原代人胎儿脑来源的多能性前体细胞增殖 体外 在维持向神经元和星形胶质细胞分化潜能的同时，本研究显示，通过特定生长因子的诱导，可促使神经前体细胞经历少突胶质细胞系的各个分化阶段。
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摘要
摘要
将人类神经前体细胞分化为神经元和胶质细胞类型，为研究和比较神经细胞谱系发育的分子调控机制提供了模型。体外扩增来自胎儿中枢神经系统组织的神经前体细胞已有充分表征。尽管已成功鉴定并分离出成年中国人脑皮层下白质中的胶质前体细胞，并建立了多种培养条件以引导胎儿神经前体细胞向产生髓鞘的少突胶质细胞分化，但获得足量适用于体外实验的人类少突胶质细胞仍然困难。已有研究利用妊娠中期胎儿脑组织实现了从神经前体细胞分化出半乳糖脑苷脂阳性（GalC+）和O4+的少突胶质细胞前体或祖细胞（OPC）。然而，这些细胞在缺乏星形胶质细胞和神经元等支持细胞的情况下无法增殖，并且在培养过程中会随时间迅速丢失。目前仍亟需建立一种能够生成适用于体外实验的少突胶质细胞谱系细胞的培养体系。
原代人少突胶质细胞的培养可作为研究嗜神经性传染因子（如人多瘤病毒JCV）致病机制的有用模型，该病毒在体内感染此类细胞。 在体内 感染这些细胞。这些培养的细胞也可为中枢神经系统（CNS）其他脱髓鞘疾病提供模型。原代人胎儿脑来源的多能神经前体细胞可在体外增殖 体外 在维持向神经元（前体细胞来源的神经元，PDN）和星形胶质细胞（前体细胞来源的星形胶质细胞，PDA）分化潜能的同时，本研究表明神经前体细胞可被诱导经历少突胶质细胞系发育的多个阶段（前体细胞来源的少突胶质细胞，PDO）。我们将神经前体细胞培养于添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子（PDGF-AA）、Sonic hedgehog（Shh）、神经营养因子3（NT-3）、N-2和三碘甲状腺原氨酸（T3）的DMEM-F12无血清培养基中。培养细胞约每七天传代一次，接种密度为每75 cm²培养瓶2.5×10⁶个细胞。在这些条件下，培养物中大多数细胞保持突起较少的形态，并表达前少突胶质细胞标志物，如A2B5和O-4。当去除四种生长因子（GF）（bFGF、PDGF-AA、Shh、NT-3）并加入PDN的条件培养基后，细胞开始长出更多突起，并表达少突胶质细胞分化的特异性标志物，如半乳糖脑苷脂（GalC）和髓鞘碱性蛋白（MBP）。我们采用多色流式细胞术进行表型鉴定，以识别少突胶质细胞的独特标志物。
方案
注意：神经前体细胞及少突胶质细胞系细胞的常规培养需在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中进行。每2天更换一次培养基，若细胞融合度为40–70%，则更换50%至100%的新鲜培养基。当细胞接近融合时，通常按每周一次的频率以每T75培养瓶2–2.5×10⁶细胞的密度进行传代。
1. 准备受涂布的培养瓶
- 准备包被培养瓶时，将5 mg多聚-D-赖氨酸（PDL）溶于100 ml去离子水（DI-water）中，随后用50 ml该溶液包被T75培养瓶 μg/ml 的 PDL，室温（RT）避光孵育。1 小时后½ 小时，吸除 PDL，用去离子水冲洗烧瓶一次。在接种细胞前让烧瓶自然干燥（表1).
2. 启动神经前体细胞向祖细胞来源的少突胶质细胞（PDO）分化
分离人中枢神经系统（CNS）前体细胞的方案已在先前的出版物中描述，本方案不包含该步骤1。人CNS前体细胞来源于符合美国国立卫生研究院（NIH）指南获取的8周孕龄胎儿端脑组织。
- 将多能性神经祖细胞群体培养于经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养瓶中，使用添加了25 ng/ml bFGF和20 ng/ml表皮生长因子（EGF）的Neurobasal培养基（图1A）。若传代次数超过第11代（p11），则不应使用。
- 当细胞培养至约70%融合时，开始诱导神经祖细胞分化。
- 使用无血清DMEM/HAMS F12 1:1培养基配制完全分化培养基，该培养基需添加牛血清白蛋白、L-谷氨酰胺、庆大霉素、N2组分、T3、Shh、NT-3、bFGF和PDGF-AA（表1）。此培养基定义为含生长因子的少突胶质细胞培养基（oligo medium + GF）。
- 从培养瓶中移除祖细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞一次，然后加入含生长因子的少突胶质细胞培养基（oligo medium + GF，详见步骤3）以启动少突胶质细胞分化。仅有承诺进入少突胶质细胞谱系的细胞能够生长（图1B）。在此培养基中继续培养细胞3周。
- 每周当细胞达到90–95%融合时，使用胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.1%）进行传代（T75培养瓶使用4 ml）。将待传代细胞的全部培养基转移至一个50 ml锥形管中；该条件培养基将用于中和胰蛋白酶活性。注意避免细胞干燥，然后加入胰蛋白酶。
- 在室温下将细胞与胰蛋白酶共同孵育5分钟，并轻轻敲击培养瓶数次以促进细胞脱落。
- 向含有脱落细胞的培养瓶中加入4–5 ml条件培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 将培养基与细胞转移至同一50 ml锥形管中，在室温下以1,200 rpm（约300 × g）离心5分钟。
- 吸除上清液，通过轻柔倾斜管壁重悬细胞沉淀，然后加入新鲜的含生长因子的少突胶质细胞培养基（oligo medium + GF）。轻轻吹打混合培养基与细胞，形成均匀的细胞悬液。
- 计数细胞，并将2.5×10⁶个细胞转移至每个新的PDL包被的T75培养瓶中。
3. 少突胶质细胞分化的最后一步
- 在寡突培养基+生长因子（GF）中培养3周后，当细胞融合度达到70-80%时，开始进行终末分化（图1C）。
- 配制方法与寡突培养基+生长因子相同，但不添加四种生长因子：Shh、NT-3、bFGF和PDGF-AA。此不含四种生长因子的培养基定义为寡突培养基-生长因子（oligo medium - GF）。
- 吸除培养瓶中的寡突培养基+生长因子，用PBS冲洗一次，然后加入总体积16 ml的培养基，其中¾（12 ml）为寡突培养基-生长因子，¼（4 ml）为PDN条件培养基，持续培养6-10天。使用PDN条件培养基对分化过程或细胞存活并非关键。事实上，我们观察到只有在共培养实验中PDO细胞与PDN细胞直接接触时，才会延长PDO细胞的存活时间。若将PDO细胞与PDN细胞共培养，其在寡突培养基-生长因子中的存活时间可延长至两到三周。将人神经前体细胞分化为PDN的实验方案已在先前发表的研究中描述，不属于本方案内容1。从培养基中撤除生长因子后，细胞逐渐分化，形成具有多个突起的形态（图1D）。
4. 流式细胞术检测
流式细胞术检测少突胶质细胞在分化过程中获得的标志物，及其与亲代细胞群体标志物的关系。
- 以神经前体细胞作为对照。将PDO细胞以2.5×10⁵个细胞/孔的密度接种于24孔板中。6 两瓶T75培养瓶中的细胞，培养瓶经多聚-D-赖氨酸包被，使用含生长因子的少突胶质细胞培养基（oligo medium + GF）培养。
- 一周后，将部分培养瓶中的培养基更换为新鲜的含生长因子（GF）的少突培养基，作为细胞活力的对照培养；而其他培养瓶则更换为不含生长因子（GF）的少突培养基。
- 在两种培养基中解离PDO细胞时，使用20 U/ml的木瓜蛋白酶而非胰蛋白酶。因为木瓜蛋白酶在解离过程中对细胞的作用更为温和，有助于保持细胞形态。
- 加入5 ml Earle's平衡盐溶液（EBSS）至木瓜蛋白酶小瓶中。将小瓶置于37 °在 37°C 下孵育 10 分钟，或直至木瓜蛋白酶完全溶解且溶液变得澄清。此即用于解离细胞的木瓜蛋白酶溶液。
- 向一管脱氧核糖核酸酶 I (DNase) 中加入 0.5 ml EBSS表1。轻轻混匀。将0.25 ml该溶液加入溶于溶液中的木瓜蛋白酶小瓶中。此制备液终浓度约为20 U/ml木瓜蛋白酶和0.005% DNase。
- 将上述 papain 溶液加入细胞中，在 37℃ 下孵育 °在37°C下孵育15-30分钟；使用显微镜监测细胞脱落情况。加入5 ml含或不含生长因子（GF）的培养基终止反应，于1,200 rpm离心7分钟。
- 将两个烧瓶中的细胞沉淀分别转移至两个不同的5 ml聚丙烯管中，用正常生理培养基（NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.3）洗涤。2，10 mM Hepes 和 10 mM 葡萄糖）中添加 1 mg/ml 牛血清白蛋白（NPM+BSA）。
- 在4℃下进行表面免疫染色 °C，20 分钟，使用针对 A2B5、O4、GalC 的特异性且经适当滴定的一抗表 2).
- 用 NPM+BSA 在 4℃ 下洗涤细胞 °℃孵育5分钟，然后在4℃下用特异性二抗孵育 °C，20 分钟（表 2).
- 为了染色包括巢蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和III类 β-微管蛋白，以及髓鞘碱性蛋白（MBP）（表 2），在室温下用2%多聚甲醛（PFA）固定细胞20分钟，并在-20℃下用预冷的70%乙醇透化15分钟 °C.
- 用 1× PBS 洗涤细胞，并与特异性二抗孵育（表2).
- 为在流式细胞术分析中区分完整细胞与亚细胞碎片，使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Life Technologies，美国纽约州大岛）对细胞进行染色。
- 在优化上述方案的过程中，我们进行了所有适当的对照实验，以确认每种免疫试剂的特异性。简而言之，对于直接标记的抗体，相应的阴性对照为与一抗相同免疫球蛋白同型（或亚型）类别及相同荧光素偶联物的直接偶联抗体即，同型对照）。对于一抗的间接免疫染色，相应的阴性对照为与目标荧光染料偶联的二抗，该二抗特异性识别一抗宿主来源的免疫球蛋白类别（或亚类）。当同时使用来自多个宿主（小鼠、兔、鸡）的一抗时，我们采用针对各宿主来源一抗的相应二抗，并且所用的每种二抗通常均经过针对其他宿主免疫球蛋白的交叉吸附处理，以最大限度减少跨宿主的免疫反应性。阳性对照包括对已知表达目标抗原的细胞样本进行直接或间接免疫染色，使用针对这些抗原的特异性一抗并通过直接或间接免疫反应进行检测。上述优化方法针对每种类型的免疫染色实验均进行一次。对照免疫反应结果显示，一抗与二抗之间无显著的交叉表位免疫反应性。流式细胞术分析在均匀悬浮的荧光标记细胞上进行，使用配备三激光器的FACVantage SE细胞分选仪（BD Biosciences，San Jose，CA），其激发波长分别为488 nm、647 nm以及宽谱紫外光（351-364 nm）图2).
5. 免疫荧光检测
注意：进行免疫荧光实验时，将PDO细胞以每孔2.5×10⁵个细胞的密度接种于经PDL包被的6孔板中，培养基分别为含生长因子的寡突培养基（oligo medium + GF）或不含生长因子的寡突培养基（oligo medium - GF）。在撤除生长因子后的不同时间点，用2%多聚甲醛固定细胞。抗体染色直接在塑料6孔板上进行，而非玻璃盖玻片上。
- 移除培养基，加入2% PFA，室温孵育10分钟。弃去PFA，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。注意避免细胞干燥。
- 使用含0.25% Triton的PBS溶液对细胞进行通透处理，室温孵育10分钟。
- 为防止非特异性结合，用HHG（含1 mM HEPES缓冲液、2%马血清和10%山羊血清的Hanks平衡盐溶液）封闭细胞10分钟。将特异性一抗（表2）按预先确定的浓度用HHG稀释后加入细胞中。在摇床上室温孵育1小时，或4 °C过夜。
- 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。将与荧光染料偶联的适当二抗（表2）按预先确定的浓度用HHG稀释，将稀释后的二抗混合液加入细胞中。在避光条件下，于摇床上室温孵育1小时。
- 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
- 为避免荧光淬灭，向细胞中加入10 μl含DAPI的Prolong Gold封片剂，并盖上玻璃盖玻片。使用Axiovert 200M荧光显微镜（Zeiss, Thornwood, NY）观察标记的细胞（图3）。
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结果
从融合度为70%-80%的神经前体细胞培养物开始分化过程至关重要（图1A）。当培养基从神经前体细胞培养基更换为少突胶质细胞培养基时，许多细胞会死亡，因为后者含有特定的生长因子。这表明，未定向分化为少突胶质细胞表型的神经前体细胞无法在新培养基中继续增殖（图1B）。在含生长因子的少突胶质细胞培养基中培养一周后，细胞呈现狭窄的双极形态，形成中间状态的细胞群体（图1B）。细胞在含生长因子的少突胶质细胞培养基中继续培养3-4周（图1C）。从培养基中撤除生长因子后，细胞逐渐分化，形成具有多个突起的成熟形态（图1D）。采用流式细胞术对实验数据进行定量分析。
图 2A、2B 和 2C 显示，大多数神经前体细胞表达神经上皮干细胞标志物 nestin，而仅有少数亚群表达谱系限制性标志物，例如星形胶质细胞标志物 GFAP（图 2A）、神经元标志物 III 类 β-微管蛋...
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讨论
本实验方案描述了如何从原代人神经前体细胞中诱导生成胎儿少突胶质细胞，并通过流式细胞术和免疫荧光染色对其表型进行鉴定。胎儿中枢神经系统（CNS）来源的神经前体细胞的扩增与生长已有详尽报道1-4。然而，尽管已有可能从成人人脑白质中鉴定并分离胶质前体细胞5-13，获得足量适用于体外实验的人少突胶质细胞仍然困难。此前已有多种尝试，通过建立不同的培养条件，引导胎儿神经前体细胞向产生髓鞘的少突胶质细胞分化14-21。本方案进一步表明，在添加特定生长因子（PDGF-AA、bFGF、Shh 和 NT-3）的无血清培养基中培养3周后，可获得表达O4标志物的巢蛋白（nestin）阳性神经前体细胞（图2），这些生长因子对少突胶质前体细胞的增殖与存活至关重要22-24。在O4+细胞中去除这些生长因子后，细胞进一步分化，并表达髓鞘成分（半乳糖脑苷脂和MBP）。此外，少突胶质细胞分化标志物的表达伴随着细胞形态的变化：从最初呈细长双极形态的细胞（图1B），转变为具有多个突起且突起发育良好的多极细...
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所（NINDS）院内研究计划资助。作者谨向分子医学与神经科学实验室的全体成员、Rick Dreyfuss（协助显微镜工作）以及 Pamela C. Sieving（协助编辑工作）表示感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| DME/HAMS F12 1:1 | 欧米伽科学家 | DM-251 | 1X | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9418 | 1% | |
| 庆大霉素 | 优质生物材料 | 120-098-031 | 50 μg/ml | |
| L-谷氨酰胺 | 优质生物材料 | 118-084-061 | 2 mM | |
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | |
| N2 组分 | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | |
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | |
| Shh | R&D 系统 | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | |
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | |
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | |
| 多聚赖氨酸 | Sigma | P6407 | 50 μ克/米 | |
| PFA | 电子显微镜科学公司 | 15712 | 2% | |
| 胰蛋白酶 | 优质生物制品 | 118-087-721 | ||
| 木瓜蛋白酶 | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | |
| DNase 小瓶 | Worthington | LK003172 | 0.005% | |
| EBSS | Worthington | LK003188 | ||
| ProLong Gold<分化人类神经前体细胞为神经元和胶质细胞类型，为研究和比较神经细胞谱系发育的分子调控机制提供了模型。已有多项研究对源自胎儿中枢神经系统组织的神经前体细胞在体外的扩增进行了充分表征。尽管已成功从成人中国台湾皮质下白质中分离出胶质前体细胞，并建立了多种诱导胎儿神经前体细胞分化为产髓鞘少突胶质细胞的培养条件，但获取足量适用于体外实验的人类少突胶质细胞仍存在困难。已有研究报道，利用妊娠中期胎儿脑组织可从神经前体细胞分化出半乳糖脑苷脂阳性（GalC+）及O4+的少突胶质前体/祖细胞（OPC）。然而，这些细胞在缺乏星形胶质细胞和神经元等支持细胞的情况下无法有效增殖，且在培养过程中会迅速丢失。目前仍亟需建立一种可生成适用于体外实验的少突胶质细胞谱系细胞的培养体系。例如，原代人类少突胶质细胞的培养可作为研究嗜神经性传染性病原体（如人多瘤病毒JCV）致病机制的有用模型，该病毒在体内可感染此类细胞。这些培养细胞还可用于其他中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病的研究模型。源自人类胎儿脑组织的原代多能神经前体细胞可在体外持续增殖，同时保留分化为神经元（前体细胞来源的神经元，PDN）和星形胶质细胞（前体细胞来源的星形胶质细胞，PDA）的能力。本研究显示，神经前体细胞可在诱导下经历少突胶质细胞谱系发育的多个阶段（前体细胞来源的少突胶质细胞，PDO）。我们将神经前体细胞培养于添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子（PDGF-AA）、音猬因子（Shh）、神经营养因子3（NT-3）、N-2和三碘甲状腺原氨酸（T3）的DMEM-F12无血清培养基中。细胞以约每七天75 cm²培养瓶接种2.5×10⁶个细胞的密度进行传代。在此培养条件下，培养物中大多数细胞呈现突起较少的形态，并表达前少突胶质细胞标志物，如A2B5和O-4。当撤除上述四种生长因子（bFGF、PDGF-AA、Shh、NT-3）并添加PDN的条件培养基后，细胞开始长出更多突起，并表达少突胶质细胞分化特异性标志物，如GalC和髓鞘碱性蛋白（MBP）。我们采用多色流式细胞术对细胞表型进行鉴定，以识别少突胶质细胞谱系的独特标志物。> 使用 DAPI | Invitrogen | P36931 | ||
表1. 试剂。 | ||||
| <表格 边框="1"> | ||||
| 一抗（均按1） μg/ml | 物种 同型 | 来源 | 二抗 | |
| 流式细胞术 | ||||
| A2B5-生物素 | 小鼠 | IgM | Gift J. Nielson | Streptavidin PETR，Invitrogen，CA |
| O4FITC | 小鼠 | IgM | J. Nielson 惠赠 | |
| A2B5 | 小鼠 | IgM | 马萨诸塞州米尔福德，Millipore | gαm IgM-FITC，Invitrogen，CA |
| O4 | 小鼠 | IgM | 马萨诸塞州，Millipore | gαm IgM-FITC，Invitrogen，CA |
| GalC | 小鼠 | IgG3 | 马萨诸塞州，Millipore | gαm IgG3-PE，Southern Biotech，AL |
| MBP | 鸡 | IgY | 马萨诸塞州米尔波尔 | dαck IgY-AMCA，Jackson Immu.，PA |
| Nestin | 小鼠 | IgG1 | Messam 等 200028 | gαm IgG1-PECy5，Invitrogen，CA |
| GFAP | 兔 | IgG | 马萨诸塞州米尔波尔，Millipore | gαrb IgG-PE，Jackson Immu，PA |
| βIII 微管蛋白 | 小鼠 | IgG2 | Covance，加利福尼亚州 | gαm IgG2a-PETR，Invitrogen，CA |
| 免疫细胞化学 | ||||
| βIII 微管蛋白 (1:1,500) | 小鼠 | IgG2a | Covance，加利福尼亚州 | gαm IgG2a-FITC，Invitrogen，CA (1:1,000) |
| GFAP (1:1,000) | 兔 | IgG | 马萨诸塞州，Millipore | gαrb IgG-FITC，Jackson Immu，PA (1:500) |
| MBP (1:50) | 鸡 | IgY | 马萨诸塞州米尔福德，Millipore | dαck IgY-FITC，Jackson Immuno，PA (1:100) |
| O4 (1:100) | 小鼠 | IgM | 马萨诸塞州米尔福德，Millipore | gαm IgM-AF546，Invitrogen，CA (1:100) |
| GalC (1:10) | 兔 | IgG | 马萨诸塞州米尔ipore | gαm IgM-AF750，Invitrogen，CA (1:100) |
表 2. 用于流式细胞术和免疫细胞化学检测的抗体（Abs）。 抗体偶联物： PE，藻红蛋白–红藻蛋白；PETR，藻红蛋白–rythrin Texas Red；AMCA，氨基甲基香豆素乙酸盐；Cy，氰基；FITC，异硫氰酸荧光素 Ig： 免疫球蛋白 AF： Alexa Fluor；gαm：山羊抗小鼠；gαrb：山羊抗兔；dαck：驴抗鸡。
参考文献
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