本文介绍了一种可模拟的方法 体内 发育 果蝇 蕈体在其中 离体 培养系统
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摘要
摘要
我们介绍了一种对完整 Drosophila 大脑进行 ex vivo 培养的方法。该方法可用于与长期遗传操作相对照，通过实现急性药物干预和对细胞过程的活体成像，研究中枢脑结构的细胞生物学与发育过程。作为该技术的一个示例，本实验室先前的研究1表明，在 Drosophila 中枢脑神经元的轴突中，轴突区与胞体-树突区之间存在一个此前未被识别的亚细胞区室。这一被称为轴突起始段（AIS）2的区室的发育，已通过遗传学手段证实依赖于神经元特异性的周期蛋白依赖性激酶 Cdk5。本文中我们显示，对野生型 Drosophila 幼虫大脑进行 ex vivo 处理，使用 Cdk5 特异性药理学抑制剂 roscovitine 和 olomoucine3，可导致肌动蛋白组织结构以及细胞表面蛋白 Fasciclin 2 定位的急性改变，这些变化与在遗传上缺失 Cdk5 活性的突变体中观察到的现象相似。
第二个ex vivo培养技术的示例用于研究果蝇从幼虫到成虫的变态过程中，胚胎期蘑菇体（MB）γ神经元连接的重塑。蘑菇体是果蝇嗅觉学习与记忆的中枢4，这些γ神经元在蛹期发育过程中会修剪其轴突和树突分支，随后在较晚的时间点重新延伸分支，以建立成体的神经支配模式5。研究表明，MB中这些神经元的修剪通过神经突分支的局部退化实现6，该过程由蜕皮激素（一种类固醇激素）通过蜕皮激素受体B1触发7，并依赖泛素-蛋白酶体系统的活性6。我们的ex vivo培养方法可用于进一步探究发育重塑的机制。我们发现，在ex vivo培养条件下，MB的γ神经元重现了发育性修剪过程，其时间进程与in vivo情况相似。然而，必须等到蛹壳形成后1.5小时再取出组织，以确保细胞不可逆地进入变态过程；若在蛹化起始时即进行解剖，则培养中几乎不发生或完全不发生变态。因此，经过适当改进后，ex vivo培养方法可用于研究中枢脑生物学中的动态过程以及稳态特征。
方案
A. 培养基的制备
- 通过滤膜除菌制备完全培养基：在 Schneider's Drosophila 培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素。
- 培养基应每次新鲜配制。或者，每次使用前可解冻一份预先分装冷冻的培养基。
- 接种培养前，向培养基中加入 10 μg/ml 胰岛素和 2 μg/ml 蜕皮激素。药物配制成高浓度储备液后，分装冷冻保存。解冻后的分装液不得再次冷冻。
- 所有工作液应保持在 25 °C。
幼虫大脑的培养
1. 幼虫大脑的选取与解剖
- 向12 mm Millicell细胞培养插件中加入500 μl培养基。解剖所得脑组织将置于这些插件中，以便于进行免疫染色。
- 向解剖用表面皿中加入少量制备好的培养基。
- 使用小解剖铲挑取游走期三龄幼虫，并将其放入表面皿中。（我们假定 离体 培养方法同样适用于一龄或二龄幼虫，但我们尚未对此进行测试。
- 用一对镊子夹住幼虫的后端，用另一把#5号镊子小心地打开其前端。
- 迅速解剖出脑组织，同时保持腹神经索完整。
2. 离体 分离幼虫大脑的培养
- 使用预先润湿的移液枪头，将脑组织小心转移至已加入培养基的细胞培养小室中。
- 将脑组织连同培养基一起置于25 °C培养箱中，培养至所需时间点。该方法在体外培养中可有效维持长达48小时。
- 在8小时时更换培养基；此后每5–6小时更换一半培养基。
3. 幼虫大脑的药理学操控
这种ex vivo培养方法可用于在药理学层面验证此前在本实验室已证实的遗传相互作用1。
- 向准备好的培养基中加入 100 μM roscovitine 和 100 μM olomoucine。
- 将解剖得到的脑组织转移至该培养基中。
- 在 25 °C 条件下培养脑组织 24 小时。
- 在 8 小时时更换培养基；此后每 5–6 小时更换一半培养基（含药物）。
蛹脑的培养
1. 选择用于解剖的蛹
- 在瓶子/小瓶上标记白色蛹。
- 仅选择完全呈白色的蛹。任何带有颜色的蛹均不应选用。
- 此阶段为蛹壳形成后0小时（APF）。
- 这些蛹在标记后1.5小时即可用于解剖。此步骤至关重要，以确保发育性修剪正常发生 离体 培养。
2. 蛹的解剖
- 向12 mm的Millicell细胞培养插件中加入500 μl培养基。（解剖后的脑组织将置于这些插件中，以便于进行免疫染色。）
- 当达到所需时间点后，向解剖用表面皿中加入少量已准备好的培养基。
- 使用湿润的小刮勺，挑取先前标记好用于解剖的蛹，并将其放入表面皿中。
- 用一对镊子夹住蛹的后端，再用另一对#5镊子小心地打开蛹壳的前端。
- 迅速解剖出脑组织，保持腹神经索完整并连接在脑组织上。
3. 离体 解剖蛹脑的培养
- 小心地将脑组织转移至已预先加入培养基的细胞培养插件中。
- 将脑组织连同培养基一起转移至25 °C的培养箱中，直至达到所需的时间点。本实验中我们使用该方法在培养条件下最长观察了10小时，但可根据需要延长观察和处理时间。
- 对于羽化后8小时以上的观察时间点，每5–6小时更换一次培养基。
从这一步开始，幼虫和蛹的实验步骤保持不变。
B. 固定解剖后的脑组织
- 达到所需时间点后，移除培养基，加入500 μl含0.5% Triton X-100的1×PBS中4%多聚甲醛（PBST），固定30分钟，并在15分钟后更换新鲜的多聚甲醛溶液。
- 更换固定液时，务必防止脑组织干燥。
- 用含0.5% Triton X-100的1×PBS（PBST）清洗四次，每次10分钟，以彻底去除多聚甲醛。
C. 固定脑组织的染色
- 甲醛去除后，将脑组织在含有1%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白的1x PBS封闭液中封闭1小时。
- 加入用封闭液配制的一抗。
- 4 °C下孵育脑组织过夜。
- 次日上午，用PBST缓冲液进行四次、每次10分钟的洗涤，以去除一抗。
- 加入用封闭液配制的二抗。
- 室温孵育4小时。
- 用PBST缓冲液进行四次、每次10分钟的洗涤，以去除二抗。
D. 显微镜观察用固定和染色脑组织的封片
- 将脑组织在Vectashield封片剂中平衡1小时。
- 使用Vectashield封片剂将脑组织置于载玻片上。
- 在盖玻片覆盖前，于脑组织两侧放置玻璃碎片。此举可防止脑组织被压碎，同时保持样品足够薄，以便使用共聚焦显微镜扫描所有焦平面。封片时大致调整脑组织的方向，以利于观察目标结构。必要时，使用Imaris软件旋转脑图像，以获得最佳的记录和测量视角。
- 用透明指甲油密封盖玻片。
- 将载玻片避光保存。
E. 代表性结果
图1展示了（A）野生型果蝇和（B）表达Cdk5显性负性突变体（Cdk5DN）（Connell-Crowley 等，2000）的三龄幼虫大脑图像。两者均在MB γ神经元中表达肌动蛋白-GFP（绿色）。如先前所述（Trunova 等，2011），野生型γ神经元近端轴突中存在一个区域无法积累肌动蛋白-GFP，因此呈现为“透明区”（A，方括号所示），而fasciclin 2蛋白（红色）仅积累至该区域的腹侧边界（白色水平线）。图1(A)第三幅图中的虚线标示了蘑菇体（MB）的位置，突出显示了肌动蛋白“透明区”及其腹侧边界。在表达Cdk5DN的果蝇中，肌动蛋白透明区消失（B），且fasciclin 2（FasII）免疫反应信号穿过该区域向背侧扩散。（注意：部分FasII阳性轴突以不同数量水平投射穿过MB；这些结构与表型无关。）标尺代表20 μm。
利用我们的离体（ex vivo）培养方法，我们用roskovitine和olomoucine联合处理野生型果蝇，这两种化合物是Cdk5活性的药理学抑制剂。图2展示了对照组（A）和药物处理组（B）野生型果蝇三龄幼虫大脑的图像。与表达显性失活Cdk5构建体的果蝇类似，经Cdk5抑制剂处理24小时的大脑表现出肌动蛋白清晰区的特征性丧失以及FasII边界的偏移（方括号所示）。白色线条表示野生型FasII边界的正常位置。比例尺为20 μm。
图3 展示了一组具有代表性的系列 果蝇 0-10 小时龄蛹期的蘑菇体，标记有膜定位的 mCD8-GFP（绿色）。方括号指示的是蕈体的萼区，即蘑菇体神经元的树突投射区域。在变态开始之前，可见蘑菇体轴突以粗大束状沿背腹方向走行，同时可见来自致密树突分支的荧光信号“晕状”分布（方括号所示）。图 A 显示了在指定时间点解剖获得的大脑样本。注意方括号所示区域中树突发生修剪，因此到 6-8 小时龄蛹期时，树突的晕状荧光信号已消失（而轴突信号未受影响）。图 B 中的大脑样本于 0 小时龄蛹期解剖获得，即在内源蜕皮激素激增之前（Truman 和 Riddiford，2002），随后进行体外培养 离体 如所示，这些结果显示树突未发生发育性修剪；相反，树突信号在羽化后10小时（10 hrs APF）仍然持续存在。为避免此问题，蛹在羽化后0小时（0 hrs APF）进行标记，但在羽化后1.5小时（1.5 hrs APF）解剖并进行培养。图C展示了一系列代表性结果 果蝇 0-10小时羽化后（APF）的蘑菇体。与未培养样本相同，到8小时APF时，树突信号无法检测到。比例尺为20 μm。
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讨论
对组织结构和功能进行长期的遗传操作（包括基因突变和外源基因表达）通常会产生即时效应与晚期间接后果的复合表现，二者往往难以区分。将遗传学方法与药理学手段相结合，有助于解析表型背后的时间进程。例如，该策略已被成功用于解析不同细胞骨架组分在黑腹果蝇（Drosophila）精子发生过程中的作用10。在本研究示例中，该方法使我们得以证明，Cdk5 在维持黑腹果蝇（Drosophila）轴突起始段（AIS）结构方面具有持续性需求。在其他实验中，我们还成功使用了靶向其他细胞组分的药物，包括蛋白激酶（伊马替尼，imatinib）、肌动蛋白聚合（细胞松弛素，cytochalasin；拉帕酮，latrunculin；夹竹桃霉素，jasplakinolide）以及微管（长春碱，vinblastine；紫杉醇，taxol）。
离体 培养方法还可实现对发育过程动态的高分辨率分析。既往研究已报道了对中枢脑的短期活体成像 11，或对神经系统其他部位（如胸神经节）进行更长期的成像 12 以及...
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致谢
我们感谢实验室所有成员在稿件撰写过程中提供的建议、有益的讨论和意见。我们尤其感谢 Marta Koch 和 Bassem Hassan 提出的宝贵建议，即在重塑实验中培养脑组织时，应等待 1.5 小时 APF 后再进行脑解剖。我们还感谢 NHGRI 成像设施为我们提供共聚焦显微镜的使用权限。本研究由 NIH 国家神经疾病与中风研究所（NINDS）院内研究计划的基础神经科学项目（Z01 NS003106）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斯氏果蝇培养基 | Invitrogen | 21720-024 | |
| 胎牛血清（热灭活） | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| 胰岛素 | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| 蜕皮激素 | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| 罗斯可维汀 | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| 奥洛莫星 | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| 吐温-100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell 细胞培养小室 | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| 多孔培养皿，4 孔 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5M |
参考文献
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
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- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).
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