本文描述了一种未分化甲状腺癌异种移植小鼠模型的建立方法。该技术通过将人源未分化甲状腺癌细胞手术植入免疫缺陷小鼠的甲状腺内，从而构建出更贴近临床实际的疾病模型，可用于研究疾病进展以及筛选创新的治疗干预手段。
本文内容
摘要
摘要
已建立多种人类甲状腺癌的动物模型，包括将癌细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的皮下异种移植模型和原位植入模型。皮下异种移植模型在新疗法的临床前筛选与评估中具有重要价值。使用皮下模型具有若干优势：1）成瘤迅速；2）可重复性强；3）可通过肉眼观察监测肿瘤的形成、生长及其对治疗药物的反应。然而，大量证据已揭示皮下异种移植模型存在局限性1-3。例如，在皮下异种移植模型中表现出治愈效果的药物治疗，往往对人类疾病并无显著作用。这种差异的核心在于异种移植或注射部位的微环境。
原位肿瘤异种移植模型为疾病研究提供了更具生物学相关性的环境。将病变细胞或组织植入宿主动物相应的解剖学起源部位，其优势包括为肿瘤与宿主之间的相互作用提供适宜的微环境、促进与疾病相关的转移灶形成，以及能够评估特定部位对实验性治疗手段的影响。因此，原位异种移植模型具有更高的临床价值，因其能够更真实地模拟人类疾病。基于上述原因，已有多个研究团队将原位甲状腺癌模型作为重要的研究工具加以应用4-7。
本文介绍一种建立甲状腺未分化癌（ATC）原位模型的方法。ATC具有高度侵袭性，对治疗具有抵抗性，几乎所有确诊患者均面临致命结局。将培养的ATC细胞制备成含有基底膜基质溶液的单细胞悬液，缓慢注射至小鼠右侧甲状腺腺体中。通过监测小鼠整体外观和健康状况，以确保术后并发症最小化，并评估癌症的病理渗透程度。在接种后4周处死小鼠，收集组织进行组织学分析；也可在更晚的时间点处死动物，以观察疾病更晚期的进展过程。该原位小鼠模型的建立提供了实现两个目标的研究平台：1）加深对ATC病理机制的理解；2）筛选现有及未来治疗药物在对抗ATC中的有效性。
方案
1. 细胞准备
注意事项：1）完全RPMI 1640培养基配方（500 ml）包含435 ml RPMI 1640、50 ml热灭活FBS、5 ml非必需氨基酸、5 ml丙酮酸钠、5 ml抗生素-抗真菌剂；2）在细胞收获前一天将Matrigel置于4 °C环境中。
- 人甲状腺未分化癌细胞系 THJ-11T8 在6孔培养板中培养，待细胞融合度达到80–90%时收获。
- 在室温下以200 × g离心4分钟，沉淀细胞。
- 吸除培养基，将细胞重悬于RPMI 1640培养基中［每6孔板加入2 ml］。
- 取少量细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝染液混合，使用TC10全自动细胞计数仪测定细胞密度。
- 根据每只小鼠注射5 × 105个细胞的需求，计算所需细胞悬液的体积，并乘以注射小鼠的数量。
注意： 为确保注射时细胞悬液充分混匀，需按注射小鼠数量加倍的标准制备细胞例如 若注射5只小鼠，则按注射10只小鼠的量准备细胞悬液。
- 将所需体积的细胞悬液转移至15 ml锥形管中。
- 在室温下以200 × g离心4分钟，使细胞沉淀。
- 吸除上清液，并将细胞重悬于完全RPMI 1640培养基中。
- 将细胞转移至1.6 ml离心管中，加入等体积Matrigel，通过缓慢吹打轻轻混匀。
注意：每只小鼠将接受 10 μl 的细胞悬液与 Matrigel 混合物。由于在先前的甲状腺未分化癌（ATC）原位研究中，已成功使用 5 × 105 个细胞悬浮于 10 μl 可注射体积中的参数9-10，因此本报告中采用了相同的参数。
- 将细胞悬液置于冰上，待用。
2. 小鼠准备
- 使用70%乙醇擦拭所有表面，清洁手术区域，包括解剖显微镜及其周围区域。
- 打开动物术后恢复区域的加热灯或加热垫。
- 按每10 g体重注射0.1 ml的剂量，通过1 ml、27G ½"结核菌素注射器，腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合药液（药物混合液含氯胺酮9 mg/ml和赛拉嗪1 mg/ml）。
- 手术前准备小鼠：1）剃除小鼠颈部区域毛发（从下颌线至胸骨上部并向四肢延伸），2）用浸有氯己定的纱布块对手术区域进行三次擦拭，3）最后用浸有聚维酮碘的纱布进行擦拭，4）轻柔涂抹眼膏以防止眼睛干涩。
- 检查小鼠的足底反射，以确认其已充分镇静。
- 将动物仰卧置于解剖显微镜下的无菌一次性手术铺巾上，并用布胶带固定动物位置。
- 清洗双手及指甲，然后戴上无菌外科手套。
- 以无菌操作方式打开手术包，并摆放好手术器械。
- 将无菌手术巾覆盖在动物身上，仅暴露手术部位。
3. 甲状腺手术入路与细胞注射
- 使用无菌的一次性手术刀，在喉部中线沿纵轴做1至1.5厘米的切口。
注意：偏离正中线会使深入切割以暴露气管变得更加困难。较为精确的正中切口有助于分离并剪开连接左右两侧唾液腺的膜状组织，同时降低划伤或切断大动脉的风险。
- 在气管周围的带状肌上做第二个切口，然后将切开的肌肉右侧向一侧拉开，以暴露右侧甲状腺。
- 此时可使用止血钳将肌层撑开，以便于进入甲状腺（图1）。
注意：或者，如果由两名外科人员进行操作，助手可用镊子夹住肌肉层，同时将已准备好的注射器递给主刀医师。
- 使用31G 5/16"胰岛素注射器，将10 μl细胞悬液缓慢注入右侧甲状腺，然后轻柔拔出针头。
4. 手术部位闭合及小鼠恢复
- 使用6.0缝合材料，以连续或间断缝合方式缝合肌肉层。
- 以相同方式缝合皮肤。
- 在切口部位直接涂抹一层三联抗生素软膏。
- 将动物置于温暖的加热垫上，使其仰卧位恢复。一旦动物能够无需协助维持胸卧位，即可将其放回与其他小鼠一同饲养。
5. 术后监测与组织采集
- 术后一周内每天检查动物的切口部位及整体健康状况，之后每周检查一次。若术后14天缝线仍完好无损，则予以拆除。
注意： 出现健康状况恶化迹象的动物（例如 体重显著下降、毛发蓬乱、呼吸困难）应实施安乐死，并采集组织样本。
- 当小鼠达到预定的术后时间点后，按照上述方法注射氯胺酮/赛拉嗪以进行麻醉。
- 对动物进行心脏灌注，并取甲状腺/气管及其他目标组织（此处不详细描述）。
结果
在注射未分化甲状腺癌（ATC）细胞4周后，我们在总共20只小鼠中检测到19只存在侵袭性甲状腺肿瘤。如图2A所示，接受5×105个贴壁培养ATC细胞原位注射的小鼠，在注射后4周可见癌细胞显著浸润甲状腺组织。通过苏木精-伊红（H&E）染色证实，侵袭性ATC细胞具有典型特征，表现为纺锤形细胞以及中等至巨大细胞，胞质嗜酸性，细胞核较大。作为对照，图2B展示了未注射对照小鼠的甲状腺和气管组织。未注射小鼠的滤泡结构排列紧密但疏松，基本呈圆形形态。
由于甲状腺体积较小且采用注射方式递送，可能会出现意外结果。图3A展示了最常观察到的情况，即在甲状腺外部但未包绕甲状腺的位置形成肿瘤肿块。这极有可能是由于注射细胞时针头穿透并超出甲状腺所致。偶尔也会发现小鼠在肉眼和组织学检查中均无肿瘤生长，如图3B所示。无法检测到肿瘤形成的原因可能是细胞悬液从注射部位被排出，并扩散至周围组织和腔隙中。
图 1. 暴露甲状腺。标签指示位于气管两侧的右侧和左侧甲状腺腺体。
图2. 甲状腺成功注射后肿瘤生长与侵袭的组织学检查 组织样本沿冠状面进行切片。 A) 200倍镜下观察显示小鼠肿瘤显著生长，苏木精-伊红（H&E）染色可见典型梭形细胞及中等至巨大型细胞，胞质嗜酸性，细胞核大&E) 染色。 杜 提示肿瘤细胞侵入甲状腺的原发灶。 B) 对照动物的气管和甲状腺（100倍放大图像）。 Tu，肿瘤；S平滑肌 Tr气管； 甲状腺甲状腺
图3. 原位注射的非预期结果。 组织标本沿冠状面切片。A) 周围肿瘤生长，甲状腺内无明显生长（黑色箭头，图像放大倍数为100X）。B) 肉眼检查（未显示）或组织学检查均未检测到肿瘤（图像放大倍数为50X）。Thy，甲状腺。
讨论
在我们的模型中，动物在注射后4周内表现出甲状腺肿瘤转移以及与疾病相关的恶病质和呼吸困难。与大多数使用细胞悬液注射的原位模型一样，存在将细胞注射到周围组织以及注射后细胞悬液渗漏并扩散至靶标以外区域的可能性。需要指出的是，该操作可能带来一个明显的潜在未知因素，即脱靶暴露所导致的非疾病相关性转移或并发症。这是大多数异种移植模型普遍面临的问题，无论所研究的疾病类型如何。尽管如此，通过确保针尖斜面完全穿透覆盖甲状腺的膜结构，并缓慢排出细胞悬液，可显著减少因转移导致的非预期后果。若在注射过程中或注射后观察到渗漏现象，相关动物应从研究中剔除。
在收获甲状腺/气管及其他组织之前，必须对动物进行灌注。其优点有两方面：1）清除红细胞，避免其干扰组织学样本；2）保持组织形态和完整性。此外，对于附着肿瘤组织或被包裹在肿瘤内的甲状腺/气管标本，在包埋进行组织学制备前，应以能够识别解剖标志的方式进行切割。这将显著缩短样本制备时间。
本报告中，我们描述了在原位注射未分化甲状腺癌（ATC）细胞后，高级别甲状腺肿瘤的局部生长与侵袭情况。可通过使用标准组织学染色方法（如苏木精和伊红染色）对其他组织的组织学切片进行分析，或通过免疫组织化学方法利用细胞或病理相关标志物，来研究ATC的转移。通过将荧光报告基因导入甲状腺癌细胞进行遗传修饰，可进一步完善该系统，从而利用活体成像技术监测转移过程以及治疗干预的效果。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
作者感谢圣路易斯华盛顿大学医学院的 Wenjun Li 博士和 Daniel Kreisel 博士在手术培训方面提供的帮助。R.Y.L. 的研究由美国国立卫生研究院基金 R01 DK068057 和圣路易斯大学校长研究基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 细胞培养基 | Mediatech | 10-041-CV | 所用培养基和添加剂取决于细胞系 |
| TC10 自动细胞计数仪 | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe 镊子，带齿；轻微弯曲，4" | Roboz | RS-5135 | |
| 一次性手术刀，No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar 持针器 - 4 ½" 精细带齿 | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 尼龙黑色单丝缝线 | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| 加热垫，可重复使用，8" x 12" | |||
| 布胶带，1" X 10 码 | Medline | MIINON260101 | 用于固定麻醉小鼠 |
| 花生剪毛器/修毛器 | Wahl | 8655 | 用于清除手术部位毛发 |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| 聚维酮碘 | Henry Schein Company | 6906727 | |
| 凡士林眼膏 | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 纱布，12 层 | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| 无菌手术区屏障，18" x 26" | Busse | 696 | |
| 手术单（CSR 包布） | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" 针头 | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" 针头 | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| 氯胺酮（9 mg/ml）/赛拉嗪（1 mg/ml）溶液 | |||
| 三种抗生素软膏 |
参考文献
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
重印与许可
