唾液腺类器官培养的遗传修饰与重组

摘要

本文介绍了一种利用病毒基因转移技术，在整体ex vivo培养的胚胎小鼠下颌下腺（SMG）中对上皮细胞进行遗传操作的方法。该方法利用了SMG上皮和间充质在分离后能够自发重组的内在特性，以及腺病毒载体感染上皮原基的能力。

摘要

分支形态发生发生在多种器官的发育过程中，胚胎小鼠下颌下腺（SMG）是研究分支形态发生的经典模型。在SMG的发育过程中，这一过程涉及上皮芽和导管形成的反复迭代步骤，最终形成由腺泡和导管组成的复杂分支网络，分别负责唾液的产生以及修饰与运输至口腔^1-3。上皮相关的基底膜以及间充质区的某些组分（包括间充质细胞、生长因子以及这些细胞分泌的细胞外基质）对分支机制至关重要，但细胞和分子事件如何协调仍知之甚少⁴。研究驱动上皮形态发生的分子机制有助于加深我们对发育机制的理解，并为再生医学策略提供线索。由于缺乏有效的唾液腺上皮遗传操作方法，此类研究受到限制。目前，腺病毒感染是在体内靶向成年腺体上皮细胞最有效的方法in vivo⁵。然而，在胚胎外植体中，致密的间充质以及包围上皮细胞的基底膜阻碍了病毒进入上皮细胞。若去除间充质，则可利用腺病毒转染上皮，且上皮原基可在Matrigel或层粘连蛋白-111存在下恢复分支形态发生^6,7。无间充质的上皮原基生长还需额外补充可溶性生长因子，且不能完全重现完整腺体中的分支形态发生过程⁸。本文介绍一种技术，可促进腺病毒对上皮细胞的转导，并实现转染后上皮与相关间充质共同培养。通过对胚胎SMG进行显微解剖，去除间充质后，用携带GFP的腺病毒感染上皮，我们发现上皮可自发地与未感染的间充质重新组合，重现完整SMG腺体结构及分支形态发生过程。若使用荧光标记的腺病毒载体，可通过标准荧光显微镜方法轻松监测基因修饰的上皮细胞群体。本文所述的组织重组方法目前是转染复杂三维组织结构中上皮细胞最为有效且易于实现的技术，无需构建转基因动物即可使用野生型或突变型载体进行操作。

方案

该方案包含四个主要步骤，如图1所示。所有步骤均进行了详细描述。腺病毒构建及病毒纯化应在器官 harvesting 之前完成，以便用于分离的上皮原基的基因转导。操作腺病毒时应遵循所有标准的BSL-2安全防护措施。

1. 小鼠胚胎下颌下腺（SMG）的获取与显微解剖

1. 使用 CO₂ 处死已定时妊娠的雌性小鼠（远交系 CD-1 或 ICR）₂ 麻醉后通过颈椎脱位处死小鼠，并在胚胎第13天（E13，3-5个上皮芽期）按照机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的程序采集胚胎下颌下腺。发现阴道栓的当天记为E0。也可在E12阶段采集并培养唾液腺，此时腺体仅有一个初级芽状结构及芽柄，裂隙刚刚开始形成。早于该阶段的下颌下腺（SMGs）需要采用与本文所述不同的培养条件。
2. 将胚胎串转移至无菌的10 cm组织培养皿中，培养皿内含25 ml不含酚红的DMEM/Ham's F12培养基（F12，Life Technologies），并添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（青霉素-链霉素，pen-strep，Life Technologies）。
3. 使用无菌手术刀（#11 刀片）和镊子（#5，Fine Science Tools，11252-20），将胚胎从胚囊中取出，放入另一含有 25 ml DMEM/F12 + 青霉素-链霉素的 10 cm 培养皿中。

结果

主要实验步骤的流程概述如下 图1. 完整的下颌下腺、分离的上皮始基及其相应的间充质示例示于 图2重组后的小唾液腺在培养过程中持续进行分支形态发生时的明场图像 离体 在指定时间点的结果如图所示 图3. 表达上皮细胞GFP的重组腺体培养48小时后的图像如图所示 图4. 共聚焦显微镜图像显示了重组下颌下腺在培养72小时后经固定、免疫细胞化学染色并成像的结果 图5上皮标志物 E-cadherin 可将表达 GFP 的上皮细胞群体与周围的间充质区分开来。基底膜蛋白 perlecan 在上皮外围的定位表明，在重组腺体中基底膜至少实现了部分重建。 图6副交感神经下颌下神经节在重组培养中表现出神经突生长并支配腺体，此现象先前已有报道。¹⁹

讨论

该 离体 上皮-间充质重组技术于1981年首次发表于下颌下唾液腺研究¹⁶在此方案中，我们对原始方法进行了拓展，利用腺病毒感染在重组腺体的背景下调控上皮细胞的基因表达。我们发现，部分上皮细胞可被腺病毒感染，而感染细胞的比例取决于病毒启动子的特性、病毒滴度以及病毒纯度。我们发现，为实现高效的上皮细胞转导，必须使用经氯化铯（CsCl）梯度离心纯化的病毒，但该纯化步骤未在本文中描述。由于我们此前还成功在组织重组前感染了间充质细胞（数据未展示），因此对间充质细胞群体进行独立的遗传操作也是可行的。我们近期利用该腺病毒转染/组织重组方法，鉴定出极性蛋白PAR-1b在发育中唾液腺上皮调控基底膜定位过程中的作用。本研究中同时使用了激酶失活型PAR-1b腺病毒和野生型PAR-1b腺病毒。¹³ 用于感染上皮始基并与E13间充质重组。利用突变病毒来探究特定分子功能的能力显著提高了该方法的实用性。

目前尚缺乏有效的工具，能够在不影响间充质成分的情况下，靶向完整胚胎唾液腺上皮细胞群体中的特定分子。尽管已有多个研究使用药理学抑制剂来调控完整器官培养.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含酚红的DMEM/Ham's F12培养基	Life Technologies	21041-025
青霉素和链霉素	Life Technologies	15070-163	10X 储存液
Dispase	Life Technologies	17105-041	分装为单次使用量，-20°C 冻存
BSA	Sigma	A2934-100G	第五组分，低内毒素
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	应为高滴度（1×1010 pfu/ml）。CsCl纯化的病毒在此实验中比柱纯化的病毒更有效。
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	用含5%蔗糖（w/v）的PBS稀释至2%
1X 磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	70011-044	由10X 储存液配制
Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14175095	不含钙、不含镁、不含酚红
转铁蛋白	Sigma	T8158	在DMEM/F12培养基中配制成25 mg/ml的储存液。分装为单次使用量，-20°C 冻存
L-抗坏血酸（维生素C）	Sigma	A4403	在DMEM/F12培养基中配制成75 mg/ml的储存液。分装为单次使用量，-20°C 冻存
表1. SMG重组实验所需试剂清单。
10 cm无菌塑料培养皿	Corning	430167	也可使用未经组织培养处理的培养皿。
带透射光源底座的体视解剖显微镜	Nikon	SMZ645	任何带有透射光源底座的体视解剖显微镜均可使用。
35 mm组织培养皿	Falcon	353001	也可使用未经组织培养处理的培养皿。
直径50 mm的微孔培养皿	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore 轨迹蚀刻膜滤器	Whatman	110405	直径13 mm，孔径0.1 mm
宽场荧光显微镜	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	任何荧光显微镜（直立式、倒置式或体视解剖显微镜）均可用于在低倍镜下通过连接的数码相机监测GFP表达。
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	TCS SP5	共聚焦显微镜对于观察细胞精细结构是必需的。任何共聚焦显微镜均可使用。
妊娠定时的雌性小鼠，CD-1或ICR品系	Charles River Labs		在第13天取材（以发现阴道栓当天为第0天）。
手术刀片 #11	Fine Science Tools	10011-00
手术刀柄 #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 镊子，不锈钢合金，0.05 mm × 0.02 mm	Fine Science Tools	11252-20	适用于从胚胎中采集腺体
Dumont #5 镊子，dumostar合金，0.05 mm × 0.01 mm	Fine Science Tools	11295-20	去除上皮中的间充质需要使用尖端更细的镊子。也可使用钨针。
表2. SMG重组实验所用设备清单。