本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。
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摘要
摘要
尽管临床研究已证实，抗原负载的树突状细胞疫苗对肿瘤具有安全性和良好的治疗前景 1，其临床疗效仍有待确立。下述方法依据药品生产质量管理规范（GMP）指南制备，是对最常用方法的优化 离体 用于临床研究的大规模树突状细胞制备方法 2.
本方法利用合成的 TLR3 激动剂聚胞苷酸-聚尿苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素（Poly-ICLC）来刺激树突状细胞（DCs）。我们之前的研究证实，Poly-ICLC 是诱导人树突状细胞成熟的最强单一代谢刺激物，其评估指标包括 CD83 和 CD86 的上调、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNF）、γ-干扰素诱导蛋白 10（IP-10）、白细胞介素-1（IL-1）和 I 型干扰素（IFN）的产生，以及极低水平的白细胞介素-10（IL-10）分泌。
树突状细胞（DC）由经白细胞分离术获得的冻存外周血单个核细胞（PBMC）分化而来。PBMC通过Ficoll密度梯度离心法分离，并分装后冻存。第1天，将PBMC解冻并接种于组织培养瓶中，在37 °C组织培养孵箱中孵育1–2小时，使单核细胞贴附于塑料表面，从而进行筛选。孵育后，洗去未贴壁的淋巴细胞，将贴壁的单核细胞在白细胞介素-4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养5天，以诱导其分化为未成熟DC。第6天，用钥孔血蓝蛋白（KLH）对未成熟DC进行刺激，该蛋白作为疫苗质量的对照，可能增强疫苗的免疫原性3。随后，DC被诱导成熟，负载肽类抗原，并过夜孵育。第7天，细胞经洗涤后，以每管1 ml分装，每管含4–20×106个细胞，使用程序控速冷冻仪进行冻存。对每批DC进行放行检测，必须符合最低质量标准后方可用于患者注射。
方案
1. 外周血单个核细胞的分离与冷冻保存4
- 使用血浆转移装置无菌穿刺白细胞分离袋的一个接入口。用60 ml注射器将从患者获得的白细胞分离产物转移至无菌的500 ml瓶中。
- 用室温RPMI将白细胞分离产物的体积调整至其原始体积的2倍。充分混匀。
- 轻轻混匀Ficoll-Paque PLUS瓶中的液体。向无菌50 ml离心管中加入12 ml Ficoll-Paque PLUS。
- 将30 ml稀释后的白细胞分离产物轻轻叠加至每个含有Ficoll的无菌50 ml离心管中。注意不要扰动Ficoll与细胞悬液之间的界面。
- 重复步骤1.3和1.4，直至所有白细胞分离产物均完成叠加。
- 将50 ml离心管在室温下以1,000 × g离心20分钟，不使用刹车。
- 小心收集每管中的浑浊PBMC层，并转移至新的无菌50 ml离心管中。
- 向每管中加入RPMI，使最终体积达到50 ml。通过轻柔倒置混匀。
- 在4 °C下以500 × g离心10分钟，使用全刹车。
- 移除每管中的上清液。将每管中的细胞沉淀重悬，并加入RPMI使最终体积为50 ml。通过轻柔倒置混匀。
- 在4 °C下以500 × g离心6分钟。
- 移除每管中的上清液。将细胞悬液重悬后合并至一个50 ml离心管中。
- 用更多RPMI将合并后的PBMC体积补至50 ml。通过轻柔倒置混匀。
- 在4 °C下以300 × g离心6分钟。
- 移除上清液。将细胞沉淀重悬于50 ml RPMI中。轻柔混匀以确保细胞悬液均匀。
- 计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。
- 在4 °C下以300 × g离心6分钟。准备冻存液。冻存液由10%二甲基亚砜（DMSO；Miltenyi Biotec）和人AB血清（Valley Biomedical）组成。
- 移除上清液。将细胞重悬于预冷的冻存液中，终浓度为2 × 108 个细胞/ml。
- 将1 ml分装至1.8 ml冻存管中。
- 将冻存管转移至程序降温仪中，启动冻存程序1。程序结束后，立即将冻存管转移至液氮罐的气相中保存。
2. 第0天：从单核细胞分化树突状细胞
- 向无菌的 50 ml 锥形管中加入 30 ml RPMI/1% 自体血浆。
- 在 37 °C 水浴中轻轻振荡，解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）分装样品。完全解冻后，将冻存管中的内容物转移至无菌的 50 ml 锥形管中，充分混匀。
- 在室温下以 500 × g 离心 6 分钟。弃去上清液，将沉淀细胞重悬于少量 RPMI/1% 自体血浆中，随后补加 RPMI/1% 自体血浆至终体积为 50 ml，充分混匀。
- 再次在室温下以 500 × g 离心 6 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 50 ml RPMI/1% 自体血浆中，充分混匀。
- 计数细胞数量并测定细胞活力，计算活细胞总数。
- 将 1.40 × 108 个细胞接种于 40 ml RPMI/1% 自体血浆中，加入 225 cm2 EasyFlask 培养瓶。重复此步骤，直至所有细胞接种完毕。
- 将 EasyFlask 平放于组织培养孵箱中，在 37 °C、含 5% CO2 的条件下孵育 1–2 小时，使单核细胞贴壁。
- 孵育结束后，从孵箱中取出 EasyFlask，用 30 ml 预热的 RPMI 洗涤两次，以去除未贴壁细胞。
- 第二次洗涤后，加入 40 ml 含 400–1,000 IU/ml IL-4 和 100–1,000 IU/ml GM-CSF 5-8 的 RPMI/1% 自体血浆。本实验方案中使用 400 IU/ml IL-4 和 100 IU/ml GM-CSF。
- 将 EasyFlask 置于含 5% CO2 的组织培养孵箱中，在 37 °C 下继续孵育 2 天。
3. 第2天：用IL-4和GM-CSF培养树突状细胞
- 向每个 EasyFlask 中加入 4 ml RPMI/1% 自体血浆，并加入 400–1,000 IU/ml IL-4 和 100–1,000 IU/ml GM-CSF。通过轻轻旋转并侧向摇动混匀。
- 将 EasyFlask 置于含 5% CO2 的组织培养孵箱中，在 37 °C 下继续孵育 3 天（至第 5 天）。
4. 第5天：未成熟树突状细胞的收获
- 通过剧烈涡旋培养瓶并反复吹打，收集悬浮的非贴壁和松散贴壁细胞。将收集的细胞转移至新的50 ml锥形管中。
- 在室温下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50 ml RPMI/1%自体血浆中，充分混匀。
- 计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。
- 在室温下以500 × g离心6分钟。在6孔组织培养板中，每孔加入1-2 × 106个细胞，溶于3 ml RPMI/1%自体血浆，并添加400 IU/ml IL-4和100 IU/ml GM-CSF。
- 将培养板置于含5% CO2的组织培养孵箱中，37 °C过夜培养。
5. 第6天：树突状细胞的成熟与抗原加载
- 在6孔培养板的1/3孔中加入10 μg/ml KLH，轻轻摇晃培养板以混匀。KLH仅添加至1/3的孔中，因为KLH仅用于第一次树突状细胞疫苗，后续的树突状细胞疫苗仅包含肿瘤抗原肽。
- 树突状细胞可使用不同的刺激物诱导其成熟。临床研究中最常用的成熟刺激物是细胞因子混合物（IL-1β、TNFα 和 IL-6）以及前列腺素 E2（PGE₂）2) 9,10近年来，Toll样受体（TLR）激动剂的使用日益受到关注 11,12在此方案中，加入 2 mg/ml 聚肌苷酸-聚胞苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素 (将Poly-ICLC加入孔中并充分混匀。Poly-ICLC是Poly-IC的临床级制剂，由聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定（由Oncovir, Inc.生产）。
- 向指定孔中加入100 μg/ml的长肽抗原（NY-ESO-1 和/或 Melan-A/MART-1），每孔仅加入单一肽段，以避免交叉竞争 13.
- 在含有5% CO₂的组织培养孵箱中，于37 °C孵育培养板2 过夜
6. 第7天：树突状细胞的冷冻保存
- 使用自体血浆和10% DMSO制备DC冻存液。将DC冻存液在4 °C条件下以2,000 × g离心20分钟，以去除任何颗粒物质。将上清液转移至新的标记好的15 ml锥形管中。4 °C保存备用。
- 当过夜孵育结束后，收集并合并所有含有经肽段刺激的DC的孔至50 ml锥形管中。
- 以500 × g在室温下离心6分钟。弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 ml RPMI/1%自体血浆中，并用RPMI/1%自体血浆补足总体积至50 ml。充分混匀。
- 计数细胞数量并测定细胞活力。计算活细胞总数。
- 在室温下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，并将每个沉淀重悬于5 ml无菌0.9% NaCl（USP）中，转移至新的15 ml锥形管中。再用无菌0.9% NaCl（USP）补足每管细胞悬液至14 ml。盖紧管盖，通过倒置混匀。
- 重复上一步骤两次。最后一次离心后，尽可能接近细胞沉淀去除上清液，但不得扰动沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于DC冻存液中，细胞密度为4 - 20 × 106 个细胞/ml，并将1 ml分装至每个1.8 ml CryoTube冻存管中。
- 使用程序控速冷冻仪（程序1）对DC疫苗分装样品进行冷冻，随后立即转移至液氮罐的气相中进行长期保存。
7. 批次放行检测
- 每批树突状细胞（DC）疫苗在释放用于患者注射前必须进行评估，并符合特定的放行标准（表1），通常在疫苗制备后5至6周进行。
- 活力：使用自动细胞计数仪评估DC疫苗的细胞活力。可接受的最低活力标准为>70%。
- 鉴定：通过流式细胞术评估成熟DC（CD11c+CD14-CD83+）的表型。CD11c+细胞的比例应>50%；CD11c+和CD14+双阳性细胞的比例应<30%；CD11c+、CD14-且CD83+三标阳性细胞的比例应>50%。
- 无菌性：通过直接培养和革兰染色法检测DC疫苗中是否存在厌氧菌、需氧菌及真菌。采用直接培养系统结合DNA荧光染色法（指示细胞系法）检测支原体。上述各项检测的最低标准为所有培养物中均无微生物生长。
- 内毒素：采用动力学-QCL显色鲎试剂（LAL）法检测内毒素含量，其浓度必须<50 EU/mL，方可满足最低放行标准。
- 功能：通过与同种异体T细胞共培养进行混合淋巴细胞反应，评估DC的功能。与未刺激的DC相比，应观察到明显的T细胞增殖反应（图3）。
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结果
在培养结束时，初始PBMC中有10-20%会分化为DC。成熟的DC表达CD11c+、CD14-、CD83+、CD40+和CCR7+（图1）。它们高表达MHC I类和II类分子以及共刺激分子CD80和CD86。与其他TLR激动剂相比，Poly-ICLC诱导的PDL-1表达水平较低14。此外，经Poly-IC成熟的DC可分泌大量IL-12（图2和15,16），并能够诱导同种异体T细胞增殖（图3）。
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讨论
单核细胞来源的树突状细胞（DC）的I期和II期临床试验表明，这些细胞可在患者中诱导免疫反应，但临床疗效仍然有限1。这可能部分归因于目前尚无共识来确定如何制备用于肿瘤免疫治疗的最佳树突状细胞。尽管存在多种制备临床级树突状细胞的方法，但这些方法在用于单核细胞分化的细胞因子、诱导成熟的刺激物以及抗原负载方法等方面各不相同。制备最佳树突状细胞的方案仍有待明确2。
近期 体外 研究表明，使用促炎细胞因子混合物成熟的树突状细胞 10 其中多数临床试验所采用的方法，特别是PGE2的存在，可诱导调节性T细胞和Th2反应的分化 17表达 IDO 18，且在IL-12p70的产生方面存在缺陷 19这些效应会显著削弱疫苗诱导免疫应答的能力，因此有必要评估其他树突状细胞成熟方法，以优化其作用效果 体内.
使用 Toll 样受体（TLR）激动剂，特别是 TLR3 激动剂 Poly-IC，...
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披露
作者获得了以下机构的资助：美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：AI061684、AI071078、AI044628 和 K08 AI084578（Miller））、比尔及梅琳达·盖茨基金会、多丽丝·杜克慈善基金会、癌症研究所、狼疮研究联盟以及翡翠基金会。Nina Bhardwaj 是关于树突状细胞制备及其用于调控免疫相关专利的共同发明人。除上述披露外，作者无其他与本稿件所述主题或材料存在经济利益或经济冲突的组织或实体的相关从属关系或财务参与。
致谢
作者谨此感谢 Andres Salazar（Oncovir, Inc.）惠赠 Poly-ICLC。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES缓冲盐溶液 | BioWhittaker | 17-737E | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | BioWhittaker | 17-516F | |
| 人血清白蛋白，25%溶液（USP） | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| 人AB血清 | Valley Biomedical | HP1022 | |
| 无菌生理盐水（USP） | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF，0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol（Poly-ICLC），2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 cm² EasyFlasks培养瓶 | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6孔组织培养板 | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube冻存管 | Nalgene Nunc | 377267 | |
| 程序降温冷冻仪 | Thermo | CryoMed |
参考文献
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