本文介绍了一种可模拟的方法 体内 发育 果蝇 蕈体在其中 离体 培养系统
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摘要
摘要
我们介绍了一种对完整 Drosophila 大脑进行 ex vivo 培养的方法。该方法可用于与长期遗传操作相对照，通过实现急性药物干预和对细胞过程的活体成像，研究中枢脑结构的细胞生物学与发育过程。作为该技术的一个示例，本实验室先前的研究1表明，在 Drosophila 中枢脑神经元的轴突中，轴突区与胞体-树突区之间存在一个此前未被识别的亚细胞区室。这一被称为轴突起始段（AIS）2的区室的发育，已通过遗传学手段证实依赖于神经元特异性的周期蛋白依赖性激酶 Cdk5。本文中我们显示，对野生型 Drosophila 幼虫大脑进行 ex vivo 处理，使用 Cdk5 特异性药理学抑制剂 roscovitine 和 olomoucine3，可导致肌动蛋白组织结构以及细胞表面蛋白 Fasciclin 2 定位的急性改变，这些变化与在遗传上缺失 Cdk5 活性的突变体中观察到的现象相似。
第二个ex vivo培养技术的示例用于研究果蝇从幼虫到成虫的变态过程中，胚胎期蘑菇体（MB）γ神经元连接的重塑。蘑菇体是果蝇嗅觉学习与记忆的中枢4，这些γ神经元在蛹期发育过程中会修剪其轴突和树突分支，随后在较晚的时间点重新延伸分支，以建立成体的神经支配模式5。研究表明，MB中这些神经元的修剪通过神经突分支的局部退化实现6，该过程由蜕皮激素（一种类固醇激素）通过蜕皮激素受体B1触发7，并依赖泛素-蛋白酶体系统的活性6。我们的ex vivo培养方法可用于进一步探究发育重塑的机制。我们发现，在ex vivo培养条件下，MB的γ神经元重现了发育性修剪过程，其时间进程与in vivo情况相似。然而，必须等到蛹壳形成后1.5小时再取出组织，以确保细胞不可逆地进入变态过程；若在蛹化起始时即进行解剖，则培养中几乎不发生或完全不发生变态。因此，经过适当改进后，ex vivo培养方法可用于研究中枢脑生物学中的动态过程以及稳态特征。
方案
A. 培养基的制备
- 通过滤膜除菌制备完全培养基：在 Schneider's Drosophila 培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素。
- 培养基应每次新鲜配制。或者，每次使用前可解冻一份预先分装冷冻的培养基。
- 接种培养前，向培养基中加入 10 μg/ml 胰岛素和 2 μg/ml 蜕皮激素。药物配制成高浓度储备液后，分装冷冻保存。解冻后的分装液不得再次冷冻。
- 所有工作液应保持在 25 °C。
幼虫大脑的培养
1. 幼虫大脑的选取与解剖
- 向12 mm Millicell细胞培养插件中加入500 μl培养基。解剖所得脑组织将置于这些插件中，以便于进行免疫染色。
- 向解剖用表面皿中加入少量制备好的培养基。
- 使用小解剖铲挑取游走期三龄幼虫，并将其放入表面皿中。（我们假定 离体 培养方法同样适用于一龄或二龄幼虫，但我们尚未对此进行测试。
- 用一对镊子夹住幼虫的后端，用另一把#5号镊子小心地打开其前端。
- 迅速解剖出脑组织，同时保持腹神经索完整。
2. 离体 分离幼虫大脑的培养
- 使用预先....
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讨论
对组织结构和功能进行长期的遗传操作（包括基因突变和外源基因表达）通常会产生即时效应与晚期间接后果的复合表现，二者往往难以区分。将遗传学方法与药理学手段相结合，有助于解析表型背后的时间进程。例如，该策略已被成功用于解析不同细胞骨架组分在黑腹果蝇（Drosophila）精子发生过程中的作用10。在本研究示例中，该方法使我们得以证明，Cdk5 在维持黑腹果蝇（Drosophila）轴突起始段（AIS）结构方面具有持续性需求。在其他实验中，我们还成功使用了靶向其他细胞组分的药物，包括蛋白激酶（伊马替尼，imatinib）、肌动蛋白聚合（细胞松弛素，cytochalasin；拉帕酮，latrunculin；夹竹桃霉素，jasplakinolide）以及微管（长春碱，vinblastine；紫杉醇，taxol）。
离体 培养方法还可实现对发育过程动态的高分辨率分析。既往研究已报道了对中枢脑的短期活体成像 11，或对神经系统其他部位（如胸神经节）进行更长期的成像 12 以及.......
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致谢
我们感谢实验室所有成员在稿件撰写过程中提供的建议、有益的讨论和意见。我们尤其感谢 Marta Koch 和 Bassem Hassan 提出的宝贵建议，即在重塑实验中培养脑组织时，应等待 1.5 小时 APF 后再进行脑解剖。我们还感谢 NHGRI 成像设施为我们提供共聚焦显微镜的使用权限。本研究由 NIH 国家神经疾病与中风研究所（NINDS）院内研究计划的基础神经科学项目（Z01 NS003106）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斯氏果蝇培养基 | Invitrogen | 21720-024 | |
| 胎牛血清（热灭活） | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| 胰岛素 | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| 蜕皮激素 | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| 罗斯可维汀 | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| 奥洛莫星 | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| 吐温-100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell 细胞培养小室 | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| 多孔培养皿，4 孔 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5M |
参考文献
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al.
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