自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。
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摘要
摘要
前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤。尽管手术治疗存在导致阳痿和尿失禁的重大风险，传统的化学治疗手段也大多未能取得显著疗效。激素治疗在早期阶段有效，但随着激素难治性肿瘤的出现，往往最终失败。我们一直致力于开发针对肿瘤细胞特定代谢缺陷的治疗策略。我们近期发现，前列腺肿瘤细胞特异性缺乏一种参与氨基酸精氨酸合成的酶——精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase，简称 ASS）1。这一缺陷使肿瘤细胞依赖外源性精氨酸，当精氨酸脱亚胺酶（ADI）耗尽游离精氨酸时，细胞将经历代谢应激1,10。事实上，我们已证实人类前列腺癌细胞 CWR22Rv1 在 ADI 作用下可通过非胱天蛋白酶依赖性凋亡以及强烈的自噬（或称巨自噬）被有效杀灭1,2,3。自噬是一种在进化上保守的过程，可使细胞在营养缺乏期间通过溶酶体降解代谢不需要的蛋白质4,5。尽管该通路的关键组分已被充分表征6,7,8,9，其分子机制的许多方面仍不明确——特别是，自噬在 ADI 治疗后前列腺癌细胞死亡反应中扮演何种角色？为回答这一问题，我们需要一种实验方法来定量检测细胞中自噬反应的程度和范围；由于目前尚无已知的分子标志物能够准确追踪这一过程，我们选择建立一种基于成像的方法，采用定量三维荧光显微镜技术11,12。
利用特异性标记了自噬体和溶酶体荧光探针的CWR22Rv1细胞，我们证明了通过宽场去卷积显微镜（后续还使用了超分辨率结构光照明显微镜）获取的三维图像堆栈能够清晰地捕捉自噬诱导的早期阶段。借助 commercially available 数字图像分析软件，我们可以轻松获得任意成像细胞中自噬体和溶酶体的数量、大小、分布及其共定位程度的统计信息。这些信息使我们能够精确追踪活细胞中自噬的进程，并推动我们进一步研究自噬在癌症化疗中的作用。
方案
第一部分：细胞培养与免疫荧光标记
- 将CWR22Rv1人前列腺肿瘤细胞培养于置于6孔板中的玻璃盖玻片（#1.5或170 μm厚度）上，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI培养基（Mediatech，VA）。
- 通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入精氨酸脱亚酶（ADI，0.3 μg/ml）处理选定样本，以诱导自噬。
- 用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific，NH）固定细胞，每张盖玻片加100 μl，室温孵育10分钟。
- 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
- 用含0.05%皂苷（Sigma，MO）的HEPES（HBS）/BSA溶液对细胞进行透化处理，每张盖玻片加100 μl，室温孵育15分钟。
- 免疫标记前，用含2.5%酪蛋白（Sigma，MO）的HBS/BSA溶液封闭样本，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。
- 将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的一抗孵育，每张盖玻片加100 μl，4 °C过夜（O/N）。
- 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
- 将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的二抗孵育，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。
- 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
- 使用含4',6-二脒....
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结果
所示图像序列 图1 展示了CWR22细胞在自噬诱导前80分钟内发生的物理变化。在此研究及其他未展示的研究中，我们 consistently 观察到：（1）细胞核从细胞中心位置发生位移；（2）黏着斑数量减少；（3）自噬体和溶酶体整体向细胞中心区域转运。此外，我们还观察到在较晚时间点，自噬体（绿色）与溶酶体（红色）之间的共定位（以黄色表示）有轻微增加。
为了演示基于图像的细胞计数技术，我们使用了 VoloCITY 数字成像应用套件（版本 6.0，Improvision/Perkin-Elmer）来识别、计数并统计 图1 所示 CWR22 细胞图像中标记的自噬体和溶酶体，并收集相关统计数据。如 图2 中的图表所示，自噬体在初始形成并出现后，其数量和大小随时间发生变化：在诱导自噬 80 分钟后，自噬体的数量逐渐但总体呈下降趋势（图2A），同时其平均尺寸相应增加（图2B）。此外，根据皮尔逊相关系数分析，自噬体与溶酶体之间的共.......
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讨论
尽管使用针对LC3的荧光探针标记细胞并进行直接观察已被广泛接受为确认自噬反应的标准方法6，但对同一系统进行定量三维成像（正如我们所做的）能够提供前所未有的信息和细节，揭示细胞自噬过程的复杂性。特别是我们观察到，在自噬诱导后的80分钟内，活细胞中会形成数百个（甚至可能数千个）自噬体。同样，我们还观察到在自噬诱导过程中溶酶体区室分布发生了非常有趣的形态学变化。在单个细胞内，随着时间推移，自噬体数量减少，同时其平均尺寸相应增大，这表明自噬体通过彼此融合而增大体积，随后再与溶酶体融合形成自溶体。对活细胞进行高分辨率三维荧光成像使我们能够探究：自噬体是否必须达到某一临界尺寸才能与溶酶体融合，或者自噬过程是否也可在较小的物理尺寸下直接进行。事实上，考虑到在自噬早期激活阶段出现的大量极小自噬体，其尺寸仅接近去卷积显微镜的分辨极限，而在OMX结构光照明显微镜13上则能更清晰地分辨，很可能大部分自噬活动实际上正是在这一尺度上发生的。
在自噬过程中监测活细胞的能力至关重要，因为在特定细胞中自噬体的数量和大小变化可能较小，而不同细胞间这些参数的差异却相对较大.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
基金支持：NIH CA165263、NIH CA150197、NIH CA150197S1（H.J. Kung）、NIH CA150197S1（C.A. Changou）、NSF PHY-0120999 生物光子学科学与技术中心（D.L. Wolfson, F.Y.S. Chuang）、DOD PC073420（R.J. Bold）、挪威研究理事会、Leiv Eiriksson 出国研修奖学金 209286/F11（B.S. Ahluwalia）。H.J. Kung 还感谢 Auburn 社区癌症捐赠基金的支持。R.J. Bold 还感谢 J. McDonald 捐赠基金的支持。
我们感谢 DesigneRx 的 Jenny Wei-Jen Kung 博士和 Bor-wen Wu 博士慷慨提供 ADI。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 精氨酸脱亚氨酶（ADI） | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| 酪蛋白 | Sigma | C5890 | |
| 多聚甲醛 | Fisher | 4042 | |
| 皂苷 | Sigma | S4521 | |
| Alexa 抗小鼠 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa 抗兔 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 抗-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| 抗-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm 聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿 | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm 盖玻片 | Corning | #2865-22 | |
| 显微镜载玻片 | Globe Scientific | 1324G |
参考文献
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al.
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