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方法文章

使用18F-FDG PET对大鼠肾移植后急性移植物排斥反应进行无创成像

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DOI：

10.3791/4240

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2013年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, 2Department of Nuclear Medicine, University of Münster, 3European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种大鼠肾移植模型，通过使用18F-氟脱氧葡萄糖的正电子发射断层扫描技术，无创评估急性同种移植排斥反应。

摘要

终末期肾病患者的数量以及肾移植受者数量持续增加。急性细胞性移植排斥反应（AR）是影响移植器官长期存活的负面预后因素，其及时诊断对于维持移植器官功能至关重要1。目前，AR 只能通过穿刺活检明确诊断，但该方法属于侵入性操作，存在导致移植物损伤甚至丧失的重大风险。此外，对于正在使用抗凝药物的患者，活检不可行，且该技术采样部位有限，若排斥反应呈局灶性或片状分布，则可能导致假阴性结果。因此，人们一直在寻求新的 AR 检测方法，而这些研究往往需要借助动物模型，包括采用各种移植模型来完成。

自20世纪60年代初以来，大鼠肾移植已成为研究和分析急性排斥反应（AR）2 的成熟实验方法。本文进一步介绍在同种异体单侧肾切除大鼠肾移植模型中，采用18F-氟脱氧葡萄糖（FDG）的小动物正电子发射断层扫描（PET）技术，用于评估急性排斥反应，并提出移植物FDG-PET成像可作为人类临床情况下无创、特异且早期诊断急性排斥反应的新选择3。此外，该方法还可用于移植术后随访，以改善对移植排斥反应的监测4。

方案

1. 供体器官获取

  1. 安装立体定位显微镜，记录8-10周龄大鼠的体重（供体与受体体重应相匹配）。
  2. 使用氧气/异氟烷吸入法（异氟烷4%/氧气2 L/min）对供体大鼠（Lewis Brown Norway F1，LBN F1）进行麻醉。通过将异氟烷浓度降至2–2.5%来维持麻醉状态。
  3. 将麻醉后的大鼠置于手术垫上，用胶带固定大鼠的四肢，并在大鼠眼部涂抹眼膏（Bepanthen，Bayer）。
  4. 剃除大鼠腹部毛发并消毒，从耻骨至肝脏尾侧缘沿腹中线做一纵向切口。将肠道轻柔移至右侧，暴露左肾及其血管。用一块薄纱布覆盖左肾，并以预温的等渗盐水润湿纱布，防止组织干燥。
  5. 使用Dumont Angled Tip Forceps（Dumont SS-45 Forceps Inox Medical，Fine Science Tools，货号：11203-25）仔细分离包绕左侧输尿管的脂肪组织。避免与输尿管直接接触，应连同足够的周围脂肪组织一并游离。
  6. 使用Dumont弯头镊子将左肾静脉与肾动脉分离。清除两根血管上的所有脂肪和结缔组织，并电凝肾上腺血管和睾丸血管。
  7. 解剖主动脉和下腔静脉（IVC），切取位置分别为左肾动脉上方和左肾静脉下方，并电凝所有分支动脉。
  8. 用显微外科夹钳（Micro Serrefines，Fine Science Tools，货号：18055-04）夹闭左肾动脉上方的腹主动脉近心端，尽可能靠近肠系膜上动脉。使用外科丝线（5-0，Vömel，货号：14739）在左肾动脉下方约5 mm处结扎肾下腹主动脉。
  9. 用外科丝线（5-0，Vömel）结扎肾下腔静脉，并用显微外科夹（Micro Serrefines，Fine Science Tools，货号 18055-03）夹闭肾上腔静脉。
  10. 使用精细剪刀（Iris Scissors - ToughCut Straight 11.5 cm，Fine Science Tools，货号：14058-11）尽可能靠近下腔静脉切断肾静脉。
  11. 缓慢灌注肾脏 原位 用 2 ml 冰冷的 HTK 灌注液（CUSTODIOL HTK，Dr. Franz Köhler Chemie）通过在肾下主动脉插入套管（Microlance 3 27G ¾，BD，货号 302200）进行灌注。确认肾脏颜色发生变化（变为橄榄色）。
  12. 首先横断肾上主动脉，然后横断肾下主动脉，最后尽可能靠近膀胱处横断输尿管。
  13. 将肾脏及其血管供应连同输尿管一并取出，置于冰上的HTK灌注液中保存。
  14. 在麻醉状态下，通过移除血管夹并连续切除心脏，处死供体大鼠。

2. 受体准备与移植

  1. 安装立体定位显微镜，记录大鼠体重。
  2. 使用 4% 异氟烷麻醉受体大鼠（Lewis 品系），通过将异氟烷浓度维持在 2–2.5% 来维持麻醉状态。
  3. 将麻醉后的大鼠置于手术垫上，用胶带固定大鼠四肢，并在大鼠眼部涂抹眼用软膏。使用直肠温度传感器和加热垫监测并控制核心体温。术中需反复监测动物的体温、呼吸频率和心率。
  4. 剃除并消毒腹部区域，从耻骨至肝脏尾侧边界行腹正中切口。使用手术刀切割皮肤以尽量减少皮肤创伤。将肠道向右侧移位，暴露左肾及其血管。
  5. 使用 Dumont 斜头镊和棉签小心剥离肾包膜。
  6. 在肾门附近使用两道结扎线（Mersilene 4-0，Ethicon，货号 EH6732H）结扎左肾动脉、静脉和输尿管。切除肾脏大部分组织，仅保留肾门结构。用棉签清洁切面并检查有无出血，必要时加扎一道结扎线。
  7. 使用棉签小心钝性分离覆盖在肾下腹主动脉和下腔静脉尾侧的结缔组织。
  8. 使用 Dumont 斜头镊将可见的神经与肾下腹主动脉和下腔静脉分离。
  9. 小心分离肾下腹主动脉与下腔静脉之间的结缔组织膜，形成两个长度为 2–4 mm 的开口：第一个位于睾丸血管分支下方，第二个位于髂总血管分支上方。电凝处理两者之间的髂腰动脉和静脉。
  10. 将一根手术缝线（Mersilene 0；Ethicon，货号 EH6665E）分别穿过两个开口。利用这些缝线将肾下腹主动脉和下腔静脉轻柔牵拉至动物右侧，以暴露背侧分支血管。电凝处理两个开口之间的所有分支血管，随后移除手术缝线。
  11. 接下来，使用四把显微血管夹（Micro Serrefines，Fine Science Tools，货号 18055-04）顺时针夹闭腹主动脉和下腔静脉（IVC），从上方开口处的腹主动脉开始，至上方开口处的下腔静脉结束（Micro Serrefines，Fine Science Tools，货号 18055-03）。
  12. 随后，用针头（Microlance 3 27G ¾，BD，货号 302200）小心穿刺隔离段腹主动脉的上端，将精细弹簧剪的下刀片（Vannas Spring Scissors - 3 mm Blades，Fine Science Tools，货号 15000-00）插入穿刺口，进行短段纵向切开。用冰冻 HTK 灌注液冲洗隔离的腹主动脉，以清除残留血液。
  13. 同样地，用针头小心穿刺隔离段下腔静脉的下端，将精细弹簧剪的下刀片插入穿刺口，进行纵向切开，切口末端略低于腹主动脉切口位置。再次冲洗血管以清除残留血液。
  14. 将肾移植 graft 从保存液中取出，放置于原左肾位置下方，并确保其方向正确。
  15. 检查 graft 肾动脉的方向，确认无扭曲。然后在 graft 上覆盖一层薄纱布，并用冰冻 HTK 灌注液浸润以降温并防止干燥。
  16. 使用手术缝线（Ethilon 9-0，Ethicon，货号 2809G）固定 graft 腹主动脉片上方开口处（即 graft 肾动脉汇入处），先固定腹主动脉切口的上端，再固定下端。使用手术缝线（Ethilon 9-0）、Dumont 斜头镊和弯头 Castroviejo 持针器（Fine Science Tools，货号 12061-01）顺时针连续缝合关闭切口。随后，通过逆时针方向的第二道连续缝合将第一道缝合覆盖于结缔组织下。此时，仅 graft 腹主动脉片的下部尚未闭合。定期用冰冻 HTK 灌注液冷却 graft。
  17. 通过插入 graft 腹主动脉断端的钝头针注入 1 mL 冰冻 HTK 灌注液，灌注 graft，以验证缝合的密闭性和完整性，并清除 graft 内残留血液。随后，使用手术丝线（5-0，Vömel）结扎腹主动脉断端。
  18. 检查 graft 肾静脉的方向，确认无扭曲。
  19. 使用手术缝线（Ethilon 9-0）固定 graft 静脉开口处——先固定下腔静脉切口的上端，再固定下端。使用手术缝线（Ethilon 9-0）、Dumont 斜头镊和弯头 Castroviejo 持针器顺时针连续缝合关闭切口。定期用冰冻 HTK 灌注液冷却 graft。
  20. 逆时针方向依次移除显微血管夹，首先移除最上方的下腔静脉夹。移除最后一把腹主动脉夹后，使用棉签小心止住可能的轻微出血。数秒后 graft 将呈现粉红色，输尿管收缩应随之出现。
  21. 为将 graft 输尿管植入受体膀胱，使用 Vannas 弹簧剪（Student Vannas Spring Scissor straight，Fine Science Tools，货号 91500-09）小心切除膀胱顶部一小块肌层。然后使用 Dumont 斜头镊去除 graft 输尿管周围的组织（主要为脂肪）。小心夹住输尿管尖端，通过反向牵拉，将其周围的脂肪、结缔组织及包埋的血管分离。将输尿管尖端固定于一根手术缝线（Prolene 6-0，Ethicon，货号 8697H）末端，并用附带的针头穿刺先前准备好的膀胱顶部。将输尿管穿过膀胱，并从底部另一穿刺口引出。
  22. 使用手术缝线（Ethilon 9-0）将先前从输尿管分离的组织固定于膀胱顶部。剪除附有缝线的输尿管尖端，并从下方轻推将输尿管回纳入膀胱内。随后，使用手术缝线（Ethilon 9-0）闭合第二个膀胱穿刺口。
  23. 使用手术缝合线（Mersilene 0）通过两道独立的连续缝合关闭腹壁和皮肤。使用聚维酮碘消毒伤口，并于术后三天内皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg 体重，每日两次）以控制伤口疼痛。

3. 异体移植物排斥反应的成像

  1. 使用 2-2.5% 异氟烷麻醉非禁食大鼠。
  2. 通过 24 G 导管（Braun, Introcan, 4252500-01）经侧尾静脉插管后静脉注射 30 MBq FDG（0.1 ml 含 30 MBq FDG 的 0.9% NaCl 溶液）。随后用 0.9 ml 0.9% NaCl 溶液冲洗导管。
  3. 将大鼠置于固定装置中，不施加麻醉，直至开始扫描；并通过每小时一次的静脉注射 1 ml 0.9% NaCl 溶液对动物进行水化。
  4. 在扫描开始前立即使用 2% 异氟烷重新麻醉大鼠。
  5. 将麻醉后的大鼠置于基于高分辨率多丝室的动物 PET 成像系统 quadHIDAC（Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, UK）中。该 PET 扫描仪的空间分辨率为 1.0 mm，在整个视场范围内保持恒定（直径 165 mm，轴向长度 280 mm）。使用直肠温度传感器在扫描期间监测并控制体温，并通过脉搏血氧仪调控麻醉状态。
  6. 在 FDG 注射后 180 分钟开始进行为期 60 分钟的动态采集，以减少因 FDG 经肾脏排泄所致的示踪剂在肾脏中的积聚。
  7. 静脉注射 5 MBq 18F-氟化物，并在注射 18F-氟化物后立即进行另一项为期 60 分钟的 PET 扫描，扫描过程中不移动大鼠在扫描仪中的位置，以识别肾实质并计算 18F-清除率5。对两次扫描的图像均进行重建。在 18F-氟化物注射后 2 分钟（灌注期）于重建图像上手动勾画肾皮质区域的感兴趣体积（VOI），并将该 VOI 转移至 FDG 图像。需仔细排除肾盂部分。对两次扫描的图像进行重建，并在重建图像上手动勾画肾皮质周围的感兴趣体积（VOI）。列表模式数据被重建为体素尺寸为 0.4 × 0.4 × 0.4 mm3 的图像。需仔细排除肾盂部分。
  8. 通过总计数与体积的比值计算 FDG 摄取量，并计算注射剂量的百分比（%ID）。我们使用 MATLAB（版本 R2011b，MathWorks，Natick，MA，USA）和断层成像软件（TIM）版本 2.8 进行图像分析。

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结果

组织学

在急性排斥反应（AR）过程中，i.e. 主要是T淋巴细胞被募集至移植物内，而排斥反应的严重程度则通过炎症程度来反映。在本图所示的过碘酸-希夫（PAS）染色中（Figure 1），肾移植移植物显示出明显的急性排斥反应组织学特征，包括肾小球炎、小管炎、内皮炎以及移植物浸润（Figure 1，aTX POD4）（POD = 术后天数），而对照的原生肾脏中则未见排斥反应征象（Figure 1，CTR）。移植物浸润细胞为高代谢活性细胞，可消耗大量葡萄糖。然而，若以氟代脱氧葡萄糖（FDG）替代葡萄糖，则其将在细胞内积聚，并可通过正电子发射断层扫描（PET）进行检测与定量。

PET 图像

同种异体移植大鼠尾静脉注射30 MBq FDG后的一系列动态全身PET图像（最大后验MAP投影，注射后180分钟）（图2）。FDG呈典型分布，脑、心、骨...

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讨论

FDG-PET 成像是一种用于诊断急性排斥反应的新方法。由于其具有无创性和特异性，与传统的穿刺活检诊断相比，FDG-PET 具有明显优势。与活检取样量有限不同，FDG-PET 可对整个移植物进行全面分析。此外，该方法可用于正在接受抗凝治疗的患者，并可重复进行 PET 检测，例如用于监测治疗效果4。另外，我们此前已证实，两种主要的急性排斥反应鉴别诊断——即由缺血再灌注损伤引起的急性肾小管坏死和急性钙调磷酸酶抑制剂毒性——均可通过 FDG-PET 与急性排斥反应相区分3。由于 FDG-PET 成像所需的放射性活度相对较低，且对移植患者和/或肾功能受损患者进行成像并不增加严重并发症的风险，因此该方法可轻松应用于日常临床实践。

然而，必须注意的是，FDG 是一种特异性较低的示踪剂，用于评估局部代谢活性。因此，移植物感染或肿瘤也可能导致假阳性结果。在评估肾实质 FDG 摄取时，FDG 排入肾盂可能构成干扰。为此，我们选择在注射后三小时进行晚期显像，以减少因 FDG 经肾脏排泄所致的肾脏内示踪剂蓄积。此外，在定量肾组织 FDG 摄取...

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致谢

本工作由德国研究基金会（德意志研究联合会，SFB 656，德国明斯特，项目C7和C6）以及明斯特IZKF（核心单元SmAP）提供资助。作者衷心感谢Truc Van Le、Anne Kanzog、Ute Neugebauer、Wiebke Gottschlich和Roman Priebe提供的出色技术协助，以及Daniel Burkert和Sven Fatum在放射性示踪剂制备方面的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
Mathieu持针器 - 14 cmFine Science Tools12010-14
Castroviejo显微持针器 - 9 cmFine Science Tools12061-01
手术剪 - 尖钝型Fine Science Tools14001-12
虹膜剪 - ToughCut直型 11.5 cmFine Science Tools14058-11
学生用Vannas弹簧剪Fine Science Tools91500-09
Vannas弹簧剪 - 3 mm刀头Fine Science Tools15000-00
学生用组织镊 - 1×2齿 12 cmFine Science Tools91121-12
Dumont SS-45镊子 - Inox MedicalFine Science Tools11203-25
带锁扣的微型止血夹施夹器Fine Science Tools18056-14
微型止血夹 6 mm × 1 mmFine Science Tools18055-03
微型止血夹 4 mm × 0.75 mmFine Science Tools18055-04
试剂
异氟烷（例如 Forene 100% v/v）Abott
皮肤消毒剂（例如 Octeniderm）Schülke
聚维酮碘（例如 Betaisodona）Mundipharma
眼用软膏（例如 Bepanthen）Bayer
丁丙诺啡（例如 Temgesic）RB Pharmaceuticals
HTK灌注液（例如 CUSTODIOL HTK）Dr. Franz Köhler Chemie
外科缝线 Mersilene 0号EthiconEH6665E
外科缝线 Mersilene 4-0号EthiconEH6732H
外科缝线 Prolene 6-0号Ethicon8697H
外科缝线 Ethilon 9-0号Ethicon2809G
外科丝线 5-0号Vömel14739
套管针（例如 Microlance 3, 27G ¾）BD302200

参考文献

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  10. Reuter, S., Velic, A., Edemir, B., Schröter, R., Pavenstädt, H., Gabriëls, G., Bleich, M., Schlatter, E. Protective role of NHE-3 inhibition in rat renal transplantation undergoing acute rejection. Pflugers Arch. 456, 1075-1084 (2008).

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