采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬

Summary

细胞自噬是一个无处不在的进程，使细胞蛋白质和细胞器的降解和回收利用。我们采用先进的荧光显微镜可视化和量化小，但必要的，与诱导自噬相关的物理变化，包括自噬体和溶酶体的形成和分布，以及他们融合成auto​​lysosomes。

Abstract

手术虽然带有明显的阳痿和尿失禁的风险，前列腺癌是美国男性恶性肿瘤之间的主要形式，传统的化疗方法已基本成功。激素治疗是有效的，在早期阶段，但往往失败，并最终发展为激素难治性肿瘤。我们一直有兴趣在开发针对特定的肿瘤细胞代谢缺陷的疗法。我们最近发现，前列腺肿瘤细胞的特异性缺乏一种酶（精氨琥珀酸合成酶，或ASS）的合成中所涉及的氨基酸精氨酸^1。这种情况会导致肿瘤细胞变得依赖于外生精氨酸，他们经过代谢应激游离精氨酸耗尽时由精氨酸脱亚胺酶^{（ADI）1,10。}事实上，我们已经表明，人类前列腺癌细胞CWR22 RV1有效地杀死ADI依赖caspase的细胞凋亡和积极autophaGY（或^{macroautophagy）1,2,3。}细胞自噬是一种进化上保守的过程，使细胞代谢多余的蛋白质在营养饥饿^4,5溶酶体破裂。虽然这一途径的重要组成部分，良好的特点^6,7,8,9，很多方面的分子机制仍不清楚-特别是，什么是自噬作用的前列腺癌细胞死亡响应ADI治疗后？为了解决这个问题，我们需要的实验方法来衡量的水平和程度在细胞中的自噬反应 - 因为没有已知的分子标记物，可以准确地跟踪这个过程中，我们选择了开发基于成像的方法，使用定量三维荧光显微镜^11,12的 。

使用专门CWR22Rv1细胞自噬体和溶酶体的荧光探针标记，我们证明了收购3D图像栈或者无线defield卷积显微镜（以及后来的超高分辨率，结构照明显微镜），可以清晰地捕捉到自噬诱导的早期阶段。市售数字图像分析的应用程序，我们可以很容易地获得统计信息自噬体和溶酶体的数量，规模，分布和程度从任何成像细胞共存。这个信息让我们能够精确地跟踪在活细胞自噬的进展，使我们继续调查自噬作用在癌症化疗。

Protocol

1。第1部分:细胞培养，免疫荧光标记

1. CWR22 RV1人前列腺肿瘤细胞生长在盖玻片（＃1.5或170微米厚）置于6孔培养板中，含有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI（敏达，VA）。
2. 引起细胞自噬与精氨酸脱亚胺酶（ADI，0.3微克/毫升）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理选定的样品。
3. 固定细胞，用4％多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific公司，NH）在PBS中稀释，将100μl每盖玻片，在RT下10分钟。
4. 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
5. 通透细胞用0.05％皂甙（Sigma公司），HEPES（HBS）/ BSA，加入100μl每盖玻片，在RT下的15分钟。
6. 免疫标记，块样品与2.5％的酪蛋白（Sigma公司），每盖玻片100微升，HBS / BSA 1小时RT之前。
7. 孵育固定细胞主要抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每coversl 100微升IP，O / N在4°C。
8. 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
9. 固定细胞孵育二次抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每100微升盖玻片，在室温下1小时。
10. 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
11. SlowFade金制备的盖玻片，在显微镜玻片安装或延长Gold抗淬灭试剂（Invitrogen，CA），含有4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI）。
12. 指甲油密封盖玻片边缘。为了获得最佳的成像效果，让时间（理想的O / N）为防褪色媒体的彻底渗透细胞。
13. 清洁盖玻片的表面与甲醇和/或氯仿。
14. 浸油（折射率1.520成像时，在37°C或1.516成像时，在RT）60X 1.42 NA物镜（奥林巴斯，日本）。
15. 滑动感兴趣的细胞在显微镜舞台上，并建立重点。

2。第2部分:准备细胞实时成像

1. 长大无缝线路22 RV1细胞表达绿色荧光蛋白偶联型轻链3（LC3-GFP）的RPMI培养基中，在35 mm的聚-D-赖氨酸涂覆的玻璃底培养皿（MatTek，MA）中含有10％FBS和1％抗生素。应接种于细胞足够的密度，方便快速扩散，但没有那么多细胞覆盖，成群成像时。
2. 治疗选择与ADI（0.3微克/毫升）的PBS的细胞样本。
3. 约1小时，在成像之前，稀释红色LysoTracker DND-99（Invitrogen公司，CA），用20毫升的RPMI 1.5微升。含有10％FBS和1％抗生素。使用的解决方案，包含ADI选定样本。预热到37°C前加入培养皿所有媒体。
4. 与红的RPMI含有LysoTracker的DND-99 15-45分钟，在37°C孵育
5. 约30分钟，在成像之前，打开的WeatherStation环境围封，并允许平衡到37℃和5％CO ₂的（humidif与IED的空气）。
6. 用PBS洗涤细胞，并与标准的RPMI只含有10％FBS和1％抗生素更换介质。 ADI表示样品。
7. 安装35毫米盖玻片底培养皿定制适配器（应用精密公司，WA），并在显微镜舞台上的位置。 60X 1.42 NA物镜用浸油（折射率1.520），并在舞台上的位置安装的培养皿。

3。第3部分:反卷积显微镜和分析

该协议在本节中假定DeltaVision的个人DV卷积显微镜和相关的应用程序套件（应用精密公司，WA）SoftWorX使用。

1. 打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开Resolve3D应用初始化显微镜阶段，并开启氙灯光源。允许光源的热身和达到稳定的条件下为10分钟。
2. 添加滴浸油（折射率1.520活样品在37℃或固定的样品在RT 1.516）60X 1.42 NA物镜，在物镜的中心滑动试样（盖玻片正面朝下）。
3. 无论是使用明视场或外部照明和粗调调节旋钮，慢慢地提高胎圈浸油物镜，直到与倒置的玻璃盖接触。 （从这点来说，应该成为焦点的细胞层内几圈微调对焦调节旋钮）。当使用固定的样品在幻灯片上，它被建议，以避免细胞内或附近有气泡的任何领域。当观看直播样品上的玻璃底菜，避免移动物镜玻璃盖玻片的边界之外。
4. 自噬体可以识别eGFP的信号（绿色）。溶酶体确定由LysoTracker红（现场采样）或反灯泡1荧光抗体（固定样本）。细胞的细胞核用DAPI圣发现癌宁（固定样本）。
5. 选择理想的视野。理想的情况下，细胞应具有良好的荧光信号在所有适当的渠道，并充分地附着盖玻片表面上摊开，使细胞内的内容是很容易想象的。侧的x，y和z聚焦在小的调整，可以控制由计算机使用Acquire3D接口。设置分级1X1或2x2的，这取决于所需的视场（更多的细胞中可以看出分级设置为2x2的领域）。
6. 对于一个给定的图像通过一个电池的中部，设置最大像素强度不超过3000个计数的曝光参数（ 例如 ％的发送功率和曝光时间）。一般情况下，％透光率应尽可能低的设置，相应的曝光时间在1秒内没有提高。重复此过程，每个荧光色进行成像，并为每个单独的视野，以获得最高质量的图像。
7. 设置在u稍稍调整焦点分别在顶部和底部的细胞样品，Z堆栈PPER和下限。 Z堆栈中的图像的总数，从而来确定这些限制和层与层之间的间距（默认值:0.2微米）。
8. 为了最大限度地减少运动伪影，图像采集过程中，我们建议设置图像"波长，那么Z-Stack的"用于固定试样，"Z-Stack的波长"现场样品采集模式。
9. 荧光图像反褶积使用SoftWorX（应用精密，WA）以后分析使用VoloCITY（即兴，现在上Perkin Elmer公司，MA）。

4。第4部分:超高分辨率，结构照明显微镜（OMX）

本节中的协议适用于使用结构照明显微镜OMX（应用精密，WA）。

1. 接通主电源和所需的激光器（410纳米，488纳米，和/或532纳米）。等待20英里n为激光热稳定。
2. 浸油（用于固定试样在室温下的折射率1.516）60X 1.42 NA物镜。如果气泡出现在油滴，清洁的目的，并再次添加机油。
3. 如将样品幻灯片的舞台上，并在必要时，允许10分钟的细胞在盖玻片上定居。
4. 初始化收购方案。使用荧光照明，直到锋利的细胞轮廓可以看出，调整的重点。 （在任何时候都应该小心，以尽量减少暴露的细胞荧光激发，直到实际图像采集）。
5. 螺旋拼接扫描可以获取的样品预览较大的地区，选择单元格或地区的利益。建议使用短的曝光时间（1-10毫秒），低激磁功率（0.1-1％传输），同时扫描样品或寻找目标。
6. GFP-LC3荧光识别自噬。识别溶酶体的Alexa Fluor 555抗LAMP（溶酶体相关膜蛋白）和细胞核用DAPI（固定的样品）。
7. 选择的实验条件，包括激发波长，图像区域（ 例如，512×512），堆栈的厚度，曝光时间，激光透射百分率。对于超分辨图像，确保结构照明选项启用。在OMX卷积显微镜，选择传统的照明选项。
8. 为了获得最佳的重建结果中，选择的实验条件下，例如，在采集过程中在10,000和15,000之间的最大强度计数。漂白如果是一个问题，也可以使用在一个较低的曝光（5000和10000之间的数）的成像。理想情况下，不应该减少计数超过整个采集过程中的两个因素，应避免超过四个因素的减少。如果有必要，减少组的厚度，以确保持续的强度计数。相机饱和，所以在64,000计数最大张力不应该超过此值。为了获得良好的样本，我们发现1％的激光传输的实验条件下，10〜50毫秒的曝光时间。可以反复成像明亮的和耐光样品的首选。需要一个稳定的污渍时间推移，超分辨图像。
9. 为了减少噪音，95MHz读出速度（中等速度选项）和采集时间为2毫秒或以上推荐。增加文物得到重建成像，当样品在收购移动。由于这个影响，短期风险，建议非贴壁或快速移动的细胞。
10. 多通道成像可以同时或依次进行。顺序模式产量减少串扰和建议。
11. 为了减少光漂白，一般建议图像较长的激发波长（532纳米，488纳米和410纳米）。然而，对于在图3所示的实验结果，该顺序是反向。（ 即 48纳米，532纳米和410纳米）由于这个特定样品的光稳定性。
12. 设置上限/下限的Z堆栈的顶部/底部的细胞移动显微镜阶段，直到稍微失焦。在0.125微米的超分辨率成像所需的每幅图像之间的距离应保持不变，重建软件借此为默认值。
13. 图像重建栈使用SoftWorX（应用精密，WA）和分析使用的6.0 VoloCITY（Perkin Elmer公司，MA）。

Results

图1中所示的图象序列显示在第一个80分钟的自噬诱导的在CWR22细胞发生的物理变化。在这方面和其他的研究（图中未示出）中，我们持续观察到:（1）核内的位移相差的小区中心;（2）减少了粘着点，以及（3）朝向中心的自噬体和溶酶体一般易位细胞。此外，我们还观察到自噬体和溶酶体（绿色）（红色）之间的共存小幅增加（黄色），在稍后的时间点。

基于图像流式细胞仪作为示范，我们使用VoloCITY的数字成像应用程序套件（版本6.0，即兴/ Perkin-Elmer公司），以识别，计数，收集统计数据标记的自噬体和溶酶体在CWR22细胞的图像图1。在图2中的图表所示，吨的数量和大小的他自噬体（后，他们最初的形成和外观）不随时间变化的:自噬感应80分钟后，有一个渐进的，但在自噬体的净减少（ 图2A）的自噬体的平均规模，并相应增加（ 图2B）。此外，有一个可测量的增加，自噬体和溶酶体中的共定位，皮尔逊相关系数分析（ 图2...

Discussion

虽然被广泛接受为一个标准的方法来确认自噬反应⁶相同的系统（因为我们已经做了），定量三维成像提供了前所未有的信息和细节的复杂过程，细胞自噬对LC3荧光探针标记细胞直接观察。特别是，我们观察到自噬诱导后80分钟内，数百（如果不是数千）在活细胞中的自噬体形成。同样，我们观察到在自噬诱导溶酶体舱室的分布非常有趣的形态学变化。在一个给定的单元格，在自噬体的数量减少，并随着时间的推移他们的平均大小相应增加，表明自噬体的增长大融合与对方相结合的与溶酶体形成auto​​lysosomes的之前。高分辨率三维荧光活细胞成像，让我们去调查，自噬是否必须达到一个临界尺寸江前ê与溶酶体融合，还是自噬可进行简单的在一个较小的物理尺寸。事实上，由于一些非常小的自噬体出现早期活化后，只是在反褶积显微镜的分辨率极限，更清楚在OMX结构照明显微镜^13的解决，它可能的情况下，实际上大量的自噬活性发生在这个水平。

能够监测活细胞的自噬过程中是极其重要的，作为自噬体在给定的小区的数量和大小的变化，可以是小的，这些参数的变化相对于从细胞到细胞。通过研究一个单一的，随着时间的推移活...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
精氨酸脱亚胺酶 （ADI）	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
酪蛋白	Sigma	C5890
多聚甲醛	Fisher	4042
皂苷	Sigma	S4521
Alexa 抗小鼠 555	Invitrogen	A21422
Alexa 抗兔 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
anti-Lamp1	DSHB	H4A3
anti-Cadherin	Cell Signaling	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 mm poly-d-赖氨酸涂层玻璃底板	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
No.1， 22 mm 盖玻片	Corning	#2865-22
显微镜载玻片	Globe Scientific	1324G