建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。
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摘要
摘要
传统的皮下肿瘤模型在研究结直肠癌时存在局限性。结直肠癌的原位小鼠模型使癌细胞在其自然解剖位置生长，能够高度真实地模拟人类疾病。建立该模型可采用两种技术。这两种技术相似，均需要对小鼠进行麻醉并实施剖腹手术以暴露盲肠。其中一种技术是将结直肠癌细胞悬液注射至盲肠壁。癌细胞首先在体外培养扩增，在未达完全融合时收获，并制备成单细胞悬液。注射时缓慢注入少量细胞悬液，以避免外漏。另一种技术是将一块皮下肿瘤组织移植到盲肠上。取一只已建立皮下结直肠肿瘤的小鼠，实施安乐死，采用无菌操作取出肿瘤，并将其分割为小块用于移植至其他小鼠。在移植前，需轻微损伤盲肠壁以促进肿瘤细胞浸润。原发肿瘤及肝转移的形成时间因所采用的技术、细胞系及小鼠品系不同而有所差异。该原位小鼠模型适用于研究结直肠癌的自然病程以及评估针对结直肠癌的新治疗药物。
关键词：原位模型，结直肠癌，小鼠模型，盲肠，细胞移植，肿瘤进展，肝转移，细胞注射
方案
一、细胞准备
- 在亚融合状态下培养并收获结直肠癌细胞。
- 用磷酸盐缓冲液制备单细胞悬液，并置于冰上保存。
二、肿瘤制备
- 处死一只已建立皮下结直肠肿瘤的小鼠。
- 采用无菌技术切除皮下肿瘤，并将其切成 2-3 mm 的组织块。
- 将肿瘤组织块置于冰上保存的磷酸盐缓冲液中。
III. 小鼠准备
注意：在我们的实验室中，我们使用吸入式异氟烷对小鼠进行麻醉；也可使用注射用麻醉剂以达到相同效果
- 通过夹捏脚趾评估麻醉深度。夹捏脚趾时应无回缩反射。
- 此时可给予抗生素。
- 将之前已剃毛的麻醉小鼠正确摆放体位。
- 用聚维酮碘溶液对腹部进行消毒处理。
- 以无菌方式覆盖腹部及手术区域。
四、剖腹手术
- 在皮肤上做一个小切口
- 抓住并提起腹壁肌肉组织
- 进入腹腔，并用剪刀的单侧刀片将腹腔内器官推开
- 将切口延长至 2-3 cm
五、暴露盲肠
- 识别并外置具有盲端袋状结构的盲肠
- 使用预先裁剪的无菌纱布将盲肠与小鼠其他部分隔离
- 使用温热的生理盐水保持盲肠湿润
六、将细胞注射至盲肠壁
- 使用27 G或更细的针头将50 µL细胞悬液注射至盲肠壁
- 移除针头
- 检查注射部位，确保无渗漏
- 将盲肠放回腹腔内
七、将肿瘤移植至盲肠
注意：除了将细胞注射到盲肠壁外，另一种方法是将肿瘤移植到盲肠上
- 使用6-0或7-0缝线在盲肠上缝合一圈8字缝合
- 轻柔损伤盲肠壁
- 然后将肿瘤组织块放置到位
- 打结固定缝线
- 将盲肠放回腹腔内
八、小鼠腹壁闭合与恢复
- 使用3-0或4-0规格的缝线，以三个间断缝合关闭小鼠腹壁
- 也可采用连续缝合方式
- 此时可给予术后镇痛剂和液体推注
- 让小鼠从麻醉中恢复
注意：使用吸入性麻醉剂时，此过程通常需要 30 秒
IX. 结果——原发性肿瘤与肝转移
原发肿瘤——原位显示（A），并可见新生血管形成证据（B）；H&E 染色显示肿瘤具有局部侵袭性（C）
肝转移灶——体外展示（D）
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讨论
尽管小鼠皮下肿瘤模型易于建立和监测，但显然该模型无法复制结直肠癌原有的解剖位置。由于微环境的差异，已在皮下生长的结直肠癌细胞已被证明会改变其表型，且几乎从不进展或发生转移1,2。事实上，肿瘤对治疗的反应可能因癌细胞被植入异位（皮下）还是原位而存在显著差异3。结直肠癌的小鼠原位模型使癌细胞在其自然位置生长，能够高度真实地模拟人类疾病。建立该模型的两种技术各有其独特的优缺点。将细胞悬液注射至盲肠壁，可引入先前在体外环境中培养、相对均一的结直肠癌细胞。然而，这些细胞在体外传代多次后，其侵袭或转移潜能可能降低。而移植一段皮下肿瘤组织，则可引入在体内已建立的、更具异质性的癌细胞群体。但此类肿瘤含有基质细胞，且常存在坏死区域，可能影响模型的一致性（个人交流，I. Fidler，MD Anderson）。从技术角度来看，我们实验室发现将细胞悬液注射至盲肠壁的操作难度较高，且存在注入肠腔或注射后泄漏的风险。有趣的是，已有研究描述了一种无需进行小鼠剖腹手术的直肠癌原位小鼠模型4。该方法中，小鼠经麻醉后，通过手指按压使直肠黏膜脱垂，随后将少量单细胞悬液的结直肠癌细胞注射至黏膜下层。小鼠在注射...
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致谢
加利福尼亚大学旧金山分校外科系
Raymond Shaheen，医学博士
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养基及组分 | 根据所使用的细胞系而有所不同 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | BioWhittaker | 17-512F | 也可由其他多家供应商提供 |
| 15 mL 聚丙烯离心管 | Corning | 430790 | |
| 带盖 6 孔板 | BD Biosciences | 353046 | |
| 直型带齿镊（虹膜镊） | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | 最好配备一对此类器械 |
| 直型锐头解剖剪（虹膜剪） | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| 持针器（普通型） | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| 持针器（Castroviejo 型） | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | 器械应定期高压灭菌，也可通过浸泡于 Cidex 中进行消毒 |
| 6-0 或 7-0 缝合线 | 用于盲肠缝合；由加州大学旧金山分校（UCSF）外科系提供 | ||
| 3-0 或 4-0 缝合线 | 用于腹壁缝合；由加州大学旧金山分校（UCSF）外科系提供 | ||
| 麻醉机 / 异氟烷（Isoflurane） | J.A. Baulch and Associates | 3206 | 也可由其他多家供应商提供 |
| 一次性加热垫，6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| 橙色胶带，13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | 用于固定麻醉后的小鼠 |
| Pro-Cord/无线修剪器 | Oster Professional Products | 78997-010 | 用于剃除小鼠体毛 |
| 聚维酮碘（Betadine） | Fisher Scientific | 19-027132 | 也可在任意医疗用品商店购买 |
| 2 x 2 英寸三层纱布 | Johnson & Johnson | 7635 | 也可在任意医疗用品商店购买 |
| 无菌手术巾（屏障型），16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | 也可在任意医疗用品商店购买 |
| 棉签，6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | 也可在任意医疗用品商店购买 |
| 10 mL 鲁尔锁接头注射器 | BD Biosciences | 309604 | |
| 1 mL 结核菌素注射器（滑动接头） | BD Biosciences | 309602 | |
| 27½ G 针头 | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G 针头 | BD Biosciences | 305106 |
参考文献
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
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