用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

摘要

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。

摘要

尽管临床研究已证实，抗原负载的树突状细胞疫苗对肿瘤具有安全性和良好的治疗前景 ¹，其临床疗效仍有待确立。下述方法依据药品生产质量管理规范（GMP）指南制备，是对最常用方法的优化 离体 用于临床研究的大规模树突状细胞制备方法 ².

本方法利用合成的 TLR3 激动剂聚胞苷酸-聚尿苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素（Poly-ICLC）来刺激树突状细胞（DCs）。我们之前的研究证实，Poly-ICLC 是诱导人树突状细胞成熟的最强单一代谢刺激物，其评估指标包括 CD83 和 CD86 的上调、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNF）、γ-干扰素诱导蛋白 10（IP-10）、白细胞介素-1（IL-1）和 I 型干扰素（IFN）的产生，以及极低水平的白细胞介素-10（IL-10）分泌。

树突状细胞（DC）由经白细胞分离术获得的冻存外周血单个核细胞（PBMC）分化而来。PBMC通过Ficoll密度梯度离心法分离，并分装后冻存。第1天，将PBMC解冻并接种于组织培养瓶中，在37 °C组织培养孵箱中孵育1–2小时，使单核细胞贴附于塑料表面，从而进行筛选。孵育后，洗去未贴壁的淋巴细胞，将贴壁的单核细胞在白细胞介素-4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养5天，以诱导其分化为未成熟DC。第6天，用钥孔血蓝蛋白（KLH）对未成熟DC进行刺激，该蛋白作为疫苗质量的对照，可能增强疫苗的免疫原性³。随后，DC被诱导成熟，负载肽类抗原，并过夜孵育。第7天，细胞经洗涤后，以每管1 ml分装，每管含4–20×10⁶个细胞，使用程序控速冷冻仪进行冻存。对每批DC进行放行检测，必须符合最低质量标准后方可用于患者注射。

方案

1. 外周血单个核细胞的分离与冷冻保存⁴

1. 使用血浆转移装置无菌穿刺白细胞分离袋的一个接入口。用60 ml注射器将从患者获得的白细胞分离产物转移至无菌的500 ml瓶中。
2. 用室温RPMI将白细胞分离产物的体积调整至其原始体积的2倍。充分混匀。
3. 轻轻混匀Ficoll-Paque PLUS瓶中的液体。向无菌50 ml离心管中加入12 ml Ficoll-Paque PLUS。
4. 将30 ml稀释后的白细胞分离产物轻轻叠加至每个含有Ficoll的无菌50 ml离心管中。注意不要扰动Ficoll与细胞悬液之间的界面。
5. 重复步骤1.3和1.4，直至所有白细胞分离产物均完成叠加。
6. 将50 ml离心管在室温下以1,000 × g离心20分钟，不使用刹车。
7. 小心收集每管中的浑浊PBMC层，并转移至新的无菌50 ml离心管中。
8. 向每管中加入RPMI，使最终体积达到50 ml。通过轻柔倒置混匀。
9. 在4 °C下以500 × g离心10分钟，使用全刹车。
10. 移除每管中的上清液。将每管中的细胞沉淀重悬，并加入RPMI使最终体积为50 ml。通过轻柔倒置混匀。
11. 在4 °C下以500 × g离心6分钟。
12. 移除每管中的上清液。将细胞悬液重悬后合并至一个50 ml离心管中。
13. 用更多RPMI....

结果

在培养结束时，初始PBMC中有10-20%会分化为DC。成熟的DC表达CD11c+、CD14-、CD83+、CD40+和CCR7+（图1）。它们高表达MHC I类和II类分子以及共刺激分子CD80和CD86。与其他TLR激动剂相比，Poly-ICLC诱导的PDL-1表达水平较低¹⁴。此外，经Poly-IC成熟的DC可分泌大量IL-12（图2和^15,16），并能够诱导同种异体T细胞增殖（图3）。

讨论

单核细胞来源的树突状细胞（DC）的I期和II期临床试验表明，这些细胞可在患者中诱导免疫反应，但临床疗效仍然有限¹。这可能部分归因于目前尚无共识来确定如何制备用于肿瘤免疫治疗的最佳树突状细胞。尽管存在多种制备临床级树突状细胞的方法，但这些方法在用于单核细胞分化的细胞因子、诱导成熟的刺激物以及抗原负载方法等方面各不相同。制备最佳树突状细胞的方案仍有待明确²。

近期 体外 研究表明，使用促炎细胞因子混合物成熟的树突状细胞 ¹⁰ 其中多数临床试验所采用的方法，特别是PGE2的存在，可诱导调节性T细胞和Th2反应的分化 ¹⁷表达 IDO ¹⁸，且在IL-12p70的产生方面存在缺陷 ¹⁹这些效应会显著削弱疫苗诱导免疫应答的能力，因此有必要评估其他树突状细胞成熟方法，以优化其作用效果 体内.

使用 Toll 样受体（TLR）激动剂，特别是 TLR3 激动剂 Poly-IC，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	BioWhittaker	12-702F
1M HEPES缓冲盐溶液	BioWhittaker	17-737E
磷酸盐缓冲液（PBS）	BioWhittaker	17-516F
人血清白蛋白，25%溶液（USP）	Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-03
人AB血清	Valley Biomedical	HP1022
无菌生理盐水（USP）	Hospira
CryoMACS DMSO	Miltenyi Biotec	170-076-303
Leukine GM-CSF，0.5 mg/ml	Berlex	A02266
MACS GMP IL-4	Miltenyi Biotec	170-076-101
Hiltonol（Poly-ICLC），2 mg/ml	Oncovir	NA
VACMUNE KLH	Biosyn
225 cm² EasyFlasks培养瓶	Nalgene Nunc	159934
Falcon 6孔组织培养板	Becton Dickinson	353046
1.8 ml CryoTube冻存管	Nalgene Nunc	377267
程序降温冷冻仪	Thermo	CryoMed