本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在非啮齿类哺乳动物的初级视皮层中，神经元根据其对刺激特征（如朝向）的偏好而聚集成簇1-4，方向5-7，眼优势8,9 和双眼视差9方位选择性是最广泛研究的特征，在整个初级视皮层中存在一种具有准周期性排列方式的连续方位偏好图谱10,11整合突触、细胞和网络层面的贡献，以揭示这些功能图谱中刺激选择性反应的形成机制，需要结合空间尺度从亚微米到毫米级的多种成像技术。利用传统的内在信号光学成像，可确定视觉皮层整个表面功能图谱的整体布局。12. 发育过程 体内 使用钙离子敏感性染料的双光子显微镜技术可用来确定到达单个树突棘的突触输入13 或同时记录数百个单个神经元胞体的活动6,14因此，将内在信号成像与双光子显微镜的亚微米空间分辨率相结合，有望精确定位新皮层中任何功能图谱微区所涉及的树突节段和神经元。本文展示了一种高效方法，可在非啮齿类哺乳动物中快速获取皮层方位图，并针对该功能图中的特定微区，利用荧光染料标记神经元。使用同一台双光子显微镜，我们首先通过内在信号光学成像生成方位图；随后展示如何使用装载染料的微电极针管，靶向感兴趣的微区，以标记一群神经元胞体或单个神经元，从而清晰显示其树突、树突棘和轴突。 体内我们对先前方法的改进，使得在新皮层功能架构的框架内，以亚细胞分辨率研究神经元的结构-功能关系成为可能。
方案
1. 手术准备
- 诱导麻醉，并持续监测心率、呼气末二氧化碳（CO2）、脑电图（EEG）和体温。所有实验程序均经南卡罗来纳医科大学动物护理与使用委员会批准，并基于我们先前发表的方法9,15。
- 使用手术刀片切开皮肤，暴露颅骨背侧表面。用布鲁顿刮匙剥离覆盖在骨面上的结缔组织。使用棉签和纱布清洁骨面。根据需要在颅骨上涂抹骨蜡，以阻止通过细小导静脉偶尔发生的出血。
- 使用混合黑色颜料的牙科水泥将钛或不锈钢头板固定于颅骨上（位于即将进行开颅手术的目标区域上方）（参见材料部分）。头板中央的矩形开口可为开颅和光学成像提供通路。在头板上方安装一个金属腔室，该腔室将作为使用水浸物镜进行成像时的液体储液池。
- 使用金属柱将头板固定在xy位移台上。
- 使用牙科钻头对头板矩形开口内的大范围骨区进行减薄处理。需减薄的区域必须明显超出计划开颅区域的边界。对于非啮齿类哺乳动物，若需从新皮层获取高分辨率图像，则必须对较厚的颅骨进行减薄，因为在开颅部位，骨的厚度将决定盖玻片与新皮层表面之间琼脂糖层的厚度（见下文）。
- 在骨面上钻出一个2 × 2 mm的方形轮廓作为开颅区域。定期用新鲜的人工脑脊液（ACSF）冲洗腔室，以清除骨碎片并尽量减少向下方皮层传导的热量。根据需要涂抹骨蜡，以控制偶尔出现的出血。
- 使用#3镊子抬起骨瓣。
- 使用精细镊子（#5CO）和Vannas弹簧剪去除除最底层以外的所有硬脑膜。非啮齿类哺乳动物的硬脑膜较厚且不透明，但可逐层剥离。出血较为罕见，若发生可用明胶海绵（Gelfoam）止血，并用镊子轻轻夹除残留血液，同时用ACSF冲洗剩余的硬脑膜层。最终保留的硬脑膜层应透明，且软脑膜血管应清晰可见。在进行内在信号成像时保持此最内层硬脑膜完整，有助于提高后续双光子成像阶段中荧光钙指示剂整体负载的成功率（参见讨论部分）。
- 滴加一滴温热的2%琼脂糖溶液（溶于ACSF中），并立即在开颅区域上覆盖盖玻片。使用手术解剖显微镜或双光子显微镜的明场模式通过目镜检查开颅区域，确保呼吸和心血管搏动最小化。
2. 内源信号光学成像
- 在盖玻片外围添加浸有ACSF的明胶泡沫，以防止内在信号成像过程中琼脂糖干燥。
- 将固有信号成像CCD相机连接至双光子显微镜顶部的标准C型接口图1）。将照明光源放置在靠近光学平台的气浮台上 xy 阶段（图1A）。将光导置于颅骨开窗和头板/腔室上方，并固定好图1B）。撤回主二向色镜及C型接口端口下方的反射镜，使颅骨开窗处反射的红光可直接进入CCD相机，用于内源信号检测图1C-D使用4倍空气物镜（0.13 NA，17 mm工作距离），可获得2 × 2 mm的视场用于内在信号成像。
- 在光路中插入热滤光片，以防止皮层受热。使用可透过绿光（中心波长 λ 为 546 nm）的滤光片，并采集皮层表面血管的数字参考图像。
- 移动 z 将焦点置于皮层表面下方500 μm处。使用红色滤光片（中心波长λ为630 nm）照射皮层以测量内在信号。调整导光管位置，使皮层表面获得均匀照明。屏蔽视觉刺激显示器产生的光线对颅窗的干扰。呈现一系列视觉刺激并记录反射光数据图像。为在10分钟内生成方位取向图，需采集对应于8个刺激序列重复4次的数据（包含4种方位取向，每种取向包含两个运动方向）。
- 分析固有信号数据以生成伪彩色方位图。选择用于神经元双光子标记的潜在靶区。 例如， 方位偏好汇聚点——在方位图中所有偏好方位汇聚的点（图2A）。叠加方向图与皮层表面血管结构图像（图2B-C）。利用功能区的分布及大脑表面主要血管的位置来确定靶点，避开有大血管和小动脉的区域15.
3. 荧光钙离子指示剂的批量加载
- 通过将1 g Pluronic加入5 μl DMSO中，配制20% Pluronic/DMSO溶液。将混合物在60 °C加热10分钟，使Pluronic完全溶解。让混合物冷却至室温。取4 μl Pluronic/DMSO混合液加入一支含50 μg荧光钙指示剂Oregon Green 488 Bapta-1 AM（OGB-1 AM）的西林瓶中。然后加入1 μl红色染料（Alexa Fluor 594，2 mM储备液）和35 μl移液管溶液（见材料），使OGB-1 AM终浓度为1 mM。将溶液在冰浴中超声处理½小时，然后用0.45 μm滤器离心以去除杂质。
- 拉制尖端外径为2.0–2.5 μm的长锥形移液管。将5 μl染料混合液装入移液管中。
- 去除最外层硬脑膜，以利于移液管插入，并获得最高质量的双光子图像。
- 确定移液管在皮层表面的精确插入位置，以确保其能够到达皮层第2/3层的目标区域。我们预设的皮层目标是方位图中的风车奇点（图2）。移液管必须以30°角插入皮层，以便穿过记录 chamber 壁与物镜之间的间隙。因此，为了标记皮层表面下200 μm处的目标区域，移液管在皮层表面的进入位置应位于目标位置侧向约350 μm处（图3 A-B）。
- 移动xy载物台（动物和移液管微操纵器均置于其上），使皮层表面的进入位置位于物镜正下方（图3C）。使用工作距离（WD）至少为3 mm的20x或40x物镜（见材料），以确保移液管能顺利进入皮层，而不会触碰物镜或颅骨开窗边缘的骨组织。当进入位置位于物镜正下方后，将物镜的Z轴位置升高2 mm（图3D）。打开绿色落射荧光光源以观察移液管中的红色Alexa染料，使用微操纵器的对角轴移动移液管，使其尖端居中（并聚焦）于物镜正下方的皮层表面进入位置（图3E）。
- 沿z轴垂直降低移液管，直至其到达皮层表面（图3F），同时通过显微镜目镜持续观察移液管尖端。使用明场照明，当移液管接近皮层表面时，皮层表面的血管和残留的脑膜（软脑膜和蛛网膜）清晰可见。若移液管未到达预期进入位置，应抬高移液管，并根据皮层表面的血管标志重新校准定位。
- 取下物镜，用无尘吸水棒吸除颅骨开窗中的过量脑脊液，并用无绒吸收棒干燥周围骨组织。滴加一滴温热的3%琼脂糖（溶于ACSF）以稳定通过颅骨开窗暴露的皮层（图3G）。在非啮齿类动物中，3%琼脂糖对于抑制脉动、成功实现神经元对荧光染料的摄取至关重要。仅用于内在光学信号成像时，2%琼脂糖已足够，因为2%琼脂糖与盖玻片结合可提供必要的稳定性。此处染料加载步骤未使用盖玻片，因此必须使用3%琼脂糖。待琼脂糖凝固后，插入40x物镜（0.8 NA，3.3 mm WD），并重新用ACSF填充记录 chamber。
- 从明场切换至双光子成像模式，定位移液管尖端。使用微操纵器的对角轴移动移液管，使其尖端到达皮层中的目标深度（图3H）。间歇性施加染料混合液的压力喷射（每次几psi，脉冲持续0.1秒），有助于防止移液管尖端堵塞。由于OGB-1 AM仅在进入细胞后才可见，红色Alexa染料对于在皮层内可视化移液管尖端至关重要。
- 在尝试用全剂量染料加载皮层第2/3层神经元之前，应重新将物镜聚焦于皮层表面，确认移液管尖端的深度，并根据表面血管的分布判断其是否位于目标位置。若移液管位于第2/3层，轻微喷射染料混合液应能照亮细胞外空间，并显示出大量呈暗影状的圆形细胞体密集排列。
- 为在直径300–600 μm的皮层球形区域内加载神经元细胞体，使用30–90次脉冲将染料混合液注入细胞外空间，每次脉冲持续1.0秒，压力为2–10 psi。压力脉冲不应过强，以免引起组织移动。注射完成后，等待数分钟，然后取出移液管和物镜。等待1小时，使OGB-1 AM被神经元充分摄取。
- 移除染料加载时使用的琼脂糖，并冲洗记录 chamber。在皮层表面滴加少量2–3%琼脂糖，迅速将盖玻片覆盖于颅骨开窗上。由于荧光染料对光敏感，应避免皮层过度暴露于明场或落射荧光光源下。将高数值孔径（1.0）的20x物镜插入物镜架，使用xy载物台重新将标记的皮层区域置于物镜正下方。使用多层遮光材料屏蔽颅骨开窗，避免外界光源（例如视觉刺激显示器）干扰。
4. 荧光染料的单细胞电穿孔
- 用于研究树突形态时，配制100 μM Alexa Fluor 594溶液（将2 mM Alexa Fluor 594储备液用ACSF按1:20稀释）。为进行树突功能成像，可使用OGB盐16,17.
- 用拉制仪制备尖端直径为1 μm的长锥形移液管，并向其中加入5 μl染料。靶向功能区的其余所有步骤均与批量加载法相同（图1-3). 将移液管尖端置于神经元胞体膜附近时，监测电极阻抗的增加，并施加染料压力脉冲以照亮细胞外空间，在双光子成像过程中将细胞体显示为阴影。
- 当移液管尖端靠近神经元胞体膜时，使用 Axoporator 800A 施加 1–3 次脉冲（–8 至 –10 V，每次脉冲持续 10 毫秒）。通过双光子显微镜可清晰观察到神经元立即被染料填充。随后撤出移液管，并采集树突和轴突的高分辨率图像。 体内.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了说明我们染料标记方法的精确性，我们针对了非啮齿类动物新皮层中已知功能图谱中最小的微区。在初级视皮层的方向选择图谱中，稀疏分布着一些奇点。这些奇点出现在所有偏好方向汇聚的位置，在偏好方向的伪彩图中，奇点周围的区域呈现出类似“风车”状的结构（图2A-B）。每次开颅选择一个皮层柱进行染料标记（图中绿色圆圈） 图2C），特别注意避开较大的血管和微动脉15通过OGB-1 AM的大规模负载，追踪神经元钙指示剂荧光对一系列定向光栅视觉刺激的响应变化，可揭示围绕Pinwheel奇点的单细胞分辨率功能图谱图4）。通过单细胞电穿孔技术，确定了位于旋涡奇点处单个神经元的树突和轴突的空间分布。 体内 (图5).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们提出一种方法，用于在新皮层预先确定的功能微区中靶向标记神经元胞体（或树突和轴突）。将内在信号光学成像与双光子显微镜技术相结合，可揭示任何功能图谱中特定微区所涉及的突触和细胞，研究神经元的选择性是否与其在功能图谱中的位置相关，并解析随着视觉经验7或临床治疗药物应用18而发生变化的神经环路组分。
在成年野生型啮齿类动物的视觉皮层中，尚未报道有关刺激朝向、运动方向、眼优势或双眼视差的定位图谱6,19-20。然而，由于小鼠神经元易于加载荧光染料并实现稳定的成像，加之其拥有强大的遗传操作工具，使得绝大多数利用双光子成像技术对大脑皮层进行的研究均选择啮齿类动物，而非雪貂、猫或猴子。
在非啮齿类哺乳动物中进行高分辨率双光子神经元成像可能极具挑战性，原因包括手术时间较长、颅骨和硬脑膜更厚，以及需要额外步骤来最大程度减少呼吸和心血管系统引起的脑部搏动15。从手术阶段过渡到内在信号成像，以及从内在信号成像转为双光子成像的过程必须高效，这就要求及时准备试剂、...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究获得了美国国立眼科研究所R01EY017925和R21EY020985基金以及Dana与Whitehall基金会对P.K.的资助。我们还感谢Matthew Petrella在手术操作方面的协助；Grace Dion对图5A中所示树突的追踪；以及Pratik Chhatbar对稿件提出的修改意见。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>1. 生命支持/实验准备 | |||
| 异氟烷 | 韦伯斯特兽医 | NDC 57319-474-05 | |
| 异氟烷蒸发器 | Midmark | VIP 3000 | |
| 反馈调控加热毯 | 哈佛仪器公司 | 50-7079F | |
| 心电图监护仪 | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |
| 脑电图放大器 | A-M Systems | 1800 | |
| 脑电图显示监视器 | 惠普 | 78304A | |
| 终末呼气二氧化碳2 监测 | 瑞思迈 | Novametrix Capnoguard 1265 | 优化通风 |
| 用于钻骨的碳化钨钻头 | Henry Schein | 细（0.5 mm 尖端）和粗（1.25 mm 尖端） | |
| 头板/腔室用粘合剂 | Dentsply | 675571, 675572 | |
| 黑色粉末蛋彩画颜料 | Sargent Art 公司 | 22-7185 | 添加至水泥中以增强遮光性并减少反射 |
| 琼脂糖 - III-A 型 | Sigma | A9793 | 为减少固有信号成像和双光子成像过程中的脉动影响 |
| 盖玻片：5 或 8 mm 直径，0.17 mm 厚度 | World Precision Instruments | 502040, 502041 | 为减少成像过程中的搏动，可根据需要裁剪盖玻片 |
| 布鲁东刮匙 | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | 清洁颅骨表面 |
| 骨蜡 | Ethicon | W31G | 快速止血 |
| 棉签 | 电子显微镜科学公司 | 72308-05 | 清洁并干燥骨面 |
| Dumont #5CO 镊子 | Fine Science Tools | 11295-20 | 抓取硬脑膜或软脑膜的单层 |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-03 | 切开硬脑膜 |
| 明胶海绵 | 辉瑞 | 09-0396-05 | 止住硬脑膜上的出血 |
| 吸收尖峰 | 精细科学工具 | 18105-01 | 超快速无棉絮脑脊液导流 |
| 遮光材料 | Thorlabs | BK5 | 开颅术中的骨瓣成形 |
| <强>2. 染料配制／注射 | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 泊洛沙姆 | Sigma | P2443 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | 钙离子指示剂 |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |
| 离心过滤器（0.45 μm 孔径大小) | Millipore | UFC30HV00 | 注射前去除杂质 |
| 玻璃微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P97 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm） | World Precision Instruments | 1B150F-4 | 染料喷射移液管 |
| 微载样器 | Eppendorf | 5242 956 003 | 用于将上样染料加入移液器 |
| 显微操作仪 | Sutter Instruments | MP-285 | 移液管定位 |
| 压力脉冲控制器 | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | 用于染料的压力注射 |
| 单细胞电穿孔仪 | Molecular Devices | Axoporator 800A | 用于染料的电穿孔 |
| <强>3. 内源信号成像 | |||
| 4倍物镜（0.13 数值孔径，17 mm 工作距离） | Olympus | UPLFLN4X | |
| 固有硬件/软件 | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ 软件用于片段式成像 |
| CCD相机 | Adimec | Adimec-1000 | |
| 光源电源 | KEPCO | ATE 15-15M | |
| 光源 | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | 皮层表面的光强度为3-5 mW |
| 绿色滤光片（用于血管成像） | Optical Imaging Inc. | λ = 546 纳米（带通 30 纳米） | 用于表面血管结构的参考图像 |
| 红色滤光片（用于内在信号） | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm（带通30 nm） | 采集固有信号 |
| 热滤器 | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |
| <强>4. 双光子显微装置/成像 | |||
| 双光子显微镜及软件 | Prairie Technologies | 参见 Shen 等 2012 年用于光路、滤光片和激光功率 | |
| 钛宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |
| 20倍（0.5 数值孔径；3.5 毫米工作距离） | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA 物镜仅用于在颅窗上方对准移液管（不用于双光子成像） |
| 20x（1.0 数值孔径；2.0 mm 工作距离） | Olympus | XLUMPLFLN20X | |
| 40倍（0.8 数值孔径；3.3 毫米工作距离） | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |
| 气浮台 | 纽波特 | ST-200 | 从外部振动中制备分离样品 |
| xy 阶段 | 迈克’s 机械公司（马萨诸塞州阿特尔伯勒） | 实验对象与Sutter显微操作仪放置于 xy 载物台 | |
| <表格 边框="1"> <胸段> | |||
| <强>配方 | |||
| 人工脑脊液 | NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM)，CaCl2 （1.8 mM）、HEPES（5 mM）、pH 7.4 | ||
| 移液溶液14 | NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4 | ||
参考文献
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
