有针对性的特定功能的微域的新皮质相结合的内源信号和双光子成像标记的神经元

摘要

用荧光染料标记细胞在预定的新皮层的功能性微域的一种方法。首先，本征信号光学成像用来获得一个功能图。双光子显微镜被用于标签和图像的神经元内微域的地图。

摘要

在非啮齿类哺乳动物初级视觉皮层的神经元聚集根据自己的喜好刺激的功能，如方向^1-4，5-7方向，眼优势^8,9和双眼视差^9。方位选择性是最被广泛研究的功能，并具有准周期的布局为择优取向的连续映射在整个初级视觉皮层^10,11是本。整合的突触，手机和网络的贡献，在这些功能的地图，以的刺激选择性的反应，需要杂交成像技术，跨越亚微米到毫米的空间尺度。与传统的内源信号光学成像，整体布局功能地图的整个表面上的视觉皮层可确定^12。 在体内双光子显微镜使用钙敏感染料的发展使一个确定SYNAPT到达¹³或记录个人的树突棘IC输入端的活动，同时从数以百计的单个神经元细胞体^6,14。因此，结合特性的信号与亚微米的空间分辨率的双光子显微镜成像提供准确地确定树突状段和细胞有助于在新皮质的任何功能的地图的微域的可能性。在这里，我们展示了一个高收益的方法快速获得皮质的方向图，针对一个特定的微域在这个功能的地图，用荧光染料标记细胞在非啮齿类哺乳动物。用于双光子成像具有相同的显微镜中，我们首先生成一个定向地图使用固有的信号的光学成像。然后，我们如何定位的利益，用微装有染料为标签的微域人口的神经元细胞体或标签的单个神经元的树突棘和轴突中是可见的体内。我们比以前的方法的改进，促进神经元的结构与功能的关系与亚细胞分辨率的新皮层的功能体系结构的框架中的一个考试。

方案

1。手术准备

1. 诱导麻醉，并持续监测心跳率，结束潮汐CO _2，脑电图，及温度。南卡罗来纳大学医疗机构动物管理和使用委员会批准了所有的程序，是基于我们以前出版^9,15。
2. 公开的背用手术刀切割皮肤表面的头骨。解剖的结缔组织，覆盖骨使用一个Brudon的刮匙。用棉签涂抹和棉花纱布清洁骨。应用骨蜡（如需要）的头骨，偶尔通过小使者静脉的出血停止。
3. 钛或不锈钢头板连接到所述颅骨（超过其中将执行开颅景点的区域）通过用黑色涂料（见材料 ）混合使用牙科用粘固剂。头板的中心的矩形开口中提供访问开颅和光学成像。将一个金属腔的头板。将作为该室的流体容器与水浸泡物镜成像。
4. 固定头板使用金属柱的 xy阶段。
5. 骨的大面积的薄的磁头板的矩形开口内，通过使用牙钻。被摊薄的区域必须远远超出计划开颅手术的边界。必须减薄高分辨率的图像时，取得的新皮层的，因为在开颅手术，骨的厚度将决定之间的盖玻片厚度的琼脂糖和新皮层表面的非啮齿类哺乳动物的厚头骨（见下文） 。
6. 钻一个2×2平方毫米的轮廓骨开颅手术。定期清洗室，用新鲜的人工脑脊液（ACSF）去除骨碎片，减少热能散发到底层的皮质。涂上骨蜡，偶尔出血停止。
7. LIFT＃3钳骨瓣。
8. 删除所有底层的硬脑膜，用细镊子（＃5CO）和Vannas春风似剪刀。硬膜在非啮齿类哺乳动物是厚的和不透明的，但可以在不同的层中除去。出血是罕见的，但可以停止任何血液残余物，应以明胶海绵和轻轻地从其余层的硬脑膜钳和冲洗学联的。最后一层是透明的硬膜，并通过软脑膜血管清晰可见。离开这最后一层硬脑膜完整的内在信号成像过程中，会提高成功率，为以后的双光子成像阶段的​​实验荧光钙指标的批量加载（见讨论）。
9. 滴一滴温暖的2％琼脂糖（溶解在ACSF），并立即将一个玻璃罩了开颅手术。检查开颅确保呼吸系统和心血管脉动是最小的通过使用外科解剖显微镜或两个目镜光子显微镜明视场模式。

2。内源信号的光学成像

1. 添加凝胶泡沫浸泡学联的盖片玻璃的外侧周围，以防止琼脂糖从干燥期间内在信号成像。
2. 将成像CCD相机的特性信号的标准C型安装的双光子显微镜（ 图1）的顶部的端口。将照明用光源附近的 xy阶段（ 图1A）上的气动工作台。定位和固定的光导过开颅手术和磁头板/室（ 图1B）。缩回主分色和反射镜下面的C型安装的端口，使得反射的红色光所需要的固有的信号将通过直接从开颅的CCD摄像机（ 图1C-D）。使用4倍的空中目标（0.13 NA，17毫米WD），2×2毫米视野是内在的信号成像。
3. 将热过滤器在L的飞行路径，以防止从加热皮质。使用一个过滤器，通过绿光（546纳米中心λ）和记录数字的参考图像的皮质表面血管。
4. 将在 z焦点移动到500微米以下的皮质表面。使用红色过滤器（630纳米中心λ）来照亮皮层内在的信号测量。位置使得皮质的表面被均匀地照射的导光体。屏蔽开颅从所产生的视觉刺激的显示的光。目前的视觉刺激和记录反射率数据的图像序列。在10分钟之内要产生一个定向地图，收集对应于4个重复序列8刺激（4方向和每个方向的两个方向）的数据。
5. 分析的特性的信号数据，以产生的假彩色定向地图。选择潜在目标区域的神经元的双光子的标签， 例如，方向风车奇异性-在地图上点所有的择优取向收敛（ 图2A）。叠加定向地图和皮质表面血管的图像（ 图2B-C）。使用的布局，功能结构域和大型水面舰艇的位置，选择一个目标位置，避免与大血管和动脉^15。

3。批量装载荧光钙指标

1. 准备20％的Pluronic / DMSO的溶液通过添加1 g的Pluronic于5μl的DMSO。加热该混合物，在60℃下10分钟，以完全溶解的Pluronic。允许该混合物冷却至室温。 4微升普朗尼克/ DMSO混合添加的荧光钙指示剂俄勒冈绿488 BAPTA-1 AM（OGB-AM）到50微克小瓶。然后加入1微升的红色染料（的Alexa Fluor 594，2mM的原液）和35微升溶液移液管（见材料 ）的最终浓度为1 mM的OGB-1 AM。超声波清洗半小时的解决方案冷藏水浴用0.45μm的过滤器，以除去杂质，然后离心。
2. 拉出长锥形吸移管具有外尖端直径为2.0-2.5微米。将5μl的染料混合物进入移液管。
3. 卸下的最后一层硬膜，以便吸移管插入和获得最高质量的双光子图像。
4. 确定为了达到其目标的皮质层的2/3，移液管必须放置在皮层表面上的确切位置。我们预定的皮质的目标是一个风车取向图（ 图2）中的奇异性。吸移管必须被驱动到皮质，在一个30°的角度，腔室的壁和目标之间传递。因此，标记的目标区域200微米以下的皮质表面，皮质表面上的吸液管进入位置将是约350微米的目标位置（ 图3中A，B）的侧方。
5. 移动的 xy阶段（该动物和pipette显微操纵器被放置）的中心的目标（ 图3C）的皮质表面下进入位置。使用20倍或40倍物镜的工作距离（WD）的至少3毫米（见材料 ），以确保吸液管将很容易地输入不接触的目标或骨沿着壁的开颅皮层。一旦条目的位置为中心的目标下，提高目标的Z位置由2毫米（ 图3D）。随着绿色外延荧光灯打开，以可视化的红色那样Alexa染料中的移液管，使用的显微操作的对角线轴，使移液管，直到它的端部的中心（和集中）根据以上皮质表面条目位置目标直接（ 图3E）。
6. 降低吸移管的吸移管的垂直方向（ 沿 z轴），直到到达皮质表面（ 图3F），而连续地观看通过移液管尖的OCU拉斯显微镜。用明视场照明，皮质表面血管和剩余脑膜膜（软脑膜和蛛网膜）是很容易看到的吸管接近皮质表面。如果吸移管未达到所需条目的位置，提高移液管并重新校准定位基于皮层的表面上的血管上的界标。
7. 删除的目的，灯芯过多的脑脊液从开颅手术，并使用无绒的吸收矛干燥相邻的骨。滴一滴温暖的3％琼脂糖（溶解在学联）以稳定的皮质通过开颅（ 图3G）是可见的。在非啮齿类动物中，3％琼脂糖以抑制脉动的神经元的荧光染料成功的摄取是必要的。对于内源信号光学成像是必要的，因为只有2％的琼脂糖结合的2％琼脂糖和盖玻片提供必要的稳定性。在这里，没有盖玻片用于染料加载步骤3％琼脂糖必要的。琼脂糖凝固后，将40倍的目标（0.8 NA，3.3毫米WD），并重新填写室学联。
8. 从明场切换双光子观赏和定位移液器吸头。使用显微操纵的对角线轴，使移液管，直到其前端到达皮层（ 图3H）中的所需深度。偶尔压力喷射喷的的染料混合物（几磅，每个脉冲0.1秒）将有助于防止吸头堵塞。由于OGB-1进入细胞后变得可见，红色Alexa的染料吸头内皮层的可视化是至关重要的。
9. 尝试加载皮层神经元的三分之二与全剂量的染料，重新聚焦的目标上的皮质表面确认的移液管尖端部的深度，并确保的前端是在目标位置的基础上的布局之前表面的血管。如果吸移管是在层2/3的染料混合物，小喷应该照亮细胞外空间，并揭示黑暗的阴影圆形细胞体密集的组装。
10. 加载神经元胞体皮质300-600微米直径的球体，染料混合物注入到细胞外空间使用30-90的脉冲，每个脉冲1.0秒，2-10磅。不应该是如此强烈，组织移动的脉冲压力。注射完成后，等待几分钟，然后取出的吸管和目标。等待1小时，以允许OGB-1 AM是充分考虑了由神经元。
11. 取出琼脂糖用于染料荷载和冲洗的记录室。将一小滴2-3％琼脂糖表面上，并迅速在开颅手术中放置一个玻璃罩。由于荧光染料的光敏感，避免过度曝光的皮质亮场或落射荧光光。 使用 xy阶段的目标到目标支架和中心标记的皮质下区域，将高NA（1.0）20倍的目标。屏蔽开颅手术前traneous光源， 如视觉刺激显示，使用多图层的遮光材料。

4。单细胞电穿孔的荧光染料

1. 为了研究树突状形态，准备的100μM的Alexa Fluor 594（1:20稀释2毫米的Alexa Fluor 594股票学联）的解决方案。功能成像的树突OGB盐可用于^16,17。
2. 拉出长锥形移液管的尖端尺寸为1μm，并加载到移液管的5微升染料。为目标的功能域的所有其他步骤是相同的批量加载方法（ 图1-3）。相邻的神经元细胞体膜的吸头定位，监控电极阻抗的增加和施加压力，喷染，照亮细胞外空间，并了解细胞体的阴影在双光子成像。
3. 当吸头相邻的神经元细胞体膜是，使用Axoporator的800A应用1-3脉冲（-8到-10 V，10毫秒的脉冲）。的神经元与染料的直接填充与双光子显微镜容易地可视化。取出吸管，并收集在体内的树突和轴突的高清晰度图像。

结果

为了说明我们的染料标记方法的精度，我们针对最小的微域非啮齿类动物的新皮质中的任何已知的功能图。在初级视觉皮层的方向图是稀疏穿插在整个奇点。这些发生在所有优选方位点收敛等，在优选的方向，周围的区域"风车"（ 图2A-B）的奇异性的样子的假彩色地图。每一个风车开颅手术选择染料标记（绿色圆圈在图2C），一定要避免大血管和小动脉，特别是^15。批量加载OGB凌晨1点，跟踪变化的序列定向光栅视觉刺激的神经元的钙离子指 ​​示剂荧光显示，单细胞分辨率功能地图的风车奇点（ 图4）。单细胞电穿孔，空间组织的树突和轴突炉火位于风车奇异性的神经元被确定在体内 （ 图5）。

讨论

我们提出一个方法来定位标签在预先确定的功能性微域的新皮层的神经元细胞体（或树突和轴突）。合并内在信号光学成像与双光子显微镜提供的可能性确定哪些突触和细胞有助于微域的任何功能的地图，是否选择性神经元的神经元中的功能图的位置，以及神经元电路相关组件这种变化的视觉体验⁷或应用临床治疗的药物^18。

据报道，在视觉皮层的成年野生型啮齿动物^6,19-21没有刺激方位，方向，眼优势，或双目视差图。但是，轻松的加载用荧光染料，实现成像稳定性，再加上强大的遗传工具，可用于小鼠的神经元，导致绝大多数的研究使用双光子成像正在执行在啮齿动物，而不是雪貂，猫，和猴子的大脑皮层。

高分辨率双光子成像技术在非啮齿类哺乳动物的神经元是非常具有挑战性，因为手术时间长，较厚的骨骼和持续时间，以及需要额外的步骤，保持呼吸系统和心血管系统的大脑至少¹⁵介导的脉动。从手术到固有的信号成像和内在的双光子成像的转变必须是有效的，要求及时编制试剂，染料和显微手术程序的执行。使用双光子显微...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
			1。生命支持/实验准备
异氟醚	韦伯斯特兽医	NDC 57319-474-05
异氟醚蒸发器	MIDMARK	VIP 3000
反馈调节加热毯	哈佛设备	50-7079F
心电监护仪	Digicare生物医学	LifeWindow精简版
脑电放大器	AM系统	1800
脑显示器	惠普	78304A
呼气末CO 2显示器	伟	Novametrix呼气Capnoguard 1265	优化通风
硬质合金钻头钻骨毛刺	亨利施恩	罚款（0.5毫米头），粗（1.25毫米头）
水泥磁头板/室	登士柏	675571，675572
黑火药滕佩拉漆	萨金特艺术公司	22-7185	巩固提高遮光，减少反射
琼脂糖 - Ⅲ型-A	西格玛	A9793	用于最小化内在信号和双光子成像过程中的脉动
盖玻片:5或8毫米，直径0.17毫米的厚度	世界精密剂量率仪	502040，502041	为了最大限度地减少脉动在成像过程中，根据需要可能会被切除玻璃罩
Brudon刮匙	乔治·蒂曼	105-715-0，105-715-3	清洁颅骨表面
骨蜡	爱惜	W31G	快速止血
棉签	电子显微镜科学	72308-05	清洁，干燥，骨面
杜蒙5CO钳	精细科学工具	11295-20	抓住各个层硬脑膜或软
Vannas春风似剪刀	精细科学工具	15000-03	切硬膜
明胶海绵	辉瑞公司	09-0396-05	要停止硬脑膜上出血
吸收矛	精细科学工具	18105-01	超快速和无绒排汗CSF
停电材料	Thorlabs公司	BK5	盾开颅手术
			2。染料制备/注射
二甲基亚砜（DMSO）的	西格玛	D2650
普朗尼克	西格玛	P2443
俄勒冈绿488 BAPTA-AM	Invitrogen公司	O6807	钙指示剂
的Alexa Fluor 594	Invitrogen公司	A10438
离心式过滤器（0.45μm孔径）	密理博	UFC30HV00	注射前要除去杂质
玻璃吸管拉马	萨特仪器	P97
高硼硅玻璃filamented毛细管（1.5毫米外径）	世界精密仪器	1B150F-4	染料弹射移液管
Microloader	Eppendorf公司	5242 956 003	加载染料吸管
微操作机器人	萨特仪器	MP-285	要定位移液管
压力脉冲控制器	派克汉尼汾	PicoSpritzer III	对于染料的压力注入
单细胞电穿孔	Molecular Devices公司	Axoporator 800A	有关染料的电穿孔
			3。本质IMA晋
4倍的目标（0.13 NA，17毫米WD）	奥林巴斯	UPLFLN4X
内在的硬件/软件	光学成像公司	成像仪3001 / VDAQ	情节成像软件是用于VDAQ
CCD相机	Adimec公司	Adimec公司-1000
光源电源	KEPCO	吃了15-15M
光源	光学成像公司	HAL 100	在皮层表面的光照强度为3-5毫瓦
绿色过滤器（用于血管图像）	光学成像公司	λ= 546 nm处（带通30纳米）	对于参考图像的表面脉管
红色过滤器（内在信号）	光学意马纳克公司	λ= 630 nm处（带通30纳米）	，要收集内在的信号
热过滤器	光学成像公司	KG-1
			4。双光子台/影像
双光子显微镜和软件	草原技术		Shen 等人 2012年的光路，过滤器和激光功率
掺钛蓝宝石激光器	光谱物理公司	麦态XF
20倍（0.5 NA，3.5毫米WD）	奥林巴斯	UMPLFLN20X	仅用于对准移液器超过开颅0.5 NA物镜（未用于两个光子成像）
20X（1.0 NA，2.0毫米WD）	奥林巴斯	XLUMPLFLN20X
40X（0.8 NA; WD3.3毫米）	奥林巴斯	LUMPLFLN40X/IR
航空表	新港	ST-200	从外部振动隔离准备
XY阶段	迈克机械有限公司（Attleboro，麻萨诸塞州）		放置在 xy阶段的实验对象和Sutter微操作机器人
			食谱 人工脑脊髓液 氯化钠（135毫摩尔），氯化钾（5.4毫摩尔），的MgCl 2（1.0毫摩尔），的CaCl 2（1.8毫摩尔），HEPES（5毫摩尔），pH为7.4 液14 氯化钠（150毫摩尔），氯化钾（2.5毫摩尔），HEPES（10mM的），pH值7.4