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方法文章

分子成像技术用于靶向移植的肌肉前体细胞

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DOI：

10.3791/50119

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2013年3月27日

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1Imaging Program, Lawson Health Research Institute, 2Department of Anatomy and Cell Biology, Western University, 3Department of Medical Biophysics, Western University

本文内容

摘要

本文描述了一种评估成肌细胞移植效果的非侵入性方法。该方法利用一种统一的融合报告基因，该基因由可通过不同成像方式检测其表达的基因组成。在此，我们采用fluc报告基因序列，通过生物发光成像技术对靶细胞进行示踪。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种严重的遗传性神经肌肉疾病，每3,500名男孩中就有1人受累，其特征是进行性肌肉退化1, 2。在患者体内，驻留的肌肉卫星细胞（SCs）再生受损肌纤维的能力逐渐下降4。因此，将来自健康供体的肌肉前体细胞（MPCs）/成肌细胞移植是一种具有前景的DMD治疗策略。然而，干细胞治疗应用的一个主要限制是缺乏可靠的长期监测移植细胞的成像技术，以及对其疗效进行评估的手段。本文中，我们描述了一种无创、实时评估成肌细胞移植效果的方法。该方法利用一种由多个基因（萤火虫荧光素酶 [fluc]、单体红色荧光蛋白 [mrfp] 和 sr39 胸苷激酶 [sr39tk]）组成的融合报告基因，其表达可通过多种成像方式检测9, 10。目前已有多种成像方式可供选择，包括正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、磁共振成像（MRI）、光学成像以及高频三维超声，每种技术各有其独特的优势与局限性11。例如，生物发光成像（BLI）具有成本相对较低和高通量的优点。正因如此，在本研究中，我们利用融合基因中包含的萤火虫荧光素酶（fluc）报告基因序列及生物发光成像（BLI）技术，对移植至DMD小鼠模型（X染色体连锁肌营养不良小鼠[mdx小鼠]）后的存活C2C12成肌细胞进行短期定位12-14。重要的是，BLI为我们提供了检测标记MPCs在移植后动力学行为的手段，并可用于在时间和迁移过程中的多次细胞追踪。我们的报告基因策略还允许在同一个活体受试者中整合多种成像方式；鉴于PET具备断层成像特性、精细的空间分辨率以及可扩展至较大动物和人类的能力10,11，它将成为未来研究的基础，我们建议该方法可能有助于将细胞水平开发的技术快速转化为临床前模型乃至临床应用。

方案

1. C2C12 成肌细胞的维持与传代培养

  1. 将C2C12成肌细胞接种于75 cm2培养瓶中，并在高糖Dulbecco改良Eagle培养基（HG-DMEM）中培养，添加胎牛血清（FBS）至终浓度为10%。在整个培养过程中切勿使细胞长至完全汇合，以免耗尽成肌细胞群体。每隔一天更换一次培养基。注意：使用前务必在水浴中将培养基预热至37 °C。
  2. 当成肌细胞汇合度达到约80%时，将细胞传代至新的培养瓶。吸除培养液，用4–5 ml Hank平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，以彻底去除含有胰酶抑制剂的血清。随后用2–3 ml 0.25%（w/v）胰酶-EDTA溶液短暂冲洗细胞层，使贴壁的成肌细胞从培养瓶表面解离。吸除胰酶溶液，将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育5分钟。
  3. 在此孵育期间，准备一个新的培养瓶，加入9 ml HG-DMEM/10% FBS完全培养基。胰酶消化结束后，向细胞中加入10 ml完全培养基，吹打4–5次以确保所有细胞均被悬浮并收集到培养基中。取1 ml细胞悬液接种至新培养瓶中，于37 °C、5% CO2条件下培养。

2. C2C12 细胞转染

  1. 当细胞达到50%融合度时，根据Invitrogen公司的说明书进行转染。简言之，将90 μl Lipofectamine 2000试剂与4.5 ml OPTI-MEM培养基混合。在另一管中，将36 μg CMV-trifusion报告基因DNA与4.5 ml OPTI-MEM混合。轻弹各管以混匀，静置5分钟。将两管内容物合并，轻轻混匀，并在室温下准确孵育三十分钟。注意：应同时设置第二个培养瓶，仅加入Lipofectamine和OPTI-MEM，不进行DNA转染，作为阴性对照。
  2. 移除C2C12细胞的培养基，加入15.5 ml新鲜的高糖DMEM/10%胎牛血清（FBS）培养基。再加入转染混合液，使总体积达到20 ml。
  3. 将细胞在37 °C条件下孵育过夜，至少20小时，以完成转染。
  4. 次日，吸除转染培养基，加入10 ml高糖DMEM/10%FBS培养基。
  5. 在倒置荧光显微镜下观察细胞。同时采集明场图像和红色荧光图像（使用TRITC滤光片组；mrfp激发/发射波长：584/607 nm）。通过多个视野计数表达RFP的细胞数量（荧光下可见）占明场下总细胞数的比例，计算转染效率。

3. 细胞存活率评估/MTT 实验

  1. 转染前一天，将 1×105 个 C2C12 细胞接种至 24 孔板的每个孔中。每孔加入 500 μl 高糖 DMEM/10% 胎牛血清（HG-DMEM/10%FBS）培养基进行培养。
  2. 次日，按照先前所述方法对成肌细胞进行过夜转染。根据转染试剂生产商的建议，确定适用于 24 孔板的试剂用量。设置一组仅加入 Lipofectamine（不含 DNA）的孔作为对照。在荧光显微镜下观察细胞，以确认转染成功。
  3. 移除转染培养基，向成肌细胞中加入含 5 mg/ml 噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）的 HG-DMEM/10% FBS 培养基。向其中八个转染孔中加入 D-荧光素酶底物（D-luciferin），37 °C 孵育 4 小时。
  4. 移除孔内培养基。每孔加入 180 μl 异丙醇以溶解蓝色甲臜结晶，37 °C 振荡 15 分钟。
  5. 避免吸入沉淀物，将溶液转移至 96 孔板中，于 575 nm 波长处测定吸光度。

4. 肌母细胞移植前的制备

  1. 移除培养基，用HBSS洗涤成肌细胞，并按照1.1节所述进行消化处理。
  2. 将细胞重悬于4 ml完全培养基中。
  3. 使用血细胞计数板计数细胞，配制含有106个成肌细胞的相应体积，移入无菌的1.5 ml离心管中。当转染效率约为10%时，这些数值表明移植后可在GE ExploreOptix扫描仪上检测到100,000个表达荧光素酶的细胞。
  4. 调整终注射体积为15 μl，其中含有106个C2C12细胞。如有需要，将离心管在2,000 rpm下离心1分钟，小心用移液器吸除上清液，再将细胞重悬于15 μl不含FBS的高糖DMEM中。

5. 细胞移植

  1. 用 2% 异氟烷/2% O2 对小鼠进行麻醉。拔除后肢背侧区域的毛发。以 1.5% 异氟烷/2% O2 维持麻醉状态。
  2. 确保 C2C12 成肌细胞充分悬浮。将小鼠置于俯卧位，伸展后肢，使用胰岛素注射器以 30° 角直接将细胞注入腓肠肌外侧头。将转染的成肌细胞注射至右侧后肢，未转染的成肌细胞注射至对侧（左侧）后肢。
  3. 进行基线生物发光扫描：迅速将小鼠转移至光学成像仪的载物台上，使其呈俯卧位。连接麻醉气体管路。为确保小鼠持续处于麻醉状态，应由第二人协助连接麻醉管路，同时另一人将动物放入扫描仪中。
  4. 轻柔地伸展后肢，使注射区域清晰可见。使用医用胶带等温和粘合材料将后肢固定到位。
  5. 关闭成像室，并确保无光线进入扫描仪内部，以免增加检测到的背景信号。扫描仪应按照制造商提供的生物发光成像参数设置进行操作，特别注意选择“无激光”模式。
  6. 在去毛区域周围绘制感兴趣区域（ROI），并开始扫描。

6. 将Fluc底物D-荧光素注入mdx小鼠

  1. 小鼠腹腔注射麻醉后，注射150 mg/kg的萤火虫荧光素酶底物D-荧光素钠（使用40 mg/ml的储存液配制，按制造商说明操作）。
  2. 将小鼠复苏，并在准备进行下一次扫描前，给予15分钟的摄取时间。

7. 利用BLI在植入杜氏肌营养不良小鼠模型后靶向检测表达荧光素酶的MPCs

  1. 摄取期结束后，按照5.1节所述方法再次麻醉小鼠。
  2. 将小鼠重新转移至光学扫描仪，并以与背景扫描相同的方式进行另一次生物发光扫描。
  3. 尽管20分钟的摄取期应可提供最大信号强度，但仍可根据需要进行后续扫描。
  4. 图像采集完成后，根据所在机构动物伦理委员会及加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南处死小鼠。分离后肢肌肉并立即置于10%福尔马林中固定，用于石蜡包埋。对肌肉组织进行荧光素酶免疫组织化学染色，以确认成肌细胞已注射至肌肉内。

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结果

当细胞融合度达到50-60%时，将C2C12成肌细胞瞬时转染上述融合报告基因构建体，该构建体由萤火虫荧光素酶[fluc]，单体红色荧光蛋白[mrfp] 和 sr39 胸苷激酶 [sr39tk](图1A）。转染效率通过荧光显微镜计算（图1B、C），利用 mrfp 报告基因构建体中的序列。使用生物发光成像底物D-荧光素标记对细胞存活率无影响（图1D)。转染后，将约100,000个表达mrfp的成肌细胞经肌内注射植入mdx小鼠的腓肠肌中（此前已确定，论文已投稿）；作为对照，将100,000个未转染细胞以相同方式植入对侧后肢。细胞移植后立即经腹腔注射（IP）150 mg/kg D-荧光素酶底物。经过约20分钟的摄取期后，使用小动物光学成像仪（GE ExplorOptix黑色盒子，配备活体动物生物发光与荧光检测功能）对小鼠进行成像。如先前研究所示，两者均 体外 和 植入后 （稿件已提交）D-荧光素的摄取特异性地发生在表达fluc的成肌细胞中...

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讨论

在本研究中，我们描述了一种快速且可靠的分子成像技术——报告基因方法，可用于无创地示踪移植后的成肌细胞/肌肉前体细胞（MPCs）。尽管本研究通过生物发光成像（BLI）展示了移植MPCs的短期定位，但所采用的细胞示踪方式实际上可轻松扩展应用于细胞植入的长期动态评估，只需移植稳定表达报告基因的细胞即可实现。为此，我们的研究团队已构建了携带统一报告基因的转基因小鼠品系。只有表达该报告基因的细胞才能将D-荧光素氧化，从而产生光子，供BLI可视化检测。由于D-荧光素的氧化依赖于基因表达水平，因此该技术是一种用于无创成像存活移植细胞的强大工具。从这些转基因小鼠中获取的肌肉组织，以及通过FACS分离得到的卫星细胞（SCs），在植入mdx小鼠体内后均可实现有效示踪。此外，通过使用肌肉特异性启动子，我们还可追踪这些细胞的分化状态，进一步提升了本文所介绍的此类分子成像技术在杜氏肌营养不良症（DMD）研究领域中的实用价值与重要意义（相关论文已投稿）。除快速、低成本外，BLI还具有无毒性优势，使其成为小动物频繁成像的理想选择。这一特性及其高特异性，将在推进杜氏肌营养不良症的临床前疾病模型研究中发挥不可估量的作...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Sanjiv Gambhir 惠赠 fluc/mrfp/sr39tk 报告基因。本研究由加拿大干细胞网络（The Stem Cell Network，SCN）和 Jesse's Journey 基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C2C12 成肌细胞ATCC
杜尔贝科改良伊格尔培养基Life Technologies12800-017
胎牛血清Life Technologies12483020
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25200-72
汉克斯平衡盐溶液Sigma AldrichH6648
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019
Nikon Eclipse TE2000-5Nikon Instruments Inc.
Xenolight D-荧光素PerkinElmer12279640 mg/ml 溶于 PBS

参考文献

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