方法文章

RNA-seq的凝血酶处理和控制人肺微血管内皮细胞的转录组分析

DOI：

10.3791/4393

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2013年2月13日

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1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议提供了一个完整而详细的程序，申请一个功能强大的下一代DNA测序技术，RNA-seq技术，在人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗的个人资料转录。这个协议是一般化到各种细胞或组织中的影响不同的试剂或疾病状态。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过测量细胞中的mRNA水平的基因表达的特征是确定如何转录机制的细 ​​胞受到外部信号（ 如药物治疗），或不同的细胞如何健康状态和疾病状态之间的一个有用的工具。随着新一代DNA测序技术的出现和不断改进，RNA测序（RNA-seq的）已成为越来越受欢迎的转录组分析的方法进行编目所有种类的成绩单，以确定所有基因表达的转录结构和量化的表达水平的变化在一个给定的细胞，组织或生物体1,2的总组转录。 RNA-Seq是逐渐取代DNA微阵列转录组分析的首选方法，因为它有一个完整的转录组分析的优势，提供一个数字型数据（拷贝数的任何誊本），而不是依靠任何已知的基因组sequenCE 3。

在这里，我们提出了一个完整的，详细的协议，适用个人资料转录RNA-seq的人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗。该协议是基于我们最近发表的研究报告，题为"RNA-seq的揭示新型转录的基因及其亚型在人肺微血管内皮细胞凝血酶治疗，"4中，我们成功地完成了第一个完整的人肺微血管内皮细胞的转录组分析与凝血酶使用RNA-seq的治疗。进一步的实验，取得了前所未有的资源，获得洞察的分子机制，凝血酶介导的内皮功能紊乱的炎症性疾病，癌症，糖尿病和冠状动脉心脏疾病的发病机制，并为这些疾病的治疗目标，以提供潜在的新的线索。

此协议的描述性文本被分成四个部分。第一部分介绍了人肺微血管内皮细胞的凝血酶和RNA的提取，质量分析和定量分析的治疗。第二部分介绍了图书馆的建设和测序。第三部分描述了数据分析。第四部分描述的RT-PCR验证试验。显示了有代表性的几个关键步骤的结果。在讨论中提供有用的提示或预防措施，以提高成功的关键步骤。虽然该协议使用人肺微血管内皮细胞用凝血酶，它可以是广义在哺乳动物和非哺乳动物的细胞和组织中具有不同刺激物或抑制剂，或在细胞或组织之间的健康状态来比较转录处理的档案中转录和疾病状态。

方案

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概述本协议的流程图显示在图1。

1。处理过的细胞凝血酶，总RNA的提取，质量评价和定量RNA

  1. 培养人肺微血管内皮细胞（HMVEC-LBL）90-100％汇合在EGM-2培养基的6孔板中，5％FBS，生长因子和抗生素（龙沙，猫＃CC-3202）。
  2. 变更媒体饥饿媒体（0％FBS）30分钟前，用凝血酶处理。
  3. 治疗的细胞用0.05 U / ml凝血酶或留下未处理的作为控制6小时，在37℃和5％CO 2。
  4. 根据制造商的说明使用Ambion公司的的MIR瓦纳套件组和对照组的细胞，提取总RNA。
  5. 根据标准协议，在Experion的全自动电泳站（评估质量的RNA与的Experion StdSense真核RNA芯片的="_blank">生物技术有限公司www.bio-rad.com）。
  6. 量化的RNA，使用标准的分光光度测定方法。

2。图书馆的建设和测序

  1. 使用高品质的每个样品的总RNA作为起始原料的1微克。
  2. 要构建库，按照标准的程序，从Illumina公司（协议＃15008136修订版A）。在这个协议中，两回合的poly（A）含有基因的选择进行删除rRNA基因，以尽量减少rRNA序列。
  3. 评估质量的图书馆使用的Experion DNA 1K芯片根据协议在Experion自动电泳站（ 生物技术有限公司www.bio-rad.com ）的标准。
  4. 使用定量PCR量化库:使用一个库，先前已被测序的标准曲线和特异性引物的连接适配器。未知的库（ 即 1:100，1:500和1:1000）稀释的使用范围。运行的qPCR ACCO富于到的SyberGreen的MM协议，并计算每个库的原始股票的浓度。
  5. 10纳米和储存在-20°C，直到准备群集流动池稀释库股票。
  6. 在准备群集流动池，在水浴中解冻CBOT试剂板。 CBOT是一个Illumina公司的仪器，用于简化集群生成过程。
  7. 洗芝加哥期货交易所的仪器。
  8. 变性图书馆:联合13微升1×TE和6μl10μM的库，侧管，加入1微升的1 N NaOH（Illumina公司提供）。漩涡，旋转，室温孵育5分钟，放置在冰的变性库。
  9. 稀释库:用预先冷却的杂交缓冲液中稀释的变性图书馆（HT1，Illumina公司提供）由结合下午12点的最终浓度为996微升HT1和4微升变性库。将冰的变性及摊薄库。
  10. 反转每一行的CBOT板，管，确保所有试剂融化。自旋向下的板块，删除/穿刺的铝箔密封件，并加载到芝加哥期货交易所。
  11. 等分的120微升稀释的，变性的图书馆的带状管，标记为1-8。每管加入1.2μl稀释，变性PhiX控制库（Illumina公司）有穗的控制。涡街流量计和旋管，并加载它们在正确的方向芝加哥期货交易所（管＃1在右边）。
  12. 到芝加哥期货交易所加载的流动池和歧管。
  13. 完成流量检查，并开始运行的集群。
  14. 运行完成后，检查试剂提供的所有车道。请注意任何异常。无论是立即开始测序运行流动池或存储在所提供的管，在4℃下
  15. 解冻合成边测序（SBS，Illumina公司）试剂。
  16. 装入试剂的试剂盘到适当的位置，确保不要接触到其他试剂接触后的切割组合。
  17. 使用无N-测序流通池（ 即一个被测序），两次总理的试剂管线。
  18. 彻底清洁序流通池，用70％的乙醇和Kimwipes，其次是70％的乙醇和镜头纸。检查任何条纹的流动池。重新必要时进行清理。
  19. 加载到定序器的流动池，执行流量检查，以确保歧管之间的密封和流动池是紧。
  20. 启动的顺序运行。
  21. 评估，因为他们成为可用在运行过程中的质量指标（ 如群密度，通过过滤器的集群，Q30，强度）。
  22. 监视整个运行强度。
  23. 101周期完成后，执行完成第二次读取周转化学:解冻的的配对末端试剂和第二个读法团缓冲器（ICB，SBS试剂的一个组成部分，Illumina公司）和加载的试剂。
  24. 继续测序运行，评估第二次读强度，Q30一在运行过程中的第二等质量指标。

3。数据分析

  1. 使用最新版本的CASAVA（Illumina公司，目前为1.8.2）转换基地调用文件（BCL）文件。fastq文件，fastq簇数为0，以确保每个样品的一个单一的fastq文件的创建。用于下游分析解压缩的fastq的文件。
  2. 执行成对的末端对齐使用最新版本的顶帽（1.4.1）5，对齐RNA-seq的读取大小的哺乳动物基因组的超高通量短读定位器（蝴蝶结，0.12.7）6和SAMtools（0.1。 17）7。 SAMtools实现各种工具，用于处理后的SAM格式的结盟。参照人类转录组，可以下载从iGenomes（ www.illumina.com ）。在运行的顶帽，我们使用默认的参数设置，包括库类型"选项（默认）FR-unstranded。
  3. 我们8软件包ING方案CuffDiff的，部分的袖扣（1.3.0），比较凝血酶处理的细胞的控制细胞，筛选出的差异表达的基因转录在前者基于人类基准转录。这种比较检测到的差异表达已知的成绩单。使用Microsoft Excel的可视化结果以表格的形式。在运行袖扣程序，我们使用默认参数设置。这些基因的转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。
  4. 检测新亚型，运行袖扣无参考转录。比较样本抄本文件的参考基因组Cuffcompare，用合成凝血酶抄本文件作为一个分析和综合控制的参考基因组转录文件作为参考基因组的第二个分析测试的差异表达Cuffdiff，。使用Microsoft Excel在表格的形式来显示结果。同样，茨艾伦E基因转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。在这一步之后，研究人员可以选择上传一个新报告的成绩单列表的UCSC基因组浏览器网页（ http://genome.ucsc.edu/ ），通过手动检查以验证其有效性。
  5. 提交列表中差异表达的基因，以别出心裁的途径分析（IPA， www.ingenuity.com ）为特征的凝血酶治疗的基因和通路的影响。在这个步骤中，调查人员可以选择使用腰带（ http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ）的R套件，旨在帮助和简化的任务分析袖扣RNA-seq的输出，来帮助管理，可视化和整合生产的Cuffdiff分析所有的数据。

4。验证RNA-seq的结果实时定量宝lymerase链反应（定量RT-PCR）

  1. 执行提取总RNA控制的凝血酶治疗的HMVEC的-LBL细胞中，RNA质量评估和RNA定量描述的步骤1.4至1.6。
  2. 产生互补DNA来自1微克的总RNA，每个样品的SuperScript III第一链合成系统的RT试剂盒，按照制造商的说明（Invitrogen公司制，18080-051）。
  3. 一个美国应用生物系统公司VIIA 7实时PCR系统，利用TaqMan分析的需求设计的寡核苷酸检测CUGBP，ELAV likefamilymember1（CELF1，Hs00198069_m1），Fanconianemia，complementationgroupD2（FANDCD2，Hs00276992_m1），TNFreceptor进行定量RT-PCR分析相关因子1（TRAF1，Hs01090170_m1），和β-肌动蛋白（ACTB，Hs99999903_m1）。每个样品有一个相当于5 ng总RNA的模板。测量定量使用DDCT方法和规范，以β-肌动蛋白。每个试验进行过至少3次生物学重复。

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结果

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对于步骤1:28秒:18比传统使用的RNA的降解是一个指标。在理想的情况下，28秒峰值应具有约两倍的面积的18带（2）的比率，但是这理想比例往往不能在实践中看到。此外，28秒:18秒从分光光度测定方法得到的比率可以低估的量的RNA的降解。为了更精确地量化的退化，并因此的RNA样品的质量，的Experion系统计算的RNA质量指示符（RQI）号码。 RQI算法RNA样品的电泳图谱进行比较，从一系列的标准化，降解的RNA样品的数据，并自动返回10（完好核糖核酸）和1（降解的RNA）之间的一个数。 RNA的质量应该有一个RQI至少为7，最好大于8， 图2示出了使用高品质的RNA样品与8.4的RQI在Experion结果。

为第2步:图书馆应该有一个广阔的频段在约250-300基点。 图3示出了高品质的图书馆的Experion结果， 图4示出了标准曲线样品和一个未知样品（深蓝色中所示）的qPCR结果。整个运行的测序运行...

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讨论

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关键步骤

RNA处理核糖核酸酶会降低，即使是最优质的RNA，因此，护理时必须采取相应的隔离，储存和使用的RNA 10。总是戴手套，以防止污染由核糖核酸酶中发现人的手。手套应经常更换，尤其是接触皮肤后，门把手或其他常见的表面。一组吸液管应专门的RNA工作，所有的技巧和管应无RNA酶。 RNA分离和下游的应用程序，应进行低流量区域，常规的RNase-扎普如与产品去污。也可出现反复冻融循环降解。这可以最大限度地减少下游应用等分RNA后，立即隔离。或者，cDNA可以分离后直接用于下游应用如定量RT-PCR。 RNA应储存在-80℃下，在使用过程中，并保存在冰中。它也是小鬼ortant彻底解冻，涡前和使用过程中的RNA样品。

质量的RNA本协议的成功是必不可少的。低质量的RNA降解或以其他方式使用，可能会导致库准备失败或导致低收益率进行测序，这将是不够的。即使如果有足够多的库可以由退化或低质量的RNA，它不能精确地表示存在于样品中的转录，导致不准确的定量表达。此外，任何未除去的基因组DN...

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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作者会喜欢到感谢博士斯蒂芬金斯莫尔和的儿科基因组医学中心儿童慈悲医院和诊所为他们的计算集群为我们的数据分析的，Illumina公司的现场服务团队（伊丽莎白·博耶，斯科特·库克和马克库克）和技术顾问团队，为他们的快速反应和下一代DNA测序仪，HiScanSQ，和数据质量分析的运行有用的建议。这项工作是支持的，部分由美国国立卫生格兰特HL080042（SQY）启动基金和养老的儿童慈善医院和诊所在堪萨斯城，密苏里大学（SQY）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂和设备 公司 目录号 评论
人肺微血管内皮细胞龙沙 CC-2815
龙沙，子弹套件龙沙 CC-3202 包含EGM-2，FBS，生长因子和抗生素
凝血酶西格玛 T4393
Ambion公司MIR瓦纳套件 Life Technologies公司 AM 1560
核糖核酸酶-ZAP Life Technologies公司 AM9782
Experion的StdSens RNA Bio-Rad公司 700-7103
TruSeq RNA的制备试剂盒 Illumina公司 FC-122-1001
AMPureXP珠 Beckman Coulter公司 A63881
标逆转录酶II Life Technologies公司 18064-014
Experion的DNA 1K Bio-Rad公司 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen公司 204163
PE集群生成工具包 Illumina公司 PE-401-3001
PhiX控制工具包 Illumina公司 FC110-301
200周期SBS套件 Illumina公司 FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina公司 SY-103-2001
芝加哥期货交易所 Illumina公司 SY-301-2002
定量PCR机 - Viia7台 Life Technologies公司型号＃VIIA7 /设备＃10631261 或同等学历
Experion系统 BIO RAD 7007001 生物分析仪是一种替代系统
分光光度计 Bio-Tek的大纪元微孔板分光光度计或同等学历
离心机 - SORVALL传奇XTR Thermo Scientific的 75004521 或同等学历
磁性底座 Life Technologies公司 AM10027
96孔热循环仪一般实验室供应商
表3列出主要试剂和主要电子quipment。 *，在视频中，HiSeq1000证明而不是HiScanSQ的。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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