利用颅窗技术观察内皮素-1诱导的中动脉闭塞期间的中脑动脉

摘要

本文介绍了一种通过颅窗和时序性颅骨切除术观察大鼠大脑动脉的方法，以可视化大脑中动脉的近端部分（图1）。该方法具有良好的适应性，可与多种药物递送技术结合，用于在活体（in vivo）条件下测量脑动脉的反应性。

摘要

颅窗制备是一种允许直接观察脑皮层表面结构的方法^1-3。该技术可在大鼠大脑表面多个位置实施，但最简便的方式是在易于接近的额骨或顶骨区域行颅骨切除术。我们最常将该技术与内皮素-1诱导的中动脉闭塞缺血性脑卒中模型联合使用，以定量分析将内皮素-1注射至邻近大脑中动脉（MCA）近端的脑实质后，大脑中动脉血管直径发生的变化^{4, 5}。为了在内皮素-1诱导的MCA闭塞过程中观察MCA的近端部分，我们采用一种在大鼠颅骨侧部的颞骨上制备颅窗的技术（图1）。脑动脉可在硬脑膜完整的情况下或在切开并牵开硬脑膜后进行观察。通常情况下，我们在观察过程中保持硬脑膜完整，因为内皮素-1诱导的MCA闭塞需要将血管收缩肽直接递送至脑实质，从而避免了为给药而直接在被观察血管上方切开硬脑膜的需要。本实验方案将逐步描述如何制备颅窗以观察脑动脉，并介绍如何避免该方法中许多潜在的技术难点。

方案

本方案已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的要求。

材料

1. 动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，Wilmington，MA，美国），手术时体重为250–300 g。
2. 麻醉
   1. 吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，美国）
   2. 异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL，美国）
3. 立体定位系统（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国）
   1. 小型动物立体定位仪
   2. 大鼠用无创耳杆
   3. 大鼠用气体麻醉头部固定器
4. 体温调节
   1. BAT-12微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，美国）
   2. T/PUMP，TP600温控毯（Gaymar Industries, Inc.，Orchard Park，NY，美国）
5. 手术器械
   1. 梅岑鲍姆剪刀、虹膜镊、鳄嘴钳牵开器、10 μl注射器配26号斜面针头、Bovie电凝器套装（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，美国）
   2. 微型电机钻（Stoelting，Wood Dale，IL，美国）
   3. 0.8 mm圆形钻头（Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，Gaithersburg，MD，美国）
   4. STORZ Bonn缝合镊（Bausch and Lomb, Inc.，Rochester，NY，美国）
6. 手术耗材
   1. 3.0尼龙缝线（Oasis，Mettawa，IL，美国）
   2. 棉签、Puralube眼膏（Fisher Scientific，Pittsburg，PA，美国）
   3. 外科缝合钉和胶带（Medtronic Xomed, Inc.，Jacksonville，FL，美国）
   4. 电动剃毛剪（Oster，Providence，RI，美国）
7. 化学试剂
   1. 内皮素-1（American Peptide，Sunnyvale，CA，美国）
   2. 2%氯己定（Agrilabs，St. Joseph，MO，美国）
8. 可视化设备
   1. 手术显微镜（Seiler Instrument and Manufacturing；St. Louis，MO，美国）
   2. Sony Handycam HDR-SR12（Sony，Minato，Tokyo，日本）
   3. 光纤照明器（TechniQuip Corp.，Livermore，CA，美国）
9. 血管直径测量
   1. VLC媒体播放器（Paris，法国）
   2. Image J软件（ImageJ 1.42q软件，美国国立卫生研究院，Bethesda，MA，美国）

1. 术前步骤

1. 手术前，大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，可自由获取水和啮齿类动物饲料。
2. 在诱导舱内使用含4%异氟烷的100% O₂气体混合物诱导麻醉。
3. 使用电动理发剪剃除头顶部的毛发。
4. 将大鼠俯卧位放置在吸水垫上，垫子置于温度可控的手术台面（加热毯）上，并将大鼠头部固定于立体定位仪中，首先安装气体麻醉面罩。
5. 随后插入并拧紧耳杆。
6. 手术过程中，通过含2%异氟烷的100% O₂气体混合物维持麻醉状态。
7. 在双眼涂抹眼用润滑软膏，并闭合眼睑，以防止手术过程中角膜干燥。
8. 插入直肠温度探头，以维持动物核心体温恒定在37±0.5 °C。
9. 将麻醉后的大鼠头部牢固固定于立体定位装置中后，使用氯己定和生理盐水交替清洗手术区域三次。

2. 颅窗前准备

在制作颅窗之前，应为大鼠植入其他必需的硬件设备，并完成所有必要的手术操作，以做好实验准备。在本方案中，我们此前已植入导管套管，用于内皮素-1（ET-1）诱导的中动脉闭塞（MCAO），具体方法见配套出版物《大鼠内皮素-1诱导中动脉闭塞缺血性卒中模型的激光多普勒血流仪引导技术》。

3. 颅窗的制备

在放置引导套管或实验所需设备后，制备颅窗以在卒中过程中直接观察大脑中动脉的近端部分。

1. 首先，使用剪刀从内侧开始向外侧切开覆盖在颞肌上的皮肤。
2. 使用电凝刀将颞肌一分为二，然后用3.0尼龙缝线牵拉暴露颞骨的鳞部。
3. 在眶后方、颧突起始部上方的颞骨鳞部区域，绘制一个约3–4 mm的正方形区域，该区域位于颧突自颞骨延伸出的位置之上。
4. 使用钻头逐渐将所标记的骨块从颞骨上分离。操作时应避免对钻头施加过大压力，以防损伤硬脑膜或大脑皮层。
5. 频繁使用无菌生理盐水冲洗，以改善手术视野的可视性，并防止颅骨过热。
6. 从一个较松动的角开始，使用精细的鼠齿镊小心移除颞骨骨块，同时注意避免撕裂与硬脑膜相关的任何血管。
7. 保持硬脑膜完整，并用无菌生理盐水冲洗清除碎屑。

4. 脑动脉收缩的记录

为了演示如何实时采集图像，本方案采用经ET-1诱导发生大脑中动脉闭塞（MCAO）的大鼠进行实验。

1. 在施用血管活性化合物之前，应至少记录1分钟的基础视频。对于ET-1诱导的MCAO，基础视频记录应在针头已插入脑实质但尚未注射ET-1时进行。
2. 启动注射泵开始注射，并持续记录1小时，或直至达到预设的实验终点。在视频记录期间，针头应保持原位，以防止焦平面受到干扰。
3. 大鼠应在该操作结束后，根据批准的实验方案进行深度麻醉并实施安乐死。

5. 图像分析

可视化的大脑中动脉（MCA）任意部位的血管直径均可测定。以其中一支MCA分支为例，我们将在ET-1注射前和注射后的时间点测量其血管直径。使用VLC媒体播放器（VideoLAN）以每分钟1帧的间隔从视频中截取静态图像。

1. 安装并打开 VLC 播放器。
2. 选择“工具”然后选择“偏好设置”，在“显示设置”下将设置更改为“全部”。
3. 在左侧边栏中展开“视频菜单”，然后展开“输出模块”。选择“场景滤镜”以打开场景视频滤镜菜单。
4. 在文件名前缀的输入框中输入“Scene”。
5. 定义一个目录路径前缀，用于保存静止帧图像。
6. 根据所需的静止帧捕获速率选择录制比率。如果视频的采集速率为每秒 29 帧，则应在输入框中输入“1749”（29 帧/秒 × 60 秒/分钟），以实现每分钟保存一张静止帧。所有更改完成后保存设置。
7. 随后在 VLC 播放器中打开目标视频，系统将自动每分钟保存一张静止帧图像。
8. 使用这些图像测量血管直径。首先打开 ImageJ 软件（NIH）。
9. 然后在 ImageJ 中打开需要测量的静止帧图像。
10. 选择“分析”菜单，打开“设置测量”选项，并取消勾选所有复选框。
11. 接下来选择直线工具。
12. 根据需要使用键盘快捷键“Ctrl +”放大图像，并绘制一条垂直于血管走向的直线以测量血管直径。
13. 最后，通过选择“分析”菜单中的“测量”选项（ctrl+M），获得血管直径的测量值。
14. 对每一幅静止帧中的每个待测血管，重复此过程至少三次，并取平均值。
15. 将每个时间点的血管直径归一化为基线血管直径，以便在多只大鼠之间进行比较。具体计算方法为：当前直径 / 基线直径 × 100%，得到每个血管相对于基线的百分比直径。

结果

从采集的视频中截取的静态图像显示，使用这种颅窗技术可以清晰地观察到注射ET-1后脑动脉直径的变化（图2）。在注射ET-1后的几分钟内，血管即开始收缩。最终血管将难以观察，脑组织也会变得苍白。大约20分钟后，ET-1的作用逐渐减弱，血管开始扩张，并在约45分钟后逐渐恢复至基线水平的直径。除了明显的血管收缩外，皮质表面在给予ET-1后也会变得更为苍白。如有需要，可使用经校准的显微镜测微尺计算血管直径的绝对变化量。为了在多只大鼠之间进行比较，我们计算实验过程中血管直径的相对变化。这些测量通过ImageJ软件（NIH）完成，随后可绘制出反映血管直径随时间相对变化的曲线图（图3）。

讨论

总之，这种颅窗制备技术具有很高的通用性，只需进行少量修改即可适应多种实验需求^{4, 5}。例如，我们已成功利用激光多普勒血流仪，通过颅窗直接观察大脑中动脉的特定分支，监测其局部脑血流量（Mecca AP 2009 和 2011）。此外，若在制备过程中切开硬脑膜，则可结合局部应用血管活性化合物，构建一个体内血管反应性灌流环境³。在制备颅窗时，应考虑多个因素，以降低该技术的失败率。其中许多因素与能否清晰观察脑动脉密切相关。首先，在进行颅骨切除时必须小心操作，避免钻头损伤其上方的硬脑膜或血管。这一点可通过频繁使用无菌生理盐水冲洗以清除碎屑并冷却颅骨来实现。其次，移除骨瓣时应轻柔操作。若骨瓣不易剥离，则应使用钻头进一步去除周围骨质。最后，少量血液或脑脊液都可能在操作过程中显著影响颅窗的观察效果。本方法所实施的颅骨切除范围略大于实际观察所需，因此可在手术区域的低垂部位放置若干吸水海绵，防止液体积聚。在更换这些海绵时，只要注意避免手术器械遮挡观察窗，即可根据需要随时更换。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸入麻醉系统	VetEquip 公司，普莱森顿，加利福尼亚州，美国	901806
异氟烷麻醉剂	Baxter Pharmaceutics，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德	1001936060
小型动物立体定位仪	David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国	900
非穿孔式耳杆，大鼠	David Kopf Instruments，Tujunga，CA，美国	957
大鼠气体麻醉头部固定器	David Kopf Instruments，美国加利福尼亚州图洪加	1929
BAT-12 微探针温度计	美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司	BAT-12
T/PUMP，保温毯	Gaymar Industries, Inc.，美国纽约州奥查德帕克	T/PUMP，TP600
梅岑鲍姆剪刀	美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司	501254
虹膜镊	World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔	15915
布狗钳拉钩	世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国	14119-G
10 μ1 支 26 号针头注射器	美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司	SGE010RNS
Bovie，高温电灼套装	美国佛罗里达州萨拉索塔市，世界精密仪器公司	500392
大鼠牙科镊 0.12	Stotz	E1811
微型马达钻机	Stoelting，Wood Dale，IL，美国	51449
0.8 mm圆形钻头	Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，美国马里兰州盖瑟斯堡	RS-6280C-1
STORZ Bonn 缝合钳	博士伦公司，纽约州罗切斯特市，美国
尼龙缝合线，3.0 号	Oasis，Mettawa，IL，美国	MV-663
棉签	Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国	22-029-488
Puralube 眼用软膏	美国宾夕法尼亚州匹兹堡费舍尔科学公司	NC0138063
电动理发剪	美国罗德岛州普罗维登斯，Oster	78005-301
ET-1 稀释至 80 μPBS 中的 M 浓度	美国加利福尼亚州森尼韦尔，American Peptide 公司	88-1-10A
氯己定，2%	Agrilabs，美国密苏里州圣约瑟夫	1040，修订版 6-06，NAC 编号：10580322
手术显微镜	Seiler Instrument and Manufacturing，美国密苏里州圣路易斯	Evolution xR6
索尼 Handycam	Sony，东京都港区，日本	HDR-SR12
光纤照明光源	TechniQuip Corp.，美国加利福尼亚州利弗莫尔	FO1–150
VLC 媒体播放器	（法国巴黎）
Image J 软件	美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马萨诸塞州，美国