我们正在描述一种从用于血浆/血清学检测的全血样本中分离基因组DNA的新方法。在采集血浆后，通常会丢弃剩余的浓缩血液。我们的新方法相较于现有技术具有显著改进，可在单次采血后同时获得DNA和血浆，无需额外采集血液样本。
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摘要
摘要
血液的细胞成分或液体成分均可用于实验室检测。使用不同的采血管可决定所分析的血液成分类型（全血、血浆或血清）。研究人类疾病遗传基础的实验室通常以含EDTA的真空采血管采集的抗凝全血作为遗传学/基因组学分析的DNA来源。由于大多数临床实验室在表型结果研究中，首先进行生化、血清学和病毒学检测，因此也会使用含肝素的采血管（血浆管）采集抗凝血液。因此，当需要同时平行分析基因组和蛋白质组数据而获取DNA和血浆时，通常会分别采集EDTA管和肝素管的血液样本。如果能够使用单一采血管采集血液，并同时用于血浆和DNA的提取，则该方法将优于现有方法。在提取血浆后，利用剩余的浓缩血细胞作为基因组DNA的替代来源，可减少处理的血样量，降低每位患者所需的采血次数，最终节省时间和资源。
BD P100 血液采集系统用于血浆蛋白保存，是对以往血浆或血清采集管的改进方法1，旨在稳定血液中的蛋白质成分，从而更有利于从人血中发现蛋白质生物标志物并开展蛋白质组学实验。BD P100 采血管含有 15.8 ml 喷雾干燥的 K2EDTA 以及冻干的专有广谱蛋白酶抑制剂混合物，以防止血液凝固并稳定血浆蛋白。此外，该采血管还包含一种机械分离器，在离心后可在血浆与细胞沉淀之间形成物理屏障。目前已有少数方法用于从旧式血浆管中采集的凝血样本中提取 DNA2-4。这些方法面临的主要挑战与管内分离材料的类型（凝胶分离剂）有关，包括难以回收凝固的血液、破碎或分散血块操作不便，以及分离凝胶阻碍血块提取等问题。
我们介绍了首个从BD P100新型采血管中提取并纯化基因组DNA的方法。我们将P100管中获得的DNA样本质量与EDTA管中的样本进行了比较。该方法简单高效，主要包括以下四个步骤：1）使用带有机械分离器的血浆采集管BD P100（BD Diagnostics，美国马里兰州斯帕克斯）进行血液采集；2）利用蔗糖溶液与无菌回形针金属钩的组合去除机械分离器；3）分离含有白细胞的白膜层；4）采用常规商用DNA提取试剂盒或类似的标准方案，从白膜层中提取基因组DNA。
方案
1. 样本采集
- 在获得受试者充分知情同意后，采集其血液样本。每位受试者使用 P100 管（BD Diagnostics，Franklin Lake，NY，USA）采集 4 至 5 ml 血液。为便于比较，同时使用 EDTA 管采集血液。
- BD P100 管内含 15.8 ml 喷雾干燥的 K2EDTA 以及冻干的广谱蛋白酶抑制剂专有混合物，用于防止血液凝固并稳定血浆蛋白。管内还含有机械分离层。采集全血后，将两种采血管在室温下放置 60 分钟至过夜，直至进行后续处理。
- 将 BD P100 管在室温下以 2,500 g 离心 15 分钟。将机械分离层上方的血浆转移至微量离心管中。
- 将含有分离层下方压缩血液的 P100 管于 -80 °C 保存，直至开始进行 DNA 提取。
2.1 从 P100 管血液中提取（P100_DNA）
- 血浆提取后，将 P100 管保存在 -80 °C 条件下。在 3 至 4 个月内，从冰箱中取出含有压缩血液的 P100 管，在 37 °C 水浴中解冻 5 分钟（图 1A）。去除位于分离层上方的任何残留血浆。在 P100 管的分离层上方加入 2 ml 17% 蔗糖溶液（实验室内部测试的梯度溶液——未发表数据）（图 1B）。在室温下以 2,500 g 离心 20 分钟；此过程将机械分离层推至管顶，并形成包含白膜层在内的三层溶液（图 1C）。使用无菌的弯头金属回形针手动取出分离层（图 1D）。
- 从每根管中取出机械分离层后（图 1D），移除并弃去上层的蔗糖溶液。将中间层（即白膜层，BC 层）转移至一支无菌的 15 ml 锥形管中。加入磷酸盐缓冲液（PBS）使白膜层体积达到 3 ml。使用 Qiagen Puregene 血液试剂盒中的试剂，按照制造商推荐的方法提取白膜层中的 DNA；但离心速度采用 2,500 g（而非 2,000 g）。
- 为裂解并去除红细胞（RBC），向 3 ml 白膜层中加入 9 ml 红细胞裂解液。轻轻颠倒混匀各管数次，在室温下孵育 10 分钟，期间偶尔轻柔颠倒。在 2,500 g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。向每管中残留的沉淀加入 3 ml 细胞裂解液，涡旋振荡 15 秒。再加入 1 ml 蛋白沉淀液，涡旋振荡 15 秒。
- 在 2,500 g 条件下离心 5 分钟，将上清液转移至另一支含有 3 ml 100% 异丙醇的新鲜 15 ml 锥形管中。将新管颠倒 10 次，然后在 2,500 g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，加入 1 ml 70% 乙醇。轻轻颠倒锥形管数次，以松动并清洗 DNA 沉淀。在 2,500 g 条件下离心 1 分钟。将沉淀在室温下干燥 3 分钟（将管倒置），然后加入 250 µl 重悬溶液，在 37 °C 下孵育 10 分钟以溶解 DNA，随后转移至预先标记的 1.7 ml 微量离心管中。将管保存在 -80 °C，直至使用。
2.2 从EDTA抗凝管血液中提取DNA（EDTA_DNA）
- 用于常规免疫血液学检测的全血采集于喷雾涂有10.8 mg K2EDTA的塑料真空采血管中，并储存于-80 °C。由于这些试管不含机械分离装置，因此DNA提取过程不包括涉及机械分离的步骤（2.1.1和2.1.2）。
- 在血液储存后3至4个月内，使用KingFisher Flex（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行DNA提取。该系统是一种基于磁性颗粒技术的自动化DNA提取系统，包括细胞裂解/DNA结合、多次洗涤步骤以及DNA洗脱。
- DNA提取所用试剂盒为KingFisher Flex 24 DNA Blood kit（Qiagen, Germany）。
3. DNA 定量与质量评估
通过PicoGreen法、光谱学和电泳相结合的方法，对基因组DNA的数量、质量和完整性进行了评估。
- 基因组DNA的浓度通过Nanodrop和Picogreen定量法测定。
- 纯度通过Nanodrop分光光度计测得的260/280比值确定。
- 取500 ng样品上样至1%琼脂糖凝胶，以评估DNA的完整性（降解情况）。
4. 基因分型检测与质量控制
- 随机选取五个 P100_DNA 及其对应的 EDTA_DNA 样本，使用定制的 Immunochip（Immuno DNA 分析微珠芯片）进行进一步分析。Immunochip 是一种 Infinium 基因分型芯片，包含 196,524 个多位点基因多态性位点，专为免疫遗传学研究设计5。
- 对于每个样本，取 200 ng DNA 进行扩增、片段化、沉淀，并重悬于适当的杂交缓冲液中。
- 变性后的样本在 48 °C 下与 Immunochip 杂交，时间不少于 16 小时。
- 杂交完成后，对 Immunochip 进行单碱基延伸反应并染色处理。
- 随后使用 Illumina Hiscan 微珠阵列扫描仪对 Immunochip 进行成像，并将标准化的微珠信号强度数据导入 Illumina GenomeStudio 软件，转换为基因型。基因型的判读采用 GenomeStudio 的自动判读算法。质量控制包括剔除基因分型成功率 <95% 的单核苷酸多态性（SNP）位点。
- SNP 分型成功率用于评估 Immunochip 检测的效率，其计算方式为：芯片上所有检测位点（每张芯片编码 196,524 个 SNP）中，获得足够信号强度和质量以完成自动化基因型判读的位点所占百分比。高质量 DNA（A260/A280 比值 ≥1.8 且无降解）预期应达到与 Immunochip 检测中所含 HapMap 对照 DNA 相当或更高的分型成功率。质量控制要求在每套数据集中剔除分型成功率 <95% 的 SNP 位点。
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结果
DNA 质量评估与浓度测定
P100_DNA 的得率显著低于 EDTA_DNA（表 1 和 表 2）。P100_DNA 和 EDTA_DNA 样本组的 DNA 纯度（以 260/280 比值表示）相似（表 1 和 表 2）。每组样本内的 DNA 质量相对均一，尽管在 EDTA_DNA 样本中可见一定程度的降解，表现为轻微拖尾（图 2）。表现出更明显降解迹象的 EDTA_DNA 样本其 DNA 浓度也有所降低。
基因分型
比较了EDTA_DNAs和P100_DNAs的基因分型检出率。两者均表现出相似的检出率，且均与内部HapMap对照DNA相当（表3）。
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讨论
许多人类疾病具有遗传因素，探索人类疾病的遗传基础需要越来越多的高质量DNA。遗传学研究中最常用的DNA来源是抗凝全血。由于大多数临床实验室在表型结果调查中首先进行生化、血清学和病毒学检测，血液通常被采集到血浆管中。在血浆采集完成后，剩余的压缩血液通常会被丢弃。因此，当需要进行遗传学研究或检测DNA时，必须对同一患者再次采血。而这些被丢弃的压缩血液实际上是一种潜在的DNA来源，因为其中含有白细胞。因此，利用血浆管中的压缩血液可以更高效地使用已采集的血样，无需额外采血或召回患者进行二次抽血。
已有多种方法用于从凝固或凝块血液的白细胞中提取DNA6-10。这些方法的大多数挑战与血浆采集管的设计有关。早期的血浆采集管含有由凝胶制成的分离层（凝胶分离层），在离心后形成屏障，将血细胞（位于分离层下方）与血浆（位于分离层上方）分隔开。为防止血细胞被凝胶材料污染，必须首先小心地将分离层从采集管中移除11。随后需对血凝块进行破碎，以确保高效提取DNA。然而，破碎过程常导致血液样本显著损失，并降低DNA得率。为减少样本损失并优化操作流程，曾采用小孔径滤网通过...
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD P100 管 | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA 管 | BD Diagnostics | 367863 | |
| 蔗糖 | Sigma | S9378 | |
| 回形针 | 办公用品 | ||
| 15 ml 管 | Corning | 430052 | |
| 红细胞 (RBC) | Qiagen | 158389 (试剂盒) | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA 血液试剂盒 (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml 微量离心管 | Axygen | MCT-175-C | |
| 人类免疫 DNA 分析微珠芯片试剂盒 | Illumina | WG-352-1001 | |
| 微珠阵列读取仪 | Illumina | NA | |
| GenomeStudio 软件 | Illumina | N/A |
参考文献
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