使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

摘要

我们描述了一种用于快速检测和鉴定细菌的电化学传感器分析方法。该分析方法采用经DNA寡核苷酸捕获探针功能化的传感器阵列，该探针针对核糖体RNA（rRNA）的物种特异性序列。目标rRNA与捕获探针及辣根过氧化物酶标记的DNA寡核苷酸检测探针发生夹心杂交反应，产生可测量的安培电流。

摘要

电化学传感器广泛用于血糖的快速准确检测，并可被改造以检测多种多样的分析物。电化学传感器通过将生物识别事件转化为有用的电信号来实现工作。信号转导是通过将氧化还原酶的活性与安培电极相偶联而实现的。传感器的特异性要么是酶本身固有的特性（例如葡萄糖传感器中的葡萄糖氧化酶），要么是酶与抗体或探针连接后所产生的特性。

本文介绍一种电化学传感器检测方法，用于直接检测和鉴定细菌。在所有情况下，此处描述的探针均为DNA寡核苷酸。该方法基于捕获探针和检测探针与靶标核糖体RNA（rRNA）的夹心杂交原理。捕获探针固定在传感器表面，而检测探针则连接辣根过氧化物酶（HRP）。当向电极表面加入含有捕获探针-靶标-检测探针复合物的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）等底物时，底物被HRP氧化，并由工作电极还原。这一氧化还原循环导致底物将电子从电极传递至HRP，从而在电极中产生电流信号。

引言

以rRNA作为细菌检测和鉴定的靶分子具有多项优势。细菌细胞中rRNA的含量丰富，使得检测灵敏度可达每毫升250个细菌，且无需进行靶标扩增¹。细菌rRNA包含可被DNA探针杂交识别的特异性种属序列。因此，可使用一组电化学传感器来鉴定未知细菌，其中每个传感器均修饰有不同种属特异性的捕获探针。应设置阳性对照传感器，用于检测可“桥接”捕获探针与检测探针的合成寡核苷酸靶标，从而产生内部校准信号。

电化学传感器在基础研究和转化研究中具有广泛的应用。例如，本文所述的检测方法已被用于精确测量大肠杆菌（E. coli）生长阶段对其rRNA和pre-rRNA拷贝数的影响，这一问题在细菌生理学研究领域备受关注²。电化学传感器检测的灵敏度由信噪比决定。研究人员已探索了多种信号放大和噪声降低方法。我们发现，优化传感器表面的化学修饰是减少检测探针和/或辣根过氧化物酶（HRP）非特异性结合的关键。特别是，采用烷基二硫醇与巯基乙醇组成的混合单分子层，可更充分地覆盖电极表面，同时保持捕获探针对目标序列杂交的可及性，从而有效降低背景信号³。这类表面化学处理在涉及复杂生物样本的检测中尤为重要。

方案

1. 电化学传感器的功能化

1. 将巯基化捕获探针配制于含有300 μM 1,6-己二硫醇（HDT）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.3 M NaCl 和 1 mM EDTA 的溶液中，终浓度为0.05 μM，避光室温孵育10分钟。捕获探针与HDT共孵育可确保其巯基处于还原状态，从而获得更一致的实验结果。
2. 用氮气流吹扫裸金16通道传感器芯片表面5秒，以去除水分和/或颗粒污染物。
3. 向传感器阵列全部16个传感器的工作电极上各加6 μl HDT-巯基化捕获探针混合液，将传感器芯片置于加盖的培养皿中，4 °C过夜孵育。巯基化捕获探针可直接结合至裸金电极表面，HDT的作用是防止探针过度密集堆积，并使其保持伸展构象，有利于与目标分子发生杂交。
4. 次日，用去离子H₂O冲洗传感器芯片2–3秒，并在氮气流下吹干5秒。
5. 向全部16个传感器的工作电极上各加6 μl含10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.3 M NaCl、1 mM EDTA 和 1 mM 6-巯基-1-己醇（MCH）的溶液，孵育50分钟。此步骤及后续所有传感器芯片的孵育均在室温下加盖培养皿中进行。MCH作为封闭剂，可填充电极表面未被巯基化捕获探针或HDT占据的空隙区域。

2. 样品制备

1. 取1 ml处于对数生长期（OD₆₀₀ ≈ 0.1）的细菌培养物，转移至微量离心管中，在16,000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液。细菌沉淀可立即进行后续处理，或于-80 °C保存以备后续使用。
2. 用移液器吸取10 μl的1 M NaOH，将枪头抵住微量离心管底部，反复吹打数次，充分重悬细菌沉淀。室温孵育5分钟。
3. 加入50 μl含2.5%牛血清白蛋白（BSA）和0.25 mM荧光素标记检测探针的1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2），中和细菌裂解液。将中和后的裂解液于室温孵育10分钟。荧光素标记的检测探针可与细菌rRNA靶分子杂交。

3. 电化学传感器检测

1. 用去离子 H₂O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。
2. 向 14 个传感器的每个工作电极上加入 4 μl 中和后的细菌裂解液，孵育 15 分钟。目标物-检测探针复合物将与固定化的硫醇化捕获探针杂交。
3. 向 2 个阳性对照传感器（用于信号归一化）的工作电极上加入 4 μl 含 2.5% BSA 和 0.25 μM 荧光素修饰检测探针的 1 nM 桥接寡核苷酸溶液（溶于 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2），孵育 15 分钟。
4. 用去离子 H₂O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。
5. 向全部 16 个传感器的工作电极上加入 4 μl 抗荧光素-HRP 酶标抗体溶液（浓度为 0.5 U/ml，溶于含 0.5% 酪蛋白的 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2），孵育 15 分钟。抗荧光素-HRP 会结合到固定的荧光素修饰检测探针上。
6. 用去离子 H₂O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。
7. 在传感器芯片表面贴上薄膜孔贴片，并将其装入传感器芯片支架。用移液器将 50 μl TMB 底物加到全部 16 个传感器上，然后关闭传感器芯片支架。
8. 使用 Helios 芯片读取仪对全部 16 个传感器进行安培法和循环伏安法测量。安培电流与传感器表面 TMB 还原速率成正比（见 图 1）。

结果

我们描述了一种电化学检测方法，其结构类似于夹心ELISA。如图1所示，靶标核糖体RNA（rRNA）与捕获探针和检测探针发生杂交，随后通过辣根过氧化物酶（HRP）催化的氧化还原反应产生信号；该HRP标记在抗荧光素抗体片段上，可结合检测探针3'端的荧光素连接位点。检测灵敏度的一个关键因素是金电极的表面化学性质。我们发现，由硫醇化捕获探针、巯基己醇和己二硫醇组成的三元单分子层可显著降低报告蛋白的非特异性背景结合，从而大幅提高信噪比³。本文所述检测使用GeneFluidics公司的16传感器阵列芯片，如图2所示。阵列中的每个传感器包含三个电极：工作电极、参比电极和辅助电极，这些电极在芯片边缘设有接触点⁴。芯片读取器通过弹簧针（pogo pins）与各接触点连接，作为传感器阵列与由计算机算法控制的电位计之间的接口。

电化学传感器电流流动的示例如图3所示。在安培测量开始后的最初几秒内，传感器中的电流会人为偏高，这是由于从TMB施加到传感器表面到启动读...

讨论

本文所述的电化学传感器检测方法可实现对核酸靶标的快速检测。其灵敏度和特异性部分取决于靶标与探针杂交的自由能，而该自由能又受到捕获探针和检测探针的长度及GC含量的影响。我们通常在室温（约20 °C）下进行杂交步骤^{5, 6}。然而，若将芯片置于含有湿润滤纸的密闭腔室中以防止蒸发，则杂交步骤（3.2 和 3.3）也可在杂交炉中的较高温度下进行^{7, 8}。当捕获探针与检测探针结合于核酸靶标上相邻且无间隙的位点时，可获得最佳信号⁸。这种信号增强效应被认为通过碱基对堆叠作用以及提高相邻区域的杂交可及性来实现，即所谓的“辅助探针”效应。捕获探针与检测探针在相邻位点的杂交尤为重要，因为细菌的碱裂解会导致rRNA靶标发生片段化⁵。该方法可用于RNA或DNA靶标的检测，具有广泛的临床与科研应用前景。例如，可利用该方法研究由小RNA调控的细胞功能，或检测作为DNA或mRNA存在的抗生素耐药基因靶标。对于拷贝数较低的靶标，可能需要进行预扩增。此外，在样本制备过程中应加入RNase抑制剂，以防止潜在不稳定的RNA靶标发生降解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-巯基-1-己醇（MCH）	Sigma	451088	室温保存
1,6-己二硫醇（HDT）	Sigma	H-12005	室温保存
巯基化捕获探针	Operon	N/A	以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
荧光素标记的检测探针	Operon	N/A	以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
桥接寡核苷酸	Operon	N/A	以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
抗荧光素-HRP Fab片段	Roche	11 426 346 910	4 °C保存
Helios芯片读取仪	GeneFluidics	GFR-2009
传感器芯片支架	GeneFluidics	GFR-003
薄膜孔贴片	GeneFluidics		随传感器芯片一同提供
裸金16传感器阵列芯片	GeneFluidics	SC1000-16X-B	在100% N2环境中室温保存
牛血清白蛋白	Sigma	A7906	4 °C保存
1M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2			含0.35M NaH2PO4 和 0.65M K2HPO4，调节pH至7.2
PBS中的酪蛋白封闭剂	Pierce	37528	用等体积的1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）稀释后，4 °C保存
表1. 试剂与设备。