方法文章

使用电化学传感器的细菌检测和鉴定

DOI：

10.3791/4282

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2013年4月23日

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1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

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我们描述了一种电化学传感器的测定方法，细菌的快速检测和识别。的测定法涉及官能化的传感器阵列与DNA的核糖体RNA（rRNA基因）的种属特异性序列的寡核苷酸捕捉探针。目标rRNA基因的捕获探针和辣根过氧化物酶相连的DNA寡核苷酸检测探针的夹心杂交产生可测量的安培电流。

摘要

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电化学传感器被广泛用于快速，准确地测量血糖，并能适用于各种各样的分析物的检测。电化学传感器操作成一个有用的电信号传导生物识别事件。信号转导的发生了耦合到安培的电极的氧化还原酶的活性。传感器的特异性，使用固有特性的酶，葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器的情况下，或的酶和抗体，该抗体或探针之间的关系的商品。

在这里，我们描述的电化学传感器检测方法直接探测和识别细菌。在每一种情况下，这里所描述的探针DNA的寡核苷酸。此方法是基于夹心杂交的捕获和检测探针与目标的核糖体RNA（rRNA基因）。捕获探针被固定到所述传感器表面，而检测器的探头与步骤horseradish过氧化物酶（HRP）。当基片，例如3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）被添加到绑定到其表面上的复合物与捕捉目标检测器的电极被氧化，在基板由HRP减少工作电极。此氧化还原循环的结果是穿梭的电子从电极到辣根过氧化物酶的底物，生产电极中电流的流动。

引言

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使用rRNA基因作为目标分子的细菌检测和鉴定了许多优点。 rRNA基因在细菌细胞中的丰度低至每毫升250个细菌提供了一个灵敏度极限，而不需要对目标扩增1。包含独特的物种特异性细菌rRNA基因序列与DNA探针杂交。因此，电化学传感器的阵列可用于识别未知的细菌，其中每个传感器与不同的种属特异性捕获探针官能。应积极控制传感器包括合成的寡核苷酸的目标，"小桥流水"的捕获和检测探针，建立内部校准信号。

电化学传感器有着广泛的基础和转化研究中的应用。例如，这里所描述的测定法被用于精确测量大肠杆菌的效果大肠杆菌生长阶段RRNA和预rRNA基因的拷贝数，这是极大的兴趣，感兴趣的研究人员在细菌生理学2。电化学传感器测定的灵敏度确定的信号噪声比。已探索各种信号放大和降噪方法。我们发现，改善传感器的表面的化学性质，以减少检测器的探头和/或HRP酶的非特异性结合是关键的。混合单层的alkanedithiols mercaptohexanol特别是，已经发现，以减少背景更完全地覆盖在电极表面，同时保持可访问性的捕获探针的目标杂交3。在这些表面化学处理涉及复杂生物样品的分析是特别重要的。

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方案

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1。电化学传感器的官能

  1. 制备巯基化的捕获探针的浓度为0.05μM，300μM1,6 - 己二硫醇（HDT）的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA和在黑暗中孵育10分钟，在室温下，pH值8.0，0.3M NaCl的。孵化的巯基化的捕获探针与HDT确保捕获探针的硫醇基团上的减少，导致更一致的结果。
  2. 氮气流中应用裸金16的传感器阵列芯片（s），持续5秒，以除去水分和/或颗粒物。
  3. 6微升的HDT-巯基化的捕获探针混合物应用到所有的16个传感器的传感器阵列的工作电极，并在有盖培养皿中存储的传感器芯片（次），在4℃下过夜。巯捕获探针直接绑定到裸金电极和HDT起到防止装填过量的捕获探针，并让他们在一个伸展的构象，促进杂交与目标。
  4. 该第二天，洗涤的去离子H 2 O的传感器芯片，具有2〜3秒，干燥氮气流中下持续5秒。
  5. 适用于6微升的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA的0.3M NaCl的pH值为8.0，1 mM的6 - 巯基-1 - 己醇（MCH），所有的16个传感器，并孵育50分钟的工作电极。这和所有随后的传感器芯片孵育在有盖的培养皿中，在室温下进行。 MCH作为封端剂，巯基化的捕获探针或热变形温度是在电极表面上不存在的任何间隙填充。

2。样品制备

  1. 吸取1毫升细菌培养的数生长期（OD 600≈0.1）....

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结果

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我们描述了同样的结构的双抗体夹心ELISA的电化学检测。在图1中所示，目标核糖体RNA（rRNA基因）杂交，捕获和检测探针开发的催化氧化还原反应的HRP标记的抗荧光素抗体片段结合到探测器上的探针的3'荧光素联动。检测灵敏度的一个重要组成部分是金电极的表面化学性质。我们已经发现，由巯基化的捕获探针，mercaptohexanol，和己二硫醇组成的三元单层显着提高了信号-噪声比通过减少非特异性背景结合的报告蛋白3。这里所描述的试验雇用GeneFluidics 16的传感器阵列芯片， 如图2所示。在数组中的每一个传感器都包含三个电极，工作中，参考，和辅助，其中有在芯片4的边缘的接触点。该芯片读呃有与各接触点连接的弹簧单高跷销。该芯片读取器作为传感器阵列的一个接口，用于通过一个电位器控制的计算机算法。

图3中所示实施例的电化学传感器的电流。中的电流传感器安培测量开始后的最初几秒钟期间，因为从应用到传感器表面发起的读者算法的TMB的时间内积累的氧.......

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讨论

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这里描述的电化学传感器测定使靶核酸的快速检测。的敏感性和特异性取决于靶 - 探针杂交的自由能，而这又取决于捕获和检测器探针的长度和GC含量的一部分。我们通常执行的的杂交步骤在环境温度（约20℃）5，6。然而，在杂交步骤（3.2和3.3）也可以在杂交烘箱中在较高温度下进行，如果芯片被放置在有盖的腔室，其中包含湿润滤纸，以防止蒸发7，8。获得最佳的信号与检测器捕获探针杂交的靶核酸不相邻的网站上的杂交位点8之间的间隙的对。通过碱基对的堆叠和杂交无障碍相邻的区域，被称为一个"助手探针"的效果通过增加这个信号增强被认为是工作。捕获检测概率ê杂交到相邻站点也很重要，因为碱裂解的细菌导致碎裂的rRNA的目标5。此方法可应用到的RNA或DNA的检测，与各种临床和研究的应用程序。例如，它应该是可以使用此方法来研究细胞功能调节的小分子RNA或DNA或mRNA的检测抗生素抗性基因目标。预扩增，可能是必要的，以检测低拷贝数存在于目标。此外，核糖核酸酶抑制剂应加样品制备过程中潜在的不稳定的RNA目标，防止退化。

这种方法.......

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披露

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所有的作家都描述的方法相关专利的发明者。这些专利之一已授权公司Qvella的。 BMC和DAH权益在Qvella公司。 VG是的总统GeneFluidics，电化学传感器阵列芯片的制造商，芯片的贴装，本文中所描述的芯片读卡器。

致谢

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支持这项研究是由国家过敏和传染病研究所的合作协议奖AI075565（DAH）和温迪和肯红宝石基金在小儿泌尿外科研究卓越。 BMC是在小儿泌尿外科Judith和主席罗伯特·温斯顿。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6-巯基-1-己醇（MCH）Sigma451088室温保存
1,6-己二硫醇（HDT）SigmaH-12005室温保存
巯基化捕获探针OperonN/A以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
荧光素标记的检测探针OperonN/A以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
桥接寡核苷酸OperonN/A以0.1x TE缓冲液配制成100 μM溶液，于-20 °C保存
抗荧光素-HRP Fab片段Roche11 426 346 9104 °C保存
Helios芯片读取仪GeneFluidicsGFR-2009
传感器芯片支架GeneFluidicsGFR-003
薄膜孔贴片GeneFluidics随传感器芯片一同提供
裸金16传感器阵列芯片GeneFluidicsSC1000-16X-B在100% N2环境中室温保存
牛血清白蛋白SigmaA79064 °C保存
1M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2含0.35M NaH2PO4 和 0.65M K2HPO4，调节pH至7.2
PBS中的酪蛋白封闭剂Pierce37528用等体积的1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）稀释后，4 °C保存
表1. 试剂与设备。

参考文献

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  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al.

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RNA TMB

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