利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

摘要

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。

摘要

前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤。尽管手术治疗存在导致阳痿和尿失禁的重大风险，传统的化学治疗手段也大多未能取得显著疗效。激素治疗在早期阶段有效，但随着激素难治性肿瘤的出现，往往最终失败。我们一直致力于开发针对肿瘤细胞特定代谢缺陷的治疗策略。我们近期发现，前列腺肿瘤细胞特异性缺乏一种参与氨基酸精氨酸合成的酶——精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase，简称 ASS）¹。这一缺陷使肿瘤细胞依赖外源性精氨酸，当精氨酸脱亚胺酶（ADI）耗尽游离精氨酸时，细胞将经历代谢应激^1,10。事实上，我们已证实人类前列腺癌细胞 CWR22Rv1 在 ADI 作用下可通过非胱天蛋白酶依赖性凋亡以及强烈的自噬（或称巨自噬）被有效杀灭^1,2,3。自噬是一种在进化上保守的过程，可使细胞在营养缺乏期间通过溶酶体降解代谢不需要的蛋白质^4,5。尽管该通路的关键组分已被充分表征^6,7,8,9，其分子机制的许多方面仍不明确——特别是，自噬在 ADI 治疗后前列腺癌细胞死亡反应中扮演何种角色？为回答这一问题，我们需要一种实验方法来定量检测细胞中自噬反应的程度和范围；由于目前尚无已知的分子标志物能够准确追踪这一过程，我们选择建立一种基于成像的方法，采用定量三维荧光显微镜技术^11,12。

利用特异性标记了自噬体和溶酶体荧光探针的CWR22Rv1细胞，我们证明了通过宽场去卷积显微镜（后续还使用了超分辨率结构光照明显微镜）获取的三维图像堆栈能够清晰地捕捉自噬诱导的早期阶段。借助 commercially available 数字图像分析软件，我们可以轻松获得任意成像细胞中自噬体和溶酶体的数量、大小、分布及其共定位程度的统计信息。这些信息使我们能够精确追踪活细胞中自噬的进程，并推动我们进一步研究自噬在癌症化疗中的作用。

方案

第一部分：细胞培养与免疫荧光标记

1. 将CWR22Rv1人前列腺肿瘤细胞培养于置于6孔板中的玻璃盖玻片（#1.5或170 μm厚度）上，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI培养基（Mediatech，VA）。
2. 通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入精氨酸脱亚酶（ADI，0.3 μg/ml）处理选定样本，以诱导自噬。
3. 用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific，NH）固定细胞，每张盖玻片加100 μl，室温孵育10分钟。
4. 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
5. 用含0.05%皂苷（Sigma，MO）的HEPES（HBS）/BSA溶液对细胞进行透化处理，每张盖玻片加100 μl，室温孵育15分钟。
6. 免疫标记前，用含2.5%酪蛋白（Sigma，MO）的HBS/BSA溶液封闭样本，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。
7. 将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的一抗孵育，每张盖玻片加100 μl，4 °C过夜（O/N）。
8. 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
9. 将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的二抗孵育，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。
10. 用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。
11. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的SlowFade Gold或Prolong Gold抗荧光淬灭试剂（Invitrogen，CA），将制备好的盖玻片封片于普通载玻片上。
12. 用指甲油密封盖玻片边缘。为获得最佳成像效果，应给予足够时间（理想情况下过夜）使抗荧光淬灭封片剂充分渗透细胞。
13. 用甲醇和/或氯仿清洁盖玻片表面。
14. 在60倍、数值孔径1.42的物镜（Olympus，日本）上滴加浸油（37 °C成像时折射率为1.520，室温成像时为1.516）。
15. 将载玻片置于显微镜载物台上，并对目标细胞进行调焦。

2. 第2部分：活体成像前的细胞准备

1. 在含有10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中，将表达绿色荧光蛋白标记的轻链3（LC3-GFP）的CWR22Rv1细胞接种于35 mm多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿（MatTek，MA）中进行培养。细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不可过高，以免在成像时细胞过度生长并聚集成团。
2. 用PBS中的ADI（0.3 μg/ml）处理选定的细胞样本。
3. 成像前约1小时，将1.5 μl LysoTracker Red DND-99（Invitrogen，CA）溶于20 ml含10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中。对于选定样本，使用含ADI的溶液。在加入培养皿前，将所有培养基预热至37 °C。
4. 将细胞在含LysoTracker Red DND-99的RPMI培养基中，于37 °C孵育15–45分钟。
5. 成像前约30分钟，开启WeatherStation环境控制箱，并使其内部环境平衡至37 °C、5% CO₂（使用加湿空气）。
6. 用PBS洗涤细胞，更换为仅含10% FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。根据需要向样本中添加ADI。
7. 将35 mm玻璃底培养皿安装至定制适配器（Applied Precision, Inc.，WA）中，并置于显微镜载物台上。在60倍、数值孔径1.42的物镜上使用浸油（折射率1.520），并将安装好的培养皿放置于载物台指定位置。

3. 第三部分：去卷积显微镜与分析

本节方案假设使用 DeltaVision Personal DV 去卷积显微镜及配套的 SoftWorX 应用软件套装（Applied Precision, Inc., WA）。

1. 打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。启动 Resolve3D 软件以初始化显微镜载物台，并开启氙灯光源。等待 10 min，使光源预热并达到稳定状态。
2. 在60倍1.42数值孔径物镜上滴加一滴浸油（活体样本在37 °C时折射率为1.520，固定样本在室温下为1.516），将载玻片标本（盖玻片朝下）置于物镜中央。
3. 使用明场或外部照明，并通过粗调焦旋钮缓慢升高物镜，直至浸油液滴接触到倒置的盖玻片。（此后，通过微调焦旋钮旋转几圈即可使细胞层清晰对焦）。在载玻片上观察固定样品时，建议避开气泡内部或附近的细胞区域。使用玻璃底培养皿观察活细胞样品时，应避免将物镜移出盖玻片边界的范围。
4. 自噬体可通过 eGFP 信号（绿色）进行鉴定。溶酶体通过 LysoTracker Red（活体样本）或抗 Lamp1 荧光抗体（固定样本）进行鉴定。细胞核通过 DAPI 染色（固定样本）进行鉴定。
5. 选择合适的视野。理想情况下，细胞应在所有相应的荧光通道中表现出良好的荧光信号，并且在盖玻片表面充分贴附和铺展，以便于观察细胞内结构。可通过计算机使用 Acquire3D 界面调节 x、y 和 z 轴方向的微小位移和焦距。根据所需的视野大小设置像素合并模式为 1x1 或 2x2（当设置为 2x2 时，视野中可观察到更多的细胞）。
6. 对于通过细胞中段的给定图像，设置曝光参数（例如 %透射功率和曝光时间，使最大像素强度不超过3,000计数。通常应将%透射设置为尽可能低，同时避免相应曝光时间超过1秒。对每种待成像的荧光颜色及每个独立的视野均重复此步骤，以获得最高质量的图像。
7. 通过调节焦距，分别略超出细胞样本的顶部和底部，以设定Z轴层叠的上限和下限。因此，给定Z轴层叠中的图像总数将由这两个限值以及层间间距（默认值：0.2 μm）共同决定。
8. 为尽量减少图像采集过程中的运动伪影，我们建议对固定样品采用“先波长后z轴堆叠”的图像采集模式，对活体样品采用“先z轴堆叠后波长”的图像采集模式。
9. 使用SoftWorX（Applied Precision，WA）对荧光图像进行去卷积处理，随后使用VoloCITY（Improvision，现为Perkin Elmer，MA）进行分析。

4. 第四部分：超分辨率结构照明显微镜（OMX）

本节中的方案适用于 OMX 结构照明显微镜（Applied Precision，WA）的操作。

1. 打开主电源及所需激光器（410 nm、488 nm 和/或 532 nm）。等待 20 分钟，使激光器达到热稳定状态。
2. 在 60X 1.42 N.A 物镜上滴加浸油（室温下固定样品用，折射率为 1.516）。若油滴中出现气泡，需清洁物镜后重新添加浸油。
3. 将样品载玻片放置于载物台上，如有需要，静置约 10 分钟，使细胞沉降并贴附于盖玻片上。
4. 启动图像采集程序。使用荧光照明调节焦距，直至观察到清晰的细胞轮廓。（在整个操作过程中应始终注意，尽量减少细胞在实际图像采集前暴露于荧光激发光下的时间。）
5. 可采用螺旋马赛克扫描方式预览样品较大区域，以选择目标细胞或感兴趣区域。建议在扫描样品或寻找目标时使用较短的曝光时间（1–10 毫秒）和较低的激发光强度（0.1–1% 透射率）。
6. 通过 GFP-LC3 荧光识别自噬体；利用 Alexa Fluor 555 标记的抗 LAMP 抗体（溶酶体相关膜蛋白）识别溶酶体，并使用 DAPI 标记细胞核（适用于固定样品）。
7. 选择实验条件，包括激发波长、成像区域（例如 512×512）、Z 轴层厚、曝光时间以及激光透射百分比。若需获取超分辨图像，请确保启用结构光照明显微选项；若在 OMX 系统上进行去卷积显微成像，则选择常规照明模式。
8. 为获得最佳重建效果，应选择实验参数，使采集过程中最大强度计数保持在 10,000 至 15,000 之间。若存在光漂白问题，可采用较低曝光条件（计数在 5,000 至 10,000 之间）。理想情况下，整个采集过程中计数下降不应超过两倍，应避免下降超过四倍的情况。如有必要，可减小 Z 轴层厚以维持稳定的强度计数。相机饱和值为 64,000 计数，因此最大强度绝不可超过此值。对于质量良好的样品，我们发现实验条件通常为 10–50 毫秒曝光时间，激光透射率为 1%。优先选择亮度高且光稳定性好的样品，以便重复成像。对于延时成像和超分辨成像，必须使用稳定的染色样品。
9. 为降低噪声，建议采用 95 MHz 读出速度（中速模式）并设置不少于 2 毫秒的采集时间。若样品在采集过程中发生移动，重建图像中将产生更多伪影。因此，对于非贴壁细胞或运动较快的细胞，建议采用较短的曝光时间。
10. 多通道成像可同时或顺序进行。顺序成像模式可减少串扰，因此推荐使用。
11. 为减少光漂白，通常建议优先使用较长激发波长进行成像（即 532 nm、488 nm，最后为 410 nm）。然而，对于 图 3 所示的实验结果，由于该特定样品具有较高的光稳定性，成像顺序被反转（即 488 nm、532 nm 和 410 nm）。
12. 通过移动显微镜载物台，使细胞顶部和底部刚好略微失焦，以此设定 Z 轴堆栈的上下限。对于超分辨成像，每幅图像之间的理想间距应恒定为 0.125 μm，因为重建软件默认采用该数值。
13. 使用 SoftWorX（Applied Precision, WA）对图像堆栈进行重建，并使用 VoloCITY 6.0（Perkin Elmer, MA）进行分析。

结果

所示图像序列 图1 显示了CWR22细胞在自噬诱导前80分钟内发生的物理变化。在此研究及其他未展示的研究中，我们 consistently 观察到：（1）细胞核从细胞中心位置发生位移；（2）黏着斑数量减少；（3）自噬体和溶酶体整体向细胞中心区域转运。此外，我们还观察到在后期时间点，自噬体（绿色）与溶酶体（红色）之间的共定位（以黄色表示）有轻微增加。

作为基于图像的细胞计数技术的示例，我们使用 VoloCITY 数字成像应用套件（版本 6.0，Improvision/Perkin-Elmer）对 图1 所示 CWR22 细胞图像中标记的自噬体和溶酶体进行识别、计数，并收集统计学数据。如 图2 中的图表所示，自噬体在初始形成并出现后，其数量和大小随时间发生变化：在诱导自噬 80 分钟后，自噬体的数量呈现逐渐但总体下降的趋势（图2A），同时自噬体的平均尺寸相应增加（图2B）。此外，根据 Pearson 相关系数分析，自噬...

讨论

尽管使用针对LC3的荧光探针标记细胞并进行直接观察已被广泛接受为确认自噬反应的标准方法⁶，但对同一系统进行定量三维成像（正如我们所做的）能够提供前所未有的信息和细节，揭示细胞自噬过程的复杂性。特别是我们观察到，在自噬诱导后的80分钟内，活细胞中会形成数百个（甚至可能数千个）自噬体。同样，我们还观察到在自噬诱导过程中溶酶体区室分布发生了非常有趣的形态学变化。在单个细胞内，随着时间推移，自噬体数量减少，同时其平均尺寸相应增大，这表明自噬体通过彼此融合而增大体积，随后再与溶酶体融合形成自溶体。对活细胞进行高分辨率三维荧光成像使我们能够探究：自噬体是否必须达到某一临界尺寸才能与溶酶体融合，或者自噬过程是否也可在较小的物理尺寸下直接进行。事实上，考虑到在自噬早期激活阶段出现的大量极小自噬体，其尺寸仅接近去卷积显微镜的分辨极限，而在OMX结构光照明显微镜¹³上则能更清晰地分辨，很可能大部分自噬活动实际上正是在这一尺度上发生的。

在自噬过程中监测活细胞的能力至关重要，因为在特定细胞中自噬体的数量和大小变化可能较小，而不同细胞间这些参数的差异却相对较大...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精氨酸脱亚氨酶（ADI）	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
酪蛋白	Sigma	C5890
多聚甲醛	Fisher	4042
皂苷	Sigma	S4521
Alexa 抗小鼠 555	Invitrogen	A21422
Alexa 抗兔 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
抗-Lamp1	DSHB	H4A3
抗-Cadherin	Cell Signaling	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 mm 聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm 盖玻片	Corning	#2865-22
显微镜载玻片	Globe Scientific	1324G