我们描述了一种利用非病毒型piggyBac转座子系统将外源基因导入原代人T细胞的遗传修饰方法。通过piggyBac转座子系统修饰的T细胞可实现外源基因的稳定表达。
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摘要
摘要
的 piggyBac 转座子系统在自然界中具有活性，最初来源于卷心菜夜蛾1,2. 这种非病毒系统基于质粒，最常见的是使用两种质粒，其中一种表达 piggyBac 转座酶以及含有目的基因的转座子质粒，该质粒在反向重复元件之间携带目的基因，这些反向重复元件是基因转移活性所必需的。 PiggyBac 通过“剪切-粘贴”机制介导基因转移，即转座酶将转座子片段整合到目标细胞基因组中。 PiggyBac 在多种昆虫中均表现出高效的基因递送活性1,2哺乳动物3-5以及人类细胞6，包括原代人T细胞7,8. 近期，一种超活性 piggyBac 转座酶的生成提高了基因转移效率9,10.
人类T淋巴细胞在癌症过继性免疫治疗中具有临床研究价值11值得注意的是，首个利用转座子修饰人类T细胞的临床试验 睡美人 转座子系统已获批准12我们先前已评估了其效用 piggyBac 作为一种非病毒性的人类T细胞基因修饰方法。我们发现 piggyBac 高效地对人T细胞进行遗传修饰，以导入报告基因和非免疫原性可诱导自杀基因7基因组整合位点分析显示，其整合过程对已知原癌基因内部或邻近区域并无偏好性13我们使用了 piggyBac 对细胞毒性T淋巴细胞进行基因修饰，使其表达靶向肿瘤抗原HER2的嵌合抗原受体，并发现经基因修饰的T细胞可介导对HER2阳性肿瘤细胞的靶向杀伤 体外 和 体内 在原位小鼠模型中14我们还使用了 piggyBac 生成对雷帕霉素具有抗性的T细胞，这在使用雷帕霉素的癌症治疗中应具有应用价值15.
本文介绍了一种利用piggyBac对原代人T细胞进行遗传修饰的方法。该方法包括从人血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），随后进行T细胞的培养、基因修饰和活化。在本报告中，T细胞被导入一种报告基因（eGFP），以便通过流式细胞术对基因表达进行分析和定量。
PiggyBac 可用于将多种目的基因导入人T细胞中进行修饰。尽管我们已利用piggyBac引导T细胞靶向肿瘤抗原14，但也曾利用piggyBac引入可诱导的安全开关，以便在需要时清除基因修饰的细胞7。由于piggyBac具有较大的载荷容量，还可实现对大型基因的转移，例如耐雷帕霉素的mTOR分子（15 kb）15。因此，本文介绍了一种非病毒性的方法，可用于多种目的的原代人T细胞稳定基因修饰。
方案
第0天
1. 从人血液中分离外周血单个核细胞
- 使用静脉穿刺法将20 ml新鲜人血采集至含钠-肝素的真空采血管中。
- 按1:1（v/v）比例混合血液与高级RPMI 1,640培养基。
- 向50 ml离心管中加入20 ml淋巴细胞分离液（25 °C）。缓慢将25–30 ml血液-RPMI 1,640混合液叠加于淋巴细胞分离液上方。
- 以400 × g离心40分钟，不启用刹车。
- 使用一次性移液管收集清晰层及模糊层，并转移至含10 ml 1× PBS（25 °C）的容器中，再用1× PBS补足体积至50 ml。
- 以450 × g离心10分钟。
- 彻底吸除上清液，加入20 ml高级RPMI 1,640培养基。
- 以400 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，加入10 ml完全T细胞培养基，并补充5 ng/ml预热至37 °C的重组人IL-15（rhIL-15）。
- 计数细胞数量，将细胞以每孔2 × 106个接种于24孔组织培养包被板中，培养基为含5 ng/ml rhIL-15的完全T细胞培养基。在周围孔中加入无菌水。于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
第1天
2. 使用抗CD28和抗CD3抗体包被培养板以刺激T细胞
- 将抗CD28和抗CD3抗体分别用无菌水稀释至每种抗体浓度为1 μg/ml。
- 向一个未包被的24孔组织培养板中5个已标记的孔内，每孔加入500 μl上述每种抗体溶液。
- 向其余孔中加入无菌水。用封口膜包裹培养板，并置于4 °C冰箱中。
3. 未刺激T细胞的核转染
- 将T细胞培养基在37 °C预热，并添加5 ng/ml的rhIL-15。通过将500 μl的核转染补充剂1加入2.25 ml的核转染溶液中，制备完全核转染溶液。
- 在1.5 ml微量离心管中分别加入5 μg转座子（Zeo-pT-CMV-eGFP）和转座酶（pCMV-piggyBac）。注意：可能需要优化转座酶和转座子DNA的用量，以实现最佳基因递送效果并最小化细胞毒性。质粒可通过申请向作者索取。
- 从24孔组织培养板中收集PBMC至50 ml离心管中，计数细胞数量。保留2 × 106个细胞，用于流式细胞术对照。
- 将7–10 × 106个细胞加入15 ml离心管中，以400 × g离心5分钟，吸除上清液后轻弹管底沉淀。
- 向松散的细胞沉淀中加入100 μl T细胞完全核转染溶液。
- 将溶液-细胞混合物加入含有质粒的离心管中。
- 将溶液-细胞-质粒混合物加至核转染杯底部，注意避免产生气泡。
- 使用程序U-014（未刺激的人T细胞，http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/）进行核转染。
- 立即向核转染杯中加入500 μl预热的含rhIL-15的培养基，然后将细胞转移至24孔板的一个孔中，孔中已含有1.5 ml预热的含rhIL-15的培养基。
- 在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中过夜培养。
第2天
4. T细胞的非特异性刺激
- 收集细胞并确定细胞数量。保留 0.5 x 106 通过流式细胞术检测细胞，以确定GFP阳性细胞的频率。以未转染的PBMCs作为对照。
- 吸弃非组织培养包被板中的CD3/28抗体溶液，每孔用T细胞培养基清洗一次。
- 将核转染后的细胞重悬于 0.5 x 106 每毫升完全CTL培养基中加入5 ng/ml rhIL-15，重悬细胞。将转染后的细胞每2.0 ml加入非组织培养板的4个孔中。每孔加入0.5 × 106 非核转染细胞至5th 好。
- 在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育3天2.
第5天
- 从未经包被的组织培养板中收集刺激后的T细胞。
- 计数细胞，并将细胞重新接种至包被的24孔组织培养板中，密度为0.7 × 106 个细胞/mL，使用含5 ng/mL IL-15的T细胞培养基。
第7天
7. 基因表达分析
- 收集细胞，用抗人CD8抗体（也可使用抗CD3和抗CD4抗体）染色，通过流式细胞术分析GFP表达百分比。
第8天（可选）
8. T细胞扩增
- 转染后第8天，T细胞可重悬于含IL-15的T细胞培养基中，以每孔0.7 × 106个细胞的密度接种，以进行进一步扩增16。
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结果
示意图展示了利用报告基因（eGFP）对人类T淋巴细胞进行遗传修饰的各个步骤 图1这些质粒可向作者索取。图示展示了利用报告基因（eGFP）进行基因修饰的人T淋巴细胞的步骤。 图2. 为了使T细胞在培养中分裂、扩增和增殖，必须对其进行活化。对经过修饰的人T细胞在培养第1天和第7天通过流式细胞术分析其基因表达。图中显示的是来自一位供体的结果 图3. 细胞经别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD8抗体染色后，使用配备四色荧光滤光片组的FACSCalibur流式细胞仪及CellQuest软件（Becton Dickinson）分析eGFP（转基因）与APC荧光信号。我们此前已观察到CD4和CD8阳性T细胞均发生基因修饰，本文以CD8阳性细胞为例进行展示。7尽管本文仅针对单个转基因表达进行了分析， piggyBac 也已用于人类细胞的多基因（或多重）基因转移17第1天到第7天之间eGFP表达的下降可能是由于并非所有转染的细胞都发生了转座子DNA的稳定整合。
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讨论
本文所述方法可实现对原代人T淋巴细胞的稳定转基因修饰。我们此前已测试了该方法的使用 piggyBac 转座子系统用于改造T细胞，使其表达报告基因（超过4周）、非免疫原性自杀基因、用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（超过100天），并赋予其对免疫抑制药物的抗性7,13-15非病毒性T细胞修饰技术用于过继性免疫治疗及其他应用时，成本应远低于逆转录病毒转导，因而有望得到更广泛的应用。新型高活性 piggyBac 增加稳定转基因修饰人T细胞制造的可行性9尽管本文未予详述，但可通过以下组合方法获得足量的稳定转染T细胞，以满足潜在的临床应用需求。 piggyBac-介导的基因转移和aK562（人工抗原呈递）饲养细胞，初始产量约为2 x 106 稳定转染的T细胞可扩增4到5个对数级，达到10以上10 4至5周内转导的T细胞数量达到1012 6至7周内7. 分析 piggyBac 人类T细胞中的整合位点未显示出对原癌基因的偏好性，但在采用上述核转染技术时...
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致谢
SS 部分得到 TBMM 项目中通过 HHMI 医学转化研究生培训资助的支持。MHW 部分得到美国退伍军人事务部职业发展奖以及 Harold M. Selzman 博士夫妇慷慨支持。本工作还部分得到 NIH 淋巴瘤 SPORE 资助项目 P50CA126752 和 NIH R01 DK093660 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| 高级RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone 胎牛血清 | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I 补充剂 | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| 人白细胞介素-15重组蛋白 | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| 人T细胞核转染试剂盒 | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| 抗人CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| 抗人 CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24孔组织培养处理板 | BD Falcon | 353047 | |
| 24孔非组织培养处理板 | BD Falcon | 351147 | |
| 完全T细胞培养基成分 1x 高级 RPMI 1,640 5% 热灭活胎牛血清 2 mM GlutamaxIM-I |
参考文献
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