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内皮素-1诱导大鼠缺血性脑卒中模型结合激光多普勒血流仪引导的大脑中动脉阻塞

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DOI：

10.3791/50014

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2013年2月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida , 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran , 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida , 4Department of Neurology, University of Florida

本文内容

摘要

已开发出多种脑缺血动物模型以模拟人类中风状况。本方案描述了内皮素-1（ET-1）诱导的大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血性中风模型。此外，还讨论了该模型的重要注意事项、优势与局限性。

摘要

脑卒中是全球致残的首要原因，也是第三大死亡原因，仅2009年美国的相关费用估计就达700亿美元1, 2。目前已开发出多种脑缺血模型，以模拟人类脑卒中的病理状态。有研究指出，高达80%的脑卒中病例是由大脑中动脉（MCA）区域的缺血性损伤所致3。20世纪90年代初，研究人员通过开颅后将内皮素-1（ET-1）4直接施加于MCA表面来诱导缺血。随后，该模型被改进5，采用立体定位法将ET-1注射至MCA邻近区域，以产生局灶性脑缺血。该模型的主要优势包括操作快速、可通过调节ET-1剂量精确控制动脉收缩程度、无需干预脑外供血血管，以及再灌注过程较为缓慢，更接近人类脑卒中的再灌注情况5-7。然而，ET-1模型也存在一些缺点，例如需要进行开颅手术，且脑梗死体积的变异性较高8。通过在ET-1输注过程中使用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑血流，可有效降低这种变异性。影响脑梗死体积变异性的因素包括输注的精确性以及所用ET-1试剂批次的差异6。另一个重要考虑是，尽管再灌注在人类脑卒中中较为常见，但ET-1诱导的MCA闭塞（MCAO）模型中闭塞持续时间可能无法完全模拟人类情况，因为在许多患者中，闭塞后数小时至数天内会出现部分再灌注9, 10。本实验方案将详细描述在大鼠中建立ET-1诱导的MCAO缺血性脑卒中模型的操作步骤，并指出整个过程中需特别注意的事项及潜在局限性。

方案

本方案已获得佛罗里达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物照护与使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的要求。

材料

  1. 动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，Wilmington，MA，USA），手术时体重为250–300 g。
  2. 麻醉
    1. 吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，USA）
    2. 异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL，USA）
  3. 立体定位系统（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，USA）
    1. 小型动物立体定位仪
    2. 大鼠用非穿刺式耳杆
    3. 大鼠用气体麻醉头固定装置
  4. 体温调节
    1. BAT-12微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，....

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结果

1. 术后神经功能评估

动物恢复意识后，可采用多种测试评估神经功能缺损，包括平衡能力、抓握力量、足爪放置、姿势不对称性以及攀爬阶梯等。向日葵种子任务是一种对运动和感觉功能的粗略评估方法，其结果与梗死体积具有显著相关性7, 12。在此任务中，记录大鼠打开并吃掉5颗向日葵种子所需的时间。将5颗种子放置于一个空的、干燥的塑料笼子的一角，记录大鼠操作种子所用的时间。此外，还需记录所有种子被打开并食用后，笼内残留的壳碎片数量。神经功能缺损更严重的大鼠打开和食用种子所需时间更长，且会将种壳破碎成更多碎片。尽管并非该任务的正式组成部分，但在实验性脑卒中后的大鼠中，很容易观察到频繁误抓和掉落向日葵种子的现象。这包括主要使用一侧前爪，以及在尝试打开种壳时咬合无效等情况。

2. 脑梗死体积的染色与定量测量

在进行大脑中动脉（MCA）阻断和再灌注以建立短暂性脑缺血模型后，动物被实施安乐死，其冠状切片的脑组织采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，以评估梗死体积（

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讨论

内皮素-1（ET-1）诱导的MCAO是一种成熟的实验性缺血性脑卒中模型，已在多种大鼠品系中常规使用。使用该模型时，许多变量（如大鼠品系、动物年龄、体温、麻醉方法和操作者技术水平）可能导致梗死体积的变异性增加5, 14。然而，一些研究者指出，该模型的优势包括相对非侵入性的操作方式、脑血流量对ET-1呈剂量依赖性反应，以及可通过在清醒大鼠中输注ET-1完全避免使用麻醉14, 15。值得注意的是，文献中所使用的大鼠品系和年龄存在诸多差异，因此根据这些变量报告的立体定位坐标也有所不同并不令人意外。本方案中使用的坐标针对8周龄雄性Sprague Dawley大鼠进行了优化。若偏离该品系、性别或年龄，可能需要通过脑内注射染料并结合尸检来确定适用于该操作的有效坐标。此外，ET-1诱导的脑血流减少具有剂量依赖性。本方法所用剂量可导致注射同侧半球灰质约30–40%发生梗死，实验内均值的标准误约为4–5%7, 16。对大脑中动脉（MCA）近端部分进行直接观察显示，管腔直径在3分钟内降至基线水平的0%，并在约30分钟后恢复至基线水平7。利用激光多普勒血流仪（LDF）检测.......

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致谢

本研究得到了美国心脏协会大东南分会（09GRNT2060421）、美国医学会以及佛罗里达大学临床与转化科学研究所的资助。Adam Mecca 获美国国立卫生研究院/国立神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）NRSA 博士前 fellowship 项目支持（F30 NS-060335）。Robert Regenhardt 获佛罗里达大学高血压多学科培训项目（T32 HL-083810）博士前 fellowship 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
  1. 动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，美国马萨诸塞州威尔明顿），手术时体重为250–300 g。
  2. 麻醉：
    1. 吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，美国加利福尼亚州普莱森顿）
    2. 异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）
  3. 立体定位系统（David Kopf Instruments，美国加利福尼亚州图云加）：
    1. 小型动物立体定位系统
    2. 大鼠用非穿刺耳杆
    3. 大鼠用气体麻醉头部固定器
  4. 体温调节：
    1. BAT-12 微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔）
    2. T/PUMP，TP600 温控毯（Gaymar Industries, Inc.，美国纽约州果园公园）
  5. 外科器械
    1. 手术刀柄及#11刀片、虹膜镊、格拉夫镊、 bulldog夹牵开器、螺丝刀、10 μL 注射器配26号斜面针头（World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔）
    2. 微型电机钻及立体定位固定器，Quintessential 立体定位注射器（St–lting，美国伊利诺伊州伍德代尔）
    3. 1.0 mm 圆形钻头，1.0 mm 倒锥形钻头（Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，美国马里兰州盖瑟斯堡）
  6. 外科耗材
    1. 0-80 X 3/32 固定螺钉（轴长2.4 mm）、21号引导套管[底座以下4 mm长]及套管假体（Plastics one，美国弗吉尼亚州罗阿诺克）
    2. Jet义齿用丙烯酸树脂及液剂（Lang Dental Manufacturing Co., Inc.，美国伊利诺伊州韦林）
    3. 3.0 尼龙缝线（Oasis，美国伊利诺伊州梅塔瓦）
    4. 棉签，Puralube眼膏（Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡）
    5. 电动毛发剪（Oster，美国罗德岛州普罗维登斯）
  7. 化学试剂：
    1. 内皮素-1（American Peptide，美国加利福尼亚州森尼韦尔）
    2. 2% 氯己定（Agrilabs，美国密苏里州圣约瑟夫）
    3. 盐酸丁丙诺啡（Hospira Inc.，美国伊利诺伊州莱克福里斯特）
  8. 可视化设备
    1. 手术显微镜（Seiler Instrument and Manufacturing，美国密苏里州圣路易斯）
    2. 光纤照明器（TechniQuip Corp.，美国加利福尼亚州利弗莫尔）
  9. 激光多普勒血流仪系统（ADInstruments, Inc.，美国科罗拉多州科罗拉多斯普林斯）
    1. 标准铅笔探头
    2. 探头固定器
    3. 血流仪
    4. Powerlab 4/30 配 LabChart 7
  10. 梗死体积测量：
    1. 大鼠脑切片模具（Zivic-Miller Lab., Inc.，美国宾夕法尼亚州艾利森帕克）
    2. 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（Sigma-Aldrich Co.，美国密苏里州圣路易斯），用PBS稀释至0.05%
    3. 平板扫描仪（Epson Perfection V30，Epson America, Inc.，美国加利福尼亚州长滩）
    4. Image J 软件（ImageJ 1.42q 软件，美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达）

参考文献

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al.

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