin, W., Lu, Z. Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).
  6. Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making. Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).
  7. Weaver, C. D., et al. A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells. J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).
  8. Lewis, L. M., et al. High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and. 76 (5), 1094(2009).
  9. Bhave, G., et al. Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel. Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).
  10. Raphemot, R., et al. Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1. Front Pharmacol. 2, 75(2012).
  11. Niswender, C. M., et al. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).

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勘误


Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Tl FluoZin 2 384 Z
高通量筛选内向整流钾通道的小分子调节剂
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