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CRISPR/Cas系统核酸内切酶的底物制备

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DOI：

10.3791/4277

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2012年9月8日

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1Prokaryotic Small RNA Biology, Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology

本文内容

摘要

CRISPR/Cas 系统介导细菌和古菌的适应性免疫。许多 Cas 蛋白被认为可作为作用于不同长度 crRNA 前体的核糖核酸内切酶。本文中，我们展示了三种不同的方法，用于生成 pre-crRNA 底物，以进行 Cas 核酸酶活性的生物化学分析。

摘要

病毒与其原核宿主之间的相互作用塑造了细菌和古菌生命的进化。原核生物进化出多种策略以逃避病毒感染，包括限制修饰系统、流产感染以及CRISPR/Cas系统。这些适应性免疫系统存在于许多细菌和大多数古菌中，由成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）和一系列CRISPR相关（CRISPR associated, Cas）基因组成（图1）1-3。不同的Cas蛋白组合和重复序列定义了至少三种主要的、进化上不同的CRISPR/Cas系统类型4。普遍存在的Cas1和Cas2蛋白被认为参与摄取病毒DNA，并在延伸中的CRISPR簇5'端两个重复序列之间插入新的间隔序列5。整个CRISPR簇被转录为一条包含所有间隔和重复序列的前体crRNA，随后由Cas6蛋白家族中的一种酶加工成更小的crRNA6-8。这些crRNA由位于5'端（8个核苷酸）和3'端、源自重复序列的标签所包围的间隔序列构成9。当病毒再次入侵时，新的crRNA将通过Cas蛋白复合物（Cascade）被引导至病毒DNA，并通过碱基互补配对识别该病毒DNA10。最终，在CRISPR/Cas I型系统中，核酸酶Cas3将降解被识别的入侵者DNA11,12。

这些过程确立了CRISPR/Cas作为原核生物的适应性免疫系统，并为研究相关的Cas蛋白开辟了一个引人入胜的研究领域。许多Cas蛋白的功能仍不明确，CRISPR/Cas系统表现出多样性的原因仍有待阐明。大多数Cas蛋白的潜在活性是通过详细的计算分析预测得出的。已有研究显示或推测，大部分Cas蛋白具有核酸内切酶的功能4。

在此，我们介绍用于生成 crRNA 和前体 crRNA 以研究 Cas 核糖核酸内切酶的方法。不同的核酸内切酶实验需要使用可直接合成为 RNA 寡核苷酸的短重复序列，或通过体外转录生成的较长的 crRNA 和 pre-crRNA 序列。 体外 T7 RNA聚合酶跑脱转录。该方法可掺入放射性核苷酸，用于生成内部标记的核酸内切酶底物，并制备合成或突变型crRNA。利用Cas6核酸内切酶活性将pre-crRNA加工成熟为具有5'-羟基和2',3'-环状磷酸末端的crRNA。

方案

1. 通过 PCR 生成长前体 crRNA 底物

  1. 设计靶向CRISPR簇间隔区的PCR引物。在正向引物中添加T7 RNA聚合酶（T7RNAP）启动子序列（5'-taatacgactcactata-3'），并在两个引物中均加入用于将PCR产物克隆至载体的限制性酶切位点例如 BamHI 和 Hind III 用于 pUC19， 图 2A).
    注意： T7 RNA聚合酶需要一个鸟苷酸残基才能正确启动转录。
  2. 从基因组DNA中通过PCR扩增你感兴趣的pre-crRNA序列。
  3. 通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并从凝胶中回收目的条带。用限制性内切酶消化PCR产物，以产生黏性末端（例如 BamHI 和 HindIII， 图 2A使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除酶切副产物。
  4. 设置连接反应体系，其中包含 T4 DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶缓冲液，以及摩尔比为 3:1 的经切割的 PCR 产物与去磷酸化的线性 pUC 载体，二者具有相应的黏性末端。将混合物在指定温度下孵育 16 °C 过夜。将连接混合物转化至感受态细胞中 大肠杆菌 采用标准方案将质粒转化至DH5α细胞，并通过蓝白斑筛选鉴定连接是否成功。
  5. 使用质粒提取试剂盒从白色菌落中提取质粒。通过质粒测序鉴定阳性克隆。或者，也可采用菌落PCR进行筛选。

2. 通过DNA寡核苷酸退火生成中间前体pre-crRNA底物

  1. 设计含有目标 CRISPR 重复序列/间隔序列的正向与反向寡核苷酸。这些寡核苷酸包含 T7 RNAP 启动子序列以及末端限制性酶切位点例如 BamHI 和 Hind III 用于 pUC19）。终止寡核苷酸序列，以确保退火后形成黏性末端（参见 图 2B).
  2. 分别对每种寡核苷酸进行5'-磷酸化处理，各使用1 nmol 20μl 含有反应 5 μl T4多核苷酸激酶（PNK） 2 μl T4 PNK 10倍缓冲液 2 μl ATP（10 mM）。将每个样品在37°C下孵育1小时 37 °C.
  3. 将两条磷酸化的寡核苷酸进行杂交。混合 1μl 磷酸化正向寡核苷酸混合物（来自步骤2.2） 1 μl 磷酸化反向寡核苷酸混合物（来自步骤2.2） 1 μl T4 DNA连接酶10x缓冲液 10 μl 反应。将样品在5 min内孵育 95 °C 在加热块上或沸水中加热后，关闭热源，让混合物冷却至室温（约2-3小时）。
    注意： 在此关键步骤中，缓慢冷却过程有利于两条寡核苷酸之间的退火，而非每条单链寡核苷酸自身形成结构。
  4. 连接 4 μl 杂交混合液 1μl pUC 载体的消化与去磷酸化产物（0.1 μg/μl) 使用 T4 DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶 10x 缓冲液和 10 mM ATP 进行连接反应 20 μl 连接反应混合物。将样品在指定条件下孵育 16 °C 过夜。
  5. 将连接的质粒转化至感受态细胞 大肠杆菌 按照标准方案转化DH5α细胞，并利用蓝白斑筛选。提取质粒，通过酶切（筛选具有预期大小插入片段的克隆）及后续质粒测序鉴定阳性克隆。

3. 通过定制RNA寡核苷酸合成产生短Cas RNA底物

设计短的Cas RNA底物（例如 单拷贝重复序列 图 2C并利用定制的RNA寡核苷酸合成设施。

注意：在RNA寡核苷酸的特定位置引入脱氧核糖核苷酸（图2C）可用于精确定位RNA的切割位点。

4. 体外 T7 RNA 聚合酶转录

  1. 使用质粒大量提取纯化试剂盒，提取含有设计构建体的质粒（来自步骤1.9或2.7）。
  2. 用限制性内切酶线性化质粒，该酶的切割位点位于克隆片段的下游（例如 HindIII）。确保完全消化。
    注意： 如果需要获得具有不同定义的3'末端的RNA转录本，所设计的构建体应在HindIII序列上游包含一个额外的特异性限制性酶切位点，用于“外切”转录。
  3. 使用酚:氯仿 (1:1) 抽提法纯化线性化质粒，并通过乙醇沉淀回收核酸。将沉淀溶于经DEPC处理的无菌水中以回收核酸。
  4. 建立一个 体外 含有 40 mM Hepes/KOH（pH 8）、22 mM MgCl₂ 的 T7 RNAP 体外转录反应体系2，5 mM 二硫苏糖醇，1 mM 亚精胺，每种核苷三磷酸（ATP、CTP、GTP、UTP）各 4 mM，40-100 μg/ml 消化后的质粒和0.1 mg/ml T7 RNA聚合酶溶于DEPC处理的水中。37°C孵育3小时 37 °C.
  5. 在变性8 M尿素12%聚丙烯酰胺凝胶上分析所获得的RNA转录本（图 3A可通过Mono Q阴离子交换色谱纯化RNA转录本13 并通过乙醇沉淀RNA组分，将沉淀物重悬于经DEPC处理的无菌水中进行回收。如需后续使用，将RNA于-80 °C.

5. Cas6 核酸内切酶活性检测

  1. 设置一个 20 μl 体外 T7 RNAP 跑出转录混合物（见 4.4），其中 ATP 含量减少至 2 mM，并补充有 2.5 μl α-[32P]-ATP（10 mCi/ml，5000 Ci/mmol）。通过变性8 M尿素12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物，并进行凝胶回收纯化。通过放射自显影观察条带。
  2. 表达并纯化目标重组 Cas 蛋白。本示例中为来自 Clostridium thermocellum 通过热沉淀和Ni-NTA层析进行纯化。
  3. 建立一种内切核酸酶检测反应（例如 用于 Clostridium thermocellum Cas6 反应体系包含 20 mM Hepes（KOH，pH 8）、250 mM KCl、2 mM MgCl₂2，1 mM DTT，12,000 cpm RNA底物以及 1 μM 酶并置于 37 °C 30分钟。
  4. 加载 5 μl 反应混合物的（+ 10 μl 在含95%甲酰胺的RNA上样缓冲液中，于8 M尿素12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。电泳后通过放射自显影观察切割产物。

6. 代表性结果

图3A展示了用于分析Cas核酸酶活性的RNA底物示例。一份等分试样 5 μl 分析的 100 μl 体外 转录反应已上样。请注意，不同构建体之间的RNA产量效率存在差异。影响所获RNA量的因素包括：（i）转录起始所需的+1G之后的初始序列；（ii）转录过程中RNA结构形成的可能；（iii）用于产生截断切割位点的限制性酶切位点的选择。

研究RNA内切酶活性需要高度纯化的重组Cas蛋白（图3B）以及适当的阴性对照。理想情况下，该阴性对照样本应与所研究的Cas内切酶反应尽可能相似，仅存在最小差异。可通过将RNA与未表达Cas蛋白的细胞裂解液（并经过相同的纯化流程）及反应缓冲液共同孵育来实现这一对照。一种理想的阴性对照是在预测的切割位点引入一个脱氧核糖核苷酸。在图3C中，展示了Clostridium thermocellum Cas6对5'末端标记的重复序列的切割情况。在相同条件下，当在-9位引入脱氧核糖核苷酸后，该重复序列不再作为底物被切割。该方法还可提供有关切割位点的信息。最后，一条长的内部标记的pre-crRNA被Cas6切割，产生两个切割片段。

CRISPR 示意图：基因编辑过程，Cas1-Cas3 相互作用，crRNA 转录，干扰步骤。
图 1. CRISPR/Cas 活性的示意图。该示意图展示了病毒 DNA 序列（原间隔序列）插入 CRISPR 簇（适应阶段）、CRISPR 阵列被 Cas6 核酸内切酶转录并加工成小的 crRNA、crRNA 被 Cascade 复合物摄取，以及基于 crRNA 与原间隔序列互补性对重复的病毒感染进行干扰的过程。原间隔序列邻近基序（PAM）标记了病毒的原间隔序列。

CRISPR pre-crRNA 转录过程；示意图显示了 PCR 扩增和体外转录步骤。
图 2. Cas 蛋白用 RNA 底物的制备。该示意图展示了生成（A）长链 pre-crRNA 底物、（B）中等长度 pre-crRNA 底物以及（C）短链 Cas RNA 底物用于 pre-crRNA 制备的工作流程。以Clostridium thermocellum的 CRISPR 阵列为例展示了序列示例。 点击此处查看大图。

RNA底物和Cas6核酸内切酶实验结果；电泳凝胶图；28 kDa蛋白条带。
图3. Cas6核酸内切酶活性检测。A.) 经甲苯胺蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶，显示定制设计的RNA寡核苷酸（250 pmol）以及两种in vitro转录的RNA（典型100 μl反应体系中的5 μl）。B.) 来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）的Cas6蛋白制备物（80 pmol）经50°C加热沉淀1小时后，再经Ni-NTA层析纯化后的SDS-PAGE凝胶结果。C.) 对5'端标记的重复序列及pre-crRNA in vitro转录本进行Cas6核酸内切酶活性检测。在短Cas RNA底物（S，图2C）的-9位引入dNTP会消除Cas6的切割活性。对于长pre-crRNA底物（L，图2A），可生成5'端8个核苷酸的标签，该标签参与crRNA的成熟过程。条带通过变性8 M尿素12%聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过放射自显影检测。

讨论

本文所述方法能够生成不同长度范围且序列设计具有不同自由度的Cas核酸酶底物。合成RNA寡核苷酸底物最直接的方法由于长链RNA寡聚体合成成本增加和技术限制，仅适用于较短的RNA设计。尽管已有成功合成超过100个核苷酸长度的未修饰RNA寡聚体的报道，但定制化RNA合成在实际操作和经济性上的上限通常低于40个核苷酸。然而，任何特定序列均可被合成，并可通过靶向引入修饰核苷酸（如脱氧核糖核苷酸）来详细分析切割位点。较长的pre-crRNA应通过in vitro转录方法生成。

含有T7 RNA聚合酶启动子的寡核苷酸退火后可用于生成中等长度的pre-crRNA。常规且经济合成的DNA寡核苷酸最大长度略高于150个核苷酸，这也代表了通过该方法合成pre-crRNA的长度上限。通过组装多个可相互形成黏性末端的退火DNA寡核苷酸对，可进一步延长此最大长度，但这会增加构建体克隆过程中的难度。该方法的主要优势在于能够生成具有任意所需序列的pre-crRNA构建体（从而获得Cas核酸酶底物），进而允许对合成的crRNA设计进行测试。

最后，可通过PCR扩增整个基因组CRISPR元件或其部分片段来获得较大的前体crRNA。对 体外 可通过定点突变将转录模板质粒引入，以生成pre-crRNA变异体。这些构建体可用于分析整个pre-crRNA内的全局内切核酸酶切割模式。

通过T7 RNA聚合酶生产未修饰RNA的开创性工作 体外 转录基于转运RNA进行 14 和雀麦花叶病毒RNA 15T7 RNA聚合酶的共识启动子包含一个识别区（-17至-5）和一个起始区（-4至+6），转录起始于关键的鸟苷酸+1位点 16+1位点下游的位置可以进行改变，从而能够转录出几乎任何所需的RNA序列。以下介绍生成 体外 加尾转录模板可用于 体外 合成与基因组CRISPR区域匹配的完整pre-crRNA或合成的pre-crRNA变体。转录产物带有5'-末端三磷酸基团，除非在转录反应中使用GMP进行引物启动以获得5'-单磷酸末端 14. 若转录本需用T4多核苷酸激酶和γ-[32P]-ATP。Cas6 和 Cas6 样酶的切割活性可生成含有5'-羟基和2',3'-环状磷酸末端的crRNA。随后可分析这些RNA被Cascade复合物识别的情况。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢Jeanette Schermuly提供重组T7 RNA聚合酶，以及Norman Ebelt在制备图1过程中提供的帮助。本工作由德国研究基金会（DFG FOR1680）和马克斯·普朗克学会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
南极磷酸酶NEBM0289L
体外转录级超纯核苷三磷酸Jena BioscienceNU-1010 - NU-1013
液相色谱，ktapurifier 100GE Healthcare
DNA 寡核苷酸MWG Operon
RNA 寡核苷酸MWG Operon
凝胶回收试剂盒QIAGEN28704
PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
质粒小提试剂盒QIAGEN27106
质粒大提试剂盒QIAGEN12163
BamHINEBR0136L
HindIIINEBR0104L
T4 DNA 连接酶NEBM0202S
T4 多核苷酸激酶AmbionAM2310
T7 RNA 聚合酶自行制备
脱氧核苷酸溶液混合物NEBN0447L
Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统Bio-Rad165-8001
Storm 840 扫描仪GE Healthcare163723
储存磷屏Molecular Dynamics63-0034-81
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare17-5166-01
Phusion 高保真 DNA 聚合酶NEBM0530L使用 GC 缓冲液
甲苯胺蓝SigmaT3260
pUC19NEBN3041S
γ-[32P]-ATP，α-[32P]-ATPHartmann AnalyticSRP-401, SRP-307

参考文献

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标签

RNA Cas6 T7 RNA

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