本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。
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本文内容
摘要
摘要
在非啮齿类哺乳动物的初级视皮层中，神经元根据其对刺激特征（如朝向）的偏好而聚集成簇1-4，方向5-7，眼优势8,9 和双眼视差9方位选择性是最广泛研究的特征，在整个初级视皮层中存在一种具有准周期性排列方式的连续方位偏好图谱10,11整合突触、细胞和网络层面的贡献，以揭示这些功能图谱中刺激选择性反应的形成机制，需要结合空间尺度从亚微米到毫米级的多种成像技术。利用传统的内在信号光学成像，可确定视觉皮层整个表面功能图谱的整体布局。12. 发育过程 体内 使用钙离子敏感性染料的双光子显微镜技术可用来确定到达单个树突棘的突触输入13 或同时记录数百个单个神经元胞体的活动6,14因此，将内在信号成像与双光子显微镜的亚微米空间分辨率相结合，有望精确定位新皮层中任何功能图谱微区所涉及的树突节段和神经元。本文展示了一种高效方法，可在非啮齿类哺乳动物中快速获取皮层方位图，并针对该功能图中的特定微区，利用荧光染料标记神经元。使用同一台双光子显微镜，我们首先通过内在信号光学成像生成方位图；随后展示如何使用装载染料的微电极针管，靶向感兴趣的微区，以标记一群神经元胞体或单个神经元，从而清晰显示其树突、树突棘和轴突。 体内我们对先前方法的改进，使得在新皮层功能架构的框架内，以亚细胞分辨率研究神经元的结构-功能关系成为可能。
方案
1. 手术准备
- 诱导麻醉，并持续监测心率、呼气末二氧化碳（CO2）、脑电图（EEG）和体温。所有实验程序均经南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会批准，并基于我们先前发表的方法9,15。
- 使用手术刀片切开皮肤，暴露颅骨背侧表面。用布鲁顿刮匙剥离覆盖在骨面上的结缔组织。使用棉签和纱布清洁骨面。根据需要在颅骨上涂抹骨蜡，以阻止通过细小导静脉偶尔发生的出血。
- 使用混合黑色颜料的牙科水泥将钛或不锈钢头板固定于颅骨上（位于即将进行开颅手术的目标区域上方）（参见材料部分）。头板中央的矩形开口可为开颅和光学成像提供通路。在头板上方安装一个金属腔室，该腔室将作为使用水浸物镜进行成像时的液体储液池。
- 使用金属柱将头板固定在xy位移台上。
- 使用牙科钻头对头板矩形开口内的大范围骨区进行减薄处理。需减薄的区域必须明显超出计划开颅区域的边界。对于非啮齿类哺乳动物，若需从新皮层获取高分辨率图像，则必须对较厚的颅骨进行减薄，因为在开颅部位，骨的厚度将决定盖玻片与新皮层表面之间琼脂糖层的厚度（见下文）。
- 在骨面上钻出一个2 × 2 mm的方形轮廓作为开颅区域。定期用新鲜的人工脑脊液（ACSF）冲洗腔室，以清除骨碎片并尽量减少向下方皮层传导的热量。根据需要涂抹骨蜡，以控制偶尔出现的出血。
- 使用#3镊子抬起骨瓣。
- 使用精细镊子....
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结果
为了说明我们染料标记方法的精确性，我们针对了非啮齿类动物新皮层中已知功能图谱中最小的微区。在初级视皮层的方向选择图谱中，稀疏分布着一些奇点。这些奇点出现在所有偏好方向汇聚的位置，在偏好方向的伪彩图中，奇点周围的区域呈现出类似“风车”状的结构（图2A-B）。每次开颅选择一个皮层柱进行染料标记（图中绿色圆圈） 图2C），特别注意避开较大的血管和微动脉15通过OGB-1 AM的大规模负载，追踪神经元钙指示剂荧光对一系列定向光栅视觉刺激的响应变化，可揭示围绕Pinwheel奇点的单细胞分辨率功能图谱图4）。通过单细胞电穿孔技术，确定了位于旋涡奇点处单个神经元的树突和轴突的空间分布。 体内 (图5).
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讨论
我们提出一种方法，用于在新皮层预先确定的功能微区中靶向标记神经元胞体（或树突和轴突）。将内在信号光学成像与双光子显微镜技术相结合，可揭示任何功能图谱中特定微区所涉及的突触和细胞，研究神经元的选择性是否与其在功能图谱中的位置相关，并解析随着视觉经验7或临床治疗药物应用18而发生变化的神经环路组分。
在成年野生型啮齿类动物的视觉皮层中，尚未报道有关刺激朝向、运动方向、眼优势或双眼视差的定位图谱6,19-20。然而，由于小鼠神经元易于加载荧光染料并实现稳定的成像，加之其拥有强大的遗传操作工具，使得绝大多数利用双光子成像技术对大脑皮层进行的研究均选择啮齿类动物，而非雪貂、猫或猴子。
在非啮齿类哺乳动物中进行高分辨率双光子神经元成像可能极具挑战性，原因包括手术时间较长、颅骨和硬脑膜更厚，以及需要额外步骤来最大程度减少呼吸和心血管系统引起的脑部搏动15。从手术阶段过渡到内在信号成像，以及从内在信号成像转为双光子成像的过程必须高效，这就要求及时准备试剂、.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究获得了美国国立眼科研究所R01EY017925和R21EY020985基金以及Dana与Whitehall基金会对P.K.的资助。我们还感谢Matthew Petrella在手术操作方面的协助；Grace Dion对图5A中所示树突的追踪；以及Pratik Chhatbar对稿件提出的修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>1. 生命支持/实验准备 | |||
| 异氟烷 | 韦伯斯特兽医 | NDC 57319-474-05 | |
| 异氟烷蒸发器 | Midmark | VIP 3000 | |
| 反馈调控加热毯 | 哈佛仪器公司 | 50-7079F | |
| 心电图监护仪 | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |
| 脑电图放大器 | A-M Systems | 1800 | |
| 脑电图显示监视器 | 惠普 | 78304A | |
| 终末呼气二氧化碳2 监测 | 瑞思迈 | Novametrix Capnoguard 1265 | 优化通风 |
| 用于钻骨的碳化钨钻头 | Henry Schein | 细（0.5 mm 尖端）和粗（1.25 mm 尖端） | |
| 头板/腔室用粘合剂 | Dentsply | 675571, 675572 | |
| 黑色粉末蛋彩画颜料 | Sargent Art 公司 | 22-7185 | 添加至水泥中以增强遮光性并减少反射 |
| 琼脂糖 - III-A 型 | Sigma | A9793 | 为减少固有信号成像和双光子成像过程中的脉动影响 |
| 盖玻片：5 或 8 mm 直径，0.17 mm 厚度 | World Precision Instruments | 502040, 502041 | 为减少成像过程中的搏动，可根据需要裁剪盖玻片 |
| 布鲁东刮匙 | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | 清洁颅骨表面 |
| 骨蜡 | Ethicon | W31G | 快速止血 |
| 棉签 | 电子显微镜科学公司 | 72308-05 | 清洁并干燥骨面 |
| Dumont #5CO 镊子 | Fine Science Tools | 11295-20 | 抓取硬脑膜或软脑膜的单层 |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-03 | 切开硬脑膜 |
| 明胶海绵 | 辉瑞 | 09-0396-05 | 止住硬脑膜上的出血 |
| 吸收尖峰 | 精细科学工具 | 18105-01 | 超快速无棉絮脑脊液导流 |
| 遮光材料 | Thorlabs | BK5 | 开颅术中的骨瓣成形 |
| <强>2. 染料配制／注射 | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 泊洛沙姆 | Sigma | P2443 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | 钙离子指示剂 |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |
| 离心过滤器（0.45 μm 孔径大小) | Millipore | UFC30HV00 | 注射前去除杂质 |
| 玻璃微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P97 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm） | World Precision Instruments | 1B150F-4 | 染料喷射移液管 |
| 微载样器 | Eppendorf | 5242 956 003 | 用于将上样染料加入移液器 |
| 显微操作仪 | Sutter Instruments | MP-285 | 移液管定位 |
| 压力脉冲控制器 | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | 用于染料的压力注射 |
| 单细胞电穿孔仪 | Molecular Devices | Axoporator 800A | 用于染料的电穿孔 |
| <强>3. 内源信号成像 | |||
| 4倍物镜（0.13 数值孔径，17 mm 工作距离） | Olympus | UPLFLN4X | |
| 固有硬件/软件 | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ 软件用于片段式成像 |
| CCD相机 | Adimec | Adimec-1000 | |
| 光源电源 | KEPCO | ATE 15-15M | |
| 光源 | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | 皮层表面的光强度为3-5 mW |
| 绿色滤光片（用于血管成像） | Optical Imaging Inc. | λ = 546 纳米（带通 30 纳米） | 用于表面血管结构的参考图像 |
| 红色滤光片（用于内在信号） | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm（带通30 nm） | 采集固有信号 |
| 热滤器 | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |
| <强>4. 双光子显微装置/成像 | |||
| 双光子显微镜及软件 | Prairie Technologies | 参见 Shen 等 2012 年用于光路、滤光片和激光功率 | |
| 钛宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |
| 20倍（0.5 数值孔径；3.5 毫米工作距离） | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA 物镜仅用于在颅窗上方对准移液管（不用于双光子成像） |
| 20x（1.0 数值孔径；2.0 mm 工作距离） | Olympus | XLUMPLFLN20X | |
| 40倍（0.8 数值孔径；3.3 毫米工作距离） | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |
| 气浮台 | 纽波特 | ST-200 | 从外部振动中制备分离样品 |
| xy 阶段 | 迈克’s 机械公司（马萨诸塞州阿特尔伯勒） | 实验对象与Sutter显微操作仪放置于 xy 载物台 | |
| <表格 边框="1"> <胸段> | |||
| <强>配方 | |||
| 人工脑脊液 | NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM)，CaCl2 （1.8 mM）、HEPES（5 mM）、pH 7.4 | ||
| 移液溶液14 | NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4 | ||
参考文献
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
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