在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

摘要

从中期到后期的转变是通过后期促进复合物（APC/C）依赖性的泛素化作用以及随之发生的细胞周期蛋白B的降解所触发的。在此，我们建立了一个系统，该系统在脉冲-追踪标记后，可监测整个细胞群体中细胞周期蛋白B的蛋白水解过程，并有助于检测有丝分裂检查点的干扰作用。

摘要

细胞分裂过程中将染色体均等分配到两个子细胞中，是保证遗传稳定性的前提条件¹。染色体分离过程中的错误是恶性肿瘤的特征之一，并与疾病进展相关^2-4。纺锤体组装检查点（SAC）是一种有丝分裂监控机制，可将细胞阻滞在中期，直到每一条染色体都与有丝分裂纺锤体形成稳定的双极连接¹。SAC通过干扰APC/C的活化亚基Cdc20，抑制securin和cyclin B的蛋白降解，从而阻止染色体分离和有丝分裂的退出。染色体连接异常会阻止SAC信号的沉默，导致APC/C^Cdc20持续受到抑制，直至问题解决，以避免染色体错误分离、非整倍性和恶性增殖¹。

大多数研究染色体错误附着对APC/C依赖性蛋白水解影响的实验，均利用微管去聚合或微管稳定药物破坏纺锤体，以干扰染色体与微管之间的附着。由于干扰微管动力学会影响关键调控因子的运输和定位，这些操作存在引发人为假象的风险⁵。

为了研究在未受干扰的细胞群体中，纺锤体组装检查点（SAC）如何干扰有丝分裂期间细胞周期蛋白B（cyclin B）的APC/C依赖性蛋白水解过程，我们建立了一种基于组蛋白H2-GFP的系统，该系统可同时监测有丝分裂染色体的中期排列以及cyclin B的蛋白水解过程⁶。

为了描绘蛋白水解谱，我们构建了一种嵌合的细胞周期蛋白B报告分子，其C端带有SNAP基团⁶（图1）。在自标记反应中，SNAP基团能够与烷基鸟嘌呤载体（SNAP底物）形成共价键^7,8（图1）。SNAP底物分子易于获得，并可携带多种不同的荧光染料。当将膜通透性的SNAP底物加入培养基后，嵌合的细胞周期蛋白B-SNAP分子即被标记⁷（图1）。标记反应完成后，细胞周期蛋白B-SNAP的荧光强度以类似脉冲-追踪反应的方式下降，荧光强度的变化反映了细胞周期蛋白B的降解水平⁶（图1）。该系统可并行监测大量细胞（或多个细胞群体）中依赖有丝分裂后期促进复合物/环体（APC/C）的蛋白水解过程。因此，该系统可能成为筛选能够干扰中期至后期转换过程中蛋白水解活性的试剂或小分子的有力工具。此外，最近研究表明，在小鼠和人类中，有丝分裂期间细胞周期蛋白B的持续合成可能通过维持其表达水平的稳定，发挥促进有丝分裂阻滞的重要作用^9,10，本系统使我们能够将细胞周期蛋白B的蛋白水解作为动态平衡中的一个组成部分进行分析⁶。

方案

1. 在显微镜培养皿上接种基于U2OS的Cyclin B-SNAP报告细胞（克隆11细胞 ⁶）

1. 将处于对数生长期且异步培养至少48小时的亚融合SNAP报告细胞进行胰蛋白酶消化处理。
2. 使用8孔显微镜培养板（确保细胞分布均匀）。

为将细胞均匀接种至8孔显微镜培养板的整个表面，离心10,000个细胞，并重悬于350 μl不含酚红的正常生长培养基中（添加10%胎牛血清、青霉素/链霉素和丙酮酸钠）。将细胞悬液转移至显微镜培养板（图2）。

使用8孔显微镜培养板（中心区域细胞密度最大）。

为了在显微镜腔室中心以较高密度接种细胞，先向腔室内加入 300 μl 无酚红的正常培养基。然后，将 5,000 个细胞小心地接种到显微镜腔室的中央（图 2）。

使用96孔特殊光学板（细胞分布均匀）。

为将细胞以均匀分布接种至96孔板的整个孔表面，需离心5,000个细胞，并重悬于300 μl无酚红的正常培养基中。将细胞悬液转移至96孔板中。根据所需含细胞孔的总数，调整细胞数量及悬液总体积（图....

讨论

本文介绍了一种基于活细胞成像的方法，可同时监测细胞周期蛋白B的蛋白水解过程和染色体排列情况。该方法能够在单细胞水平上研究未受干扰的细胞群体中的有丝分裂调控。通过细胞周期蛋白B的降解曲线，可直接了解APC/C的活性，从而间接反映纺锤体组装检查点（SAC）的状态⁶。

该方法尽管基于Scan^R软件建立，但可在任何类似的显微镜系统上轻松重现。此外，利用我们构建的逆转录病毒载体表达的cyclin B-SNAP融合蛋白，可通过逆转录病毒稳定整合，将报告细胞系轻松建立于任何目标细胞系中。为了进一步提高系统的灵活性，嵌合型SNAP蛋白可使用多种荧光染料进行染色。

组蛋白 H2-GFP 的应用除了在监测染色体排列方面具有必要性外，还可实现快速且简便的自动对焦。自动对焦和荧光强度设置也取决于细胞类型，需针对每种细胞系分别确定。利用 Scan^R 技术对大量细胞分裂过程中的蛋白水解谱进行采集，使我们能够筛选出发生染色体排列错误的单个有丝分裂事件。这使我们能够界定异常分裂与正常分裂之间蛋白水解谱的差异⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
报告细胞系	本实验室自行构建，方法见文献6	克隆11号报告细胞 （基于U2Os的cyclin B-SNAP表达细胞）
逆转录病毒cyclin B-SNAP表达载体	本实验室自行构建，方法见文献6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
酚红-free DMEM	Gibco	21063-029	需添加FCS、丙酮酸钠、青霉素/链霉素
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	储存液：400 μM，溶于DMSO
特殊光学板，96孔	Costar	3720
μ-Slide 8孔，ibiTreat	Ibidi	80826
显微成像系统	Olympus	IX-81倒置显微镜，配备环境控制室
物镜	Olympus	UPLSAPO 20x物镜（数值孔径0.75）
图像采集软件	Olympus	Scan^R Acquisition软件（v.2.2.09）
图像分析软件	Olympus	Scan^R Analysis软件（v.1.2.0.6）