本方案介绍了一种完整且详细的操作流程，应用RNA测序（RNA-seq）这一强大的下一代DNA测序技术，对经或未经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞转录组进行分析。该方案可推广应用于受不同试剂或疾病状态影响的多种细胞或组织。
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摘要
摘要
通过检测细胞中mRNA水平来表征基因表达，是研究外部信号如何影响细胞转录机制的有效工具例如 药物处理）或细胞在健康状态与疾病状态之间的差异。随着下一代DNA测序技术的出现及其持续优化，RNA测序（RNA-seq）已成为转录组分析中日益常用的方法，可用于系统鉴定所有类型的转录本，确定所有表达基因的转录结构，并量化特定细胞、组织或生物体内全部转录本表达水平的动态变化1,2 RNA-seq 正逐渐取代 DNA 微阵列，成为转录组分析的首选方法，因为它具有能够全面分析完整转录组、提供数字型数据（任意转录本的拷贝数）以及不依赖于任何已知基因组序列的优势。3.
本文介绍了一种完整且详细的RNA-seq实验方案，用于分析人肺微血管内皮细胞在有或无凝血酶处理条件下的转录组。该方案基于我们近期发表的研究《RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin》4，在该研究中，我们首次成功利用RNA-seq技术对经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞进行了全面的转录组分析。本研究为深入探索凝血酶介导的内皮功能障碍在炎症性疾病、癌症、糖尿病及冠心病发病机制中的分子机制提供了前所未有的资源，并为这些疾病的治疗靶点发现提供了潜在的新方向。
本实验方案的描述性内容分为四个部分。第一部分描述了人肺微血管内皮细胞经凝血酶处理后的RNA提取、质量分析及定量方法。第二部分描述了文库构建与测序过程。第三部分描述了数据分析流程。第四部分描述了RT-PCR验证实验。文中展示了多个关键步骤的代表性结果。讨论部分提供了有助于提高关键步骤成功率的实用建议或注意事项。尽管本方案采用经凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞，但该方法可推广应用于经不同刺激物或抑制剂处理的哺乳动物及非哺乳动物细胞和组织的转录组分析，也可用于健康状态与疾病状态下细胞或组织转录组的比较研究。
方案
该方案的流程图如图1所示。
1. 凝血酶处理细胞、RNA 提取、RNA 质量评估与定量
- 在6孔板中，使用含5%胎牛血清（FBS）、生长因子和抗生素的EGM-2培养基（Lonza，货号 CC-3202），将人肺微血管内皮细胞（HMVEC-LBl）培养至90–100%融合度。
- 在给予凝血酶处理前30分钟，更换为无血清的饥饿培养基。
- 在37 °C、5% CO2条件下，用0.05 U/ml凝血酶处理细胞，或不加凝血酶作为对照，处理6小时。
- 根据生产商说明书，使用Ambion mirVana试剂盒从处理组和对照组细胞中提取总RNA。
- 按照Experion全自动电泳系统（www.bio-rad.com）的标准操作流程，使用Experion StdSense真核RNA芯片评估RNA质量。
- 采用标准分光光度法对RNA进行定量。
2. 文库构建与测序
- 每份样品使用 1 μg 高质量的总 RNA 作为起始材料。
- 为构建文库，请遵循Illumina的标准操作流程（Illumina 说明书 # 15008136 Rev. A）。在该流程中，进行两轮含poly(A)的mRNA筛选，以去除rRNA，从而最大限度减少rRNA测序。
- 使用 Experion 自动电泳工作站上的 Experion DNA 1K 芯片，按照标准操作程序评估文库质量www.bio-rad.com).
- 使用qPCR对文库进行定量：采用已测序过的文库作为标准曲线，并使用针对连接接头的特异性引物。对未知文库设置一系列稀释梯度（即 1:100、1:500 和 1:1,000）。按照 SyberGreen MM 试剂盒说明书进行 qPCR 扩增，并计算每个文库的原始储存浓度。
- 将文库储备液稀释至10 nM，于-20 °C保存，直至准备进行流动池簇生成。
- 当准备对流动池进行簇生成时，将cBot试剂板在水浴中解冻。cBot是Illumina公司用于简化簇生成过程的仪器。
- 清洗cBot仪器。
- 变性文库：将13 μl 1× TE缓冲液与6 μl 10 μM文库混合，在管壁一侧加入1 μl 1 N NaOH（Illumina提供）。涡旋混匀，离心，室温孵育5分钟，随后将变性后的文库置于冰上。
- 稀释文库：将变性的文库用预冷的杂交缓冲液（HT1，Illumina 提供）进行稀释，取 996 μl HT1 与 4 μl 变性文库混合，得到终浓度为 12 pM 的溶液。将变性并稀释后的文库置于冰上。
- 将cBot板的每排试管倒置，确保所有试剂完全解冻。离心板子，去除或穿刺铝箔封膜，然后将板加载到cBot上。
- 将稀释并变性的文库各120 μl分装至标记为1-8的条形管中。向每管中加入1.2 μl稀释并变性的PhiX对照文库（来自Illumina），作为掺入对照。涡旋混匀后离心，按正确方向（1号管在右侧）将条形管装载至cBot仪器中。
- 将流动池和管道装置装载到cBot上。
- 完成流速检测并开始聚类运行。
- 运行结束后，检查所有泳道的试剂输送情况，记录任何异常现象。可立即开始测序运行，或将流动池置于提供的管中，在 4 °C 保存。
- 解冻边合成边测序（SBS，Illumina）试剂。
- 将试剂加入试剂托盘上的相应位置，注意在接触裂解混合液后，避免触及其他试剂。
- 使用非测序流动池（即 对之前已测序的样本，对试剂管路进行两次预冲洗。
- 用70%乙醇和Kimwipes彻底清洁测序流动池，随后用70%乙醇和镜头纸再次清洁。检查流动池表面是否有条痕，必要时重新清洁。
- 将流动池装载到测序仪上，并进行流路检查，以确保管路与流动池之间的密封紧密。
- 启动测序运行。
- 评估质量指标（例如 簇密度、通过过滤的簇数、Q30、荧光强度）在运行过程中一旦可用即显示。
- 运行过程中持续监测强度。
- 完成101个循环后，进行反向化学反应以完成第二轮测序：解冻配对末端试剂和第二轮测序掺入缓冲液（ICB，SBS试剂组分，Illumina），并加载试剂。
- 继续测序运行，评估2nd 随着运行的进行，读取强度、Q30 及其他质量指标。
3. 数据分析
- 使用最新版本的 CASAVA（Illumina，当前为 1.8.2）将碱基识别文件（.bcl）转换为 .fastq 文件，并将 fastq-cluster-count 设置为 0，以确保每个样本生成单个 fastq 文件。解压缩 fastq 文件以用于后续分析。
- 使用 TopHat（1.4.1）的最新版本5进行双端比对，该程序利用超高通量短读长比对工具 Bowtie（0.12.7）6 和 SAMtools（0.1.17）7 将 RNA-seq 读段比对至哺乳动物规模的基因组。SAMtools 提供多种用于处理 SAM 格式比对结果的实用工具。参考人类转录组可从 iGenomes 下载（www.illumina.com）。在运行 TopHat 时，我们采用所有默认参数设置，包括将文库类型选项设为 fr-unstranded（默认）。
- 使用 CuffLinks（1.3.0）8 软件包中的程序 CuffDiff，将凝血酶处理的细胞与对照细胞进行比较，基于人类参考转录组筛选出前者中差异表达的基因转录本。该比较可检测已知转录本的差异表达。使用 Microsoft Excel 以表格形式可视化结果。在运行 Cufflinks 程序时，我们采用所有默认参数设置。FPKM<0.05 且 p>0.05 的基因转录本被过滤剔除。
- 为检测新异构体，运行 Cufflinks 时不使用参考转录组。使用 Cuffcompare 将样本转录本文件与参考基因组进行比较，并使用 Cuffdiff 进行差异表达分析：一次以合并的凝血酶处理样本转录本文件作为参考基因组，另一次以合并的对照样本转录本文件作为参考基因组。使用 Microsoft Excel 以表格形式可视化结果。同样，FPKM<0.05 且 p>0.05 的基因转录本被过滤剔除。在此步骤之后，研究者可选择将新发现的转录本列表上传至 UCSC 基因组浏览器网站（http://genome.ucsc.edu/），通过人工检查验证其有效性。
- 将差异表达基因列表提交至 Ingenuity Pathway Analysis（IPA，www.ingenuity.com），以表征受凝血酶处理影响的基因和通路。在此步骤中，研究者可选择使用 CummeRbund（http://compbio.mit.edu/cummeRbund/），这是一个 R 软件包，旨在辅助并简化对 Cufflinks RNA-seq 输出结果的分析，帮助管理、可视化和整合 Cuffdiff 分析产生的全部数据。
4. 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）验证RNA-seq结果
- 按照步骤1.4至1.6所述，从对照组和凝血酶处理的HMVEC-LBl细胞中进行总RNA提取、RNA质量评估及RNA定量。
- 使用SuperScript III First-Strand Synthesis System RT试剂盒（Invitrogen，18080-051），根据制造商说明书，以每份样品1 μg总RNA合成互补DNA（cDNA）。
- 使用TaqMan Assay-on-Demand设计的寡核苷酸，在Applied Biosystems ViiA 7实时荧光定量PCR系统上进行qRT-PCR分析，检测CUGBP、Elav样家族成员1（CELF1, Hs00198069_m1）、范可尼贫血互补组D2（FANDCD2, Hs00276992_m1）、肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1, Hs01090170_m1）和β-actin（ACTB, Hs99999903_m1）。每个样品所用模板相当于5 ng总RNA。采用DDCt法进行定量分析，并以β-actin为内参进行归一化处理。每项检测至少进行三次生物学重复实验。
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结果
对于步骤1： 28S:18S比值传统上被用作RNA降解程度的指标。理想情况下，28S峰的面积应约为18S条带的两倍（比值为2），但在实际中往往难以达到这一理想比值。此外，通过分光光度法测得的28S:18S比值可能低估RNA的实际降解程度。为了更准确地量化RNA降解情况，从而评估RNA样本的质量，Experion系统会计算一个RNA质量指数（RQI）数值。RQI算法将RNA样本的电泳图谱与一系列标准化的、已知降解程度的RNA样本数据进行比较，自动输出一个介于10（完整RNA）到1（严重降解RNA）之间的评分。RNA样本的质量应至少达到RQI 7，理想情况下应高于8。 图2 展示了使用高质量RNA样本（RQI为8.4）所获得的Experion检测结果。
对于步骤2： 文库应在约250-300 bp处出现一条宽而明显的条带。图3展示了高质量文库的Experion检测结果。图4展示了标准曲线样品及一个未知样品（以深蓝色显示...
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讨论
关键步骤
RNA 操作：RNase 会降解即使是最高质量的 RNA，因此在 RNA 的分离、储存和使用过程中必须格外小心10。操作时应始终佩戴手套，以防止手部携带的 RNase 造成污染。应频繁更换手套，尤其是在接触皮肤、门把手或其他常见表面之后。应专用一套移液器用于 RNA 相关操作，且所有吸头和离心管均须为无 RNase 产品。RNA 的提取及后续应用应在人员流动较少的区域进行，并定期使用如 RNase-Zap 等去污产品对环境进行清洁。反复冻融也会导致 RNA 降解。为尽量减少此类情况，建议在 RNA 提取完成后立即分装，用于后续实验。或者，也可在提取后直接合成 cDNA，用于如 qRT-PCR 等下游应用。RNA 应储存于 -80 °C，并在使用过程中置于冰上。在使用前及使用过程中，应确保 RNA 样品充分解冻并充分涡旋混匀。
RNA的起始质量对于本实验方案的成功至关重要。使用降解或质量较差的RNA可能导致文库构建失败，或产生不足以用于测序的低产量。即使能够从降解或低质...
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致谢
作者谨此感谢 Stephen Kingsmore 博士及儿童仁慈医院与诊所儿科基因组医学中心提供计算集群用于我们的数据分析，感谢Illumina公司的现场服务团队（Elizabeth Boyer、Scott Cook 和 Mark Cook）以及技术顾问团队在下一代DNA测序仪HiScanSQ的运行和数据质量分析方面给予的迅速响应和有益建议。本研究部分得到美国国立卫生研究院基金项目HL080042（资助对象：S.Q.Y.）、密苏里大学堪萨斯城分校儿童仁慈医院与诊所的启动资金和捐赠基金（资助对象：S.Q.Y.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人肺微血管内皮细胞 | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza Bullet 培养基试剂盒 | Lonza | CC-3202 | 包含 EGM-2、胎牛血清（FBS）、生长因子和抗生素 |
| 凝血酶（Thrombin） | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana 试剂盒 | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNA酶清除剂（RNase-Zap） | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA 试剂 | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA 文库构建试剂盒 | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP 磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript 逆转录酶 II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K 试剂 | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SybrGreen 荧光定量试剂 | Qiagen | 204163 | |
| PE 簇生成试剂盒 | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX 控制试剂盒 | Illumina | FC110-301 | |
| 200 循环 SBS 试剂盒 | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR 仪 - Viia7 | Life Technologies | 型号 #VIIA7 / 设备编号 #10631261 | 或同等设备 |
| Experion 系统 | Bio-Rad | 7007001 | Bioanalyzer 为可替代系统 |
| 分光光度计 | Bio-Tek | Epoch 微孔板分光光度计 | 或同等设备 |
| 离心机 - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | 或同等设备 |
| 磁力架 | Life Technologies | AM10027 | |
| 96 孔 PCR 仪 | 通用实验室供应商 | ||
| 表 3. 关键试剂与主要设备清单。* 在视频中演示的是 HiSeq1000，而非 HiScanSQ。 |
参考文献
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