小鼠脊柱-斜方肌模型评估小动脉结扎对微血管功能与重塑的影响

摘要

我们展示了一种新型的小鼠斜方肌动脉结扎模型，包括逐步操作流程及所需仪器设备的详细说明。我们描述了手术过程以及与血管网络重塑和功能性血管舒张相关的结果测量方法，这些方法结合了活体显微成像和共聚焦显微镜技术。

摘要

小鼠脊上斜肌是一种薄而表浅的骨骼支持肌，从T3延伸至L4，可通过背部皮肤切口轻松暴露。其独特的解剖结构使其成为研究缺血性损伤及随后微血管重塑的理想模型。本文中，我们展示了一种由本研究团队建立并已发表的^1-3小鼠脊上斜肌小动脉结扎模型。对于某些易感小鼠品系（如Balb/c小鼠），该结扎手术可稳定诱导骨骼肌缺血，并为研究促进再血管化的治疗手段提供平台。我们同时展示了评估方法，包括活体显微成像和共聚焦显微镜技术的应用。由于脊上斜肌解剖位置表浅且厚度较薄（60–200 μm），非常适合此类成像研究。脊上斜肌可进行整体平铺装片，无需组织切片即可实现对整块肌肉微血管网络的成像。我们描述了如何利用活体显微镜获取功能性血管舒张实验后的量化指标，具体包括肌肉收缩引起的小动脉直径增加。此外，我们还演示了组织取材与固定的完整操作流程，这是开展免疫染色研究及共聚焦显微镜观察所必需的前期步骤。

引言

慢性缺血的动物模型是研究缺血性疾病（如外周动脉疾病、冠状动脉疾病和脑血管疾病）病理生理学的有力工具。在啮齿类动物中，如同在人类中一样，动脉闭塞会导致血管网络的结构重塑，包括动脉生成和血管新生。在健康和较年轻的患者中，这种重塑可能足以挽救组织免受缺血引起的损伤，但糖尿病等合并症会严重损害重塑过程和恢复能力。深入了解血管重塑事件的潜在机制，对于开发能够促进这些内源性再血管化治疗策略至关重要。

目前，后肢股动脉结扎或切除是研究小动物慢性缺血诱导的血管重塑的标准技术^4,5然而，由于肌肉组织较厚，难以分析结扎股动脉下游血管网络中微血管的直径、连通性及反应性。我们建立了小鼠脊柱棘肌的小动脉结扎模型：对该背部稳定肌中的一侧侧支供血动脉进行单侧结扎。¹相对较薄的脊上斜方肌（60–200 μm）适用于 正面 免疫染色可实现单细胞分辨率下对完整网络拓扑结构的评估，从而对整个组织内血管重塑事件进行详细分析。脊柱棘肌（spinotrapezius）同样位置表浅且易于接近，因此其血管可通过活体显微镜直接观察，从而高效表征血管重塑及小动脉结扎对血管反应性的影响。

在本报告中，我们详细描述并演示了小鼠脊柱头半棘肌小动脉结扎模型。两者 体内 和 离体 描述了术后评估方法，包括功能性血管扩张的测量，该指标在缺血条件下已被证实会受损⁶，以及对完整肌肉微血管网络的免疫荧光成像。我们还纳入了两项独立的预实验结果，以展示该模型的应用价值。首先，我们采用动脉结扎模型，在C57BL/6小鼠中诱导出血管扭曲程度的统计学显著增加（图2B）。在小动脉侧支的动脉生成过程中，迂曲度会增加。在其他一些由于缺乏侧支小动脉而对缺血更为敏感的小鼠品系中（例如 Balb/c），可观察到毛细血管动脉化现象¹⁰毛细血管动脉化通过管径增大以及α-平滑肌肌动蛋白反应性的出现来检测。其次，对肌肉进行功能性电刺激可引起脊上斜方肌终末小动脉的血管舒张图3B).

方案

1. 脊柱斜方肌供血动脉结扎手术

1. 通过腹腔注射麻醉小鼠。在0.5 ml注射器中配制以下混合液： 0.06 ml 的 100 mg/ml 氯胺酮（Ketamine）
   0.03 ml 的 20.0 mg/ml 赛拉嗪（Xylazine）
   0.01 ml 的 0.4 mg/ml 阿托品（Atropine）
   0.30 ml 的 0.9% 生理盐水。
   给药剂量：每克体重 0.01 ml*，腹腔注射。

*剂量因小鼠品系和来源而异，需相应调整，以确保小鼠在诱导后一小时内恢复。

2. 涂抹标准眼科软膏以防止角膜干燥。
3. 使用修毛剪刀去除背部毛发，随后短时间涂抹脱毛膏。
4. 用氯己定或聚维酮碘对术区进行消毒。聚维酮碘与乙醇交替使用三次，最后以聚维酮碘结束。
5. 将小鼠转移至预先准备好的手术操作台面，台面上应放置加热垫并铺有无菌巾。
6. 使用虹膜剪和标准图案镊，在肩胛骨骨性突起远端约5 mm处的背部皮肤上做一个3-5 mm的直线切口例如 FST，11271-30）通过 tenting 组织并平行于脊柱进行切割。若皮肤色素允许，可通过透皮观察背侧脂肪垫来确定目标切口位置；在脂肪垫的尾侧边界处进行切割。根据需要扩大切口，并使用弹簧剪刀穿过次要皮肤层进行延伸。
   1. 解剖学注释——脊棘上斜方肌位于背部，沿脊柱两侧从T4延伸至L3。其前缘向外侧延伸，约达肩胛骨位置。该肌肉向尾侧逐渐变窄，因此后缘位于前缘内侧，可能紧贴脊柱。另需注意两个脂肪垫，分别位于脊棘上斜方肌的背侧和腹侧，靠近其头侧半部分。
   2. 由于切口引起的炎症已被证明对血管重塑反应无影响，因为假结扎手术并未引起斜方肌血管重塑的变化。这一结果受到两个空间因素的影响。首先，切口位置位于感兴趣区域头侧方向5 mm处，而肌肉内的血管反应通常在该区域进行观察。此外，背部皮肤上的切口部位与血管结扎部位之间被一层腹侧脂肪垫隔开，该脂肪垫覆盖在斜方肌头侧三分之一的上方。
7. 用预热的林格液冲洗切口，以防止肌肉干燥。使用血管扩张剂（如罂粟碱）有助于显露目标动脉以便结扎。
8. 在解剖显微镜下，使用镊子钝性分离背侧白色脂肪垫与下方的肌肉组织，使其分开（但不移除），以便观察血管进入和离开斜方肌脊部外侧边缘的走行。
9. 找到目标动脉，该动脉伴随一条或两条伴行静脉，穿过位于棘上斜方肌腹侧的脂肪垫，走向肌肉的外侧边缘。此动脉供应棘上斜方肌尾侧半部的大部分区域，可通过翻起并复位肌肉以观察动脉在肌内的走行路径来确认。结扎的目标位置是动脉从腹侧脂肪垫穿出并进入肌肉的节段，该区域易于暴露。在此部位，可能需要将动脉-静脉对从腹侧脂肪垫中轻轻分离。需要注意的是，棘上斜方肌由多对动脉-静脉供血，包括穿过背侧和腹侧脂肪垫的血管，操作时应注意避免损伤这些血管。
   1. 可采用多种指标区分动脉与静脉。最佳方法之一是用微探针轻柔阻断血流，并向上游远离肌肉方向移动；直至解除阻断后，动脉内的血流才会恢复。也可依据颜色进行判断，静脉壁含有动脉所没有的白色结缔组织鞘。此外，还可参考使用血管扩张剂前的管径大小，因为静脉通常比动脉更粗。
10. 动脉通常与其伴行静脉紧密相邻；使用微探针和5号镊子进行钝性分离，将微探针从动脉后方穿过，利用其尖端在动脉与静脉之间的自然裂隙中扩大间隙，从而游离出约5 mm长的一段血管。该间隙即为后续穿入缝线的通路。
11. 使用10-0单股缝线和持针器，在分离段血管近端对直径约70 μm的供血动脉进行结扎，采用外科结固定。在分离段血管远端再施加一道结扎，两道结扎线之间保持足够间距，以便后续进行血管横断。
    1. 与股动脉等较粗大血管的结扎相比，由于脊柱棘肌供血动脉的管径较小，手术难度显著增加。经验不足的外科医生尤其容易出现血管撕脱、意外出血及其他手术并发症。特别值得注意的是，在血流受阻后、切割前，识别并切断无色透明的动脉尤为困难。因此，对于不熟悉该操作的术者，建议使用双结扎法，因为双结扎线可为术者提供明确的视觉参考，指示动脉横断的位置，并可通过观察两条结扎线的分离来确认切割完成。然而，经验丰富的外科医生若能清晰识别并在结扎线远端准确切断动脉，则单结扎法可能已足够。尽管该技术可降低锐性结扎缝线意外损伤邻近血管的风险，但仍存在不足之处，包括难以确认动脉是否已被完全横断。
12. 通过观察结扎部位下游血流减少（红细胞柱受阻）来验证结扎效果即 朝向肌肉）。
13. 使用解剖剪在两条结扎线之间横断已结扎的动脉。若仅放置一条结扎线（11a），则需极为小心地向远端方向剪切。
14. 可将载药普通膜（1 mm）置于下游（尾侧）作为实验步骤的一部分。
15. 将移位的筋膜和脂肪组织复位至其原始位置。
16. 使用8-0不可吸收缝线闭合皮肤切口。随后将小鼠置于预先准备好的加热恢复笼中，在观察下给予适当的镇痛药物，例如布比卡因，0.02–0.05 ml的0.25%溶液进行局部浸润。

2. 背部斜方肌活体显微镜检查，原位in situ

1. 将小鼠置于诱导室中，使用100%氧气以3-4 L·min^-1的流速汽化3-4%异氟烷进行麻醉。
   1. 吸入性麻醉剂优于注射类麻醉剂，用于功能测量时可减少心血管抑制。若无法使用吸入性麻醉，建议采用长效注射类麻醉剂（如戊巴比妥钠），以避免动物定位后重复给药。
2. 麻醉成功后，通过麻醉面罩（又称鼻罩）持续输送异氟烷，维持浓度（通常约为2%），流速为0.5-1 L·min^-1。
   1. 小鼠主要通过鼻腔通气，因此仅需用麻醉面罩的隔膜覆盖其鼻部即可。
3. 如有必要，使用修毛剪和脱毛膏去除背部毛发。
4. 将动物转移至加热垫上。
   1. 维持小鼠正常体温状态至关重要，以防低温诱发的血管收缩；可通过加热灯、循环水加热垫或微波加热垫等方式实现。
5. 插入直肠温度探头，并将温控器设定为35 °C。
6. 使用虹膜剪刀和标准图案镊子在斜方肌尾端做皮肤切口。
7. 将切口向前延伸至脂肪垫，形成马蹄形切口，并用塑料膜覆盖皮瓣以防止干燥。
8. 使用镊子和弹簧剪刀钝性分离皮下结缔组织，以最大程度提高视野清晰度。
9. 将刺激电极尽可能紧密地放置，以最小化电流场范围，并将其置于暴露肌肉尾端、脊柱外侧的位置。
10. 使用电极数据采集系统、电极刺激隔离器和计算机控制器，以持续时间为200 μsec、振幅为2 mA、频率为1 Hz的方波进行测试刺激，以确认电极位置。
11. 用塑料膜覆盖暴露的肌肉，防止干燥。
12. 开始计时30分钟，期间血管直径将达到平衡状态。
13. 将活体显微镜置于斜方肌上方，以观察血管结构。
    1. 若使用浸没式物镜，在物镜与塑料膜之间滴加一滴PBS。
14. 从主小动脉（可见的最大血管）上方开始，在X-Y平面移动载物台，定位目标血管。
    1. 使用反射光显微镜观察小动脉需要比红细胞柱提供更高的对比度。我们主要采用侧流暗场成像显微镜来增强微血管对比度，但也可在静脉注射高分子量荧光葡聚糖后，使用反射光荧光显微镜提高对比度。
15. 30分钟平衡期结束后，采集目标血管的图像/视频。
16. 如前所述，以持续时间为200 μsec、振幅为2 mA、频率为8 Hz的方波对肌肉进行90秒刺激。
17. 刺激结束后立即采集另一幅图像/视频，并持续每分钟采集一次，直至血管恢复至静息直径，约10分钟。
18. 在对侧肌肉重复步骤6-18。
19. 数据分析可通过视频测径器实时进行，或使用图像分析软件离线分析。
20. 根据IACUC规程实施小鼠安乐死。

3. 脊上斜方肌组织的采集与固定

1. 通过腹腔注射麻醉小鼠；麻醉剂配方参见“斜方肌供血动脉结扎”步骤1。
2. 使用虹膜剪和标准图案镊子，在小鼠肩胛骨骨性突起头侧数毫米处做一切口。向两侧横向扩展切口，然后向尾侧延伸。
3. 轻柔牵拉皮肤并剪开浅筋膜，将皮肤从背部躯干分离。
4. 使用钝性分离法，用标准镊子去除背部脂肪组织，然后牵拉肌肉，并以类似方法分离腹侧脂肪组织。
5. 使用镊子和弹簧剪去除覆盖在肌肉上的筋膜。此步骤可能较为困难且耗时，但对改善免疫荧光染色和成像效果至关重要。保持组织湿润有助于筋膜的去除。
6. 定位肌肉的外侧边界，使用钝性分离法将斜方肌与其腹侧的脂肪垫分离。
7. 继续沿头侧至尾侧方向进行钝性分离。注意有数条血管进出肌肉的腹侧表面；若需灌注，应在切断这些血管前完成。另需注意，在肌肉尾侧半段，其外侧缘插入位于其腹侧的肌肉中。沿此边界可能需要适当剪切，以完全界定并游离边缘。
8. 切除斜方肌。操作如下：
   1. 按上述方法游离肌肉的外侧边缘。
   2. 在肌肉最头端横向剪断。
   3. 沿内侧边界（沿脊柱）在矢状面进行剪切。
9. 在对侧肌肉重复步骤4–9，然后采用IACUC批准的方法处死小鼠。
10. 将组织固定于明胶包被的玻璃载片上，浸入预冷的甲醇（4 °C）中，或在室温下浸入4%多聚甲醛/去离子水溶液中20分钟。
    1. 可选方案：可采用灌注固定法。在步骤2之前，进行开胸术，在右心房做切口，经左心室灌注5 ml含0.1 mM CaCl₂和2%肝素的1×Tris缓冲盐水，随后灌注5 ml 4%多聚甲醛以固定血管，最后再灌注5 ml含0.1 mM CaCl₂的1×Tris缓冲盐水⁷。
11. 固定后立即用含0.1%皂苷的0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤标本，每次20分钟，共洗涤四次。

结果

显示对脊上斜方肌供血的主要动脉进行结扎的手术视野 图1，标签标注了感兴趣区域。图中显示的是结扎后一周，位于结扎动脉下游处取材并经免疫染色的肌肉区域的一个共聚焦显微图像示例。 图2A. 结扎后，含有表达平滑肌α-肌动蛋白的平滑肌细胞（红色）的增粗侧支小动脉表现出特征性的扭曲形态。结扎侧肌肉（右侧）的血管扭曲度（以血管路径长度与弦长之比表示，即连接相同血管路径端点的直线距离）较未结扎的对侧肌肉有所增加。图2B；n=8。 图3 展示了利用活体显微技术测量终末小动脉功能性血管舒张的初步研究结果。与预期一致，电刺激诱导的肌肉收缩后，小动脉直径显著增加。

图 1. 反射的脊突斜方肌及其供血动脉的手术区域。 供血动脉在 A0 所示的两个位置被结扎。在这两个结扎点之间，并在血流阻断后，于 A 所示位置横断动脉。目标动脉段在箭头 B 所示位置从由 C 标出的腹侧脂肪垫进入由 D 标出的脊突斜方肌。血流方向由虚线箭头 E 表示。

图 2. 微血管网络共聚焦图像用于血管扭曲度的预实验研究。 (A) 取材并整体封片的肌肉组织经平滑肌α-肌动蛋白免疫染色后，使用共聚焦显微镜成像。视野显示的是结扎后1周，位于结扎小动脉下游的肌肉区域。肌肉中可见明显的扭曲血管。 (B) 预实验结果表明，在C57BL/6小鼠（n=8）中，与对侧对照组相比，结扎肌肉中微血管的扭曲度显著增加（p=0.035；单尾Student's t检验），通过血管路径长度与弦距离比值进行测量。

图3. 活体脊上斜方肌小动脉功能性血管舒张的活体显微成像，in vivo。 (A) 脊上斜方肌终末小动脉在静息状态（左）以及8 Hz肌肉收缩停止后即刻（右）的代表性显微照片。(B) 终末小动脉在静息状态下的直径（8.5 ± 0.5 μm，左）以及肌肉收缩90秒后即刻的直径（11 ± 1 μm，中），在Balb/C小鼠（n=6）中，小动脉直径显著增加（p=0.032；单尾配对t检验）。右侧显示变化百分比。

讨论

本文介绍的小鼠脊柱棘肌结扎模型是一种有效的小型动物模型，可用于研究动脉闭塞所引起的功能性和结构性适应变化。该模型与广泛使用的后肢缺血模型⁴互为补充，能够以高空间分辨率提供完整微血管网络的全肌肉视野。此外，由于该肌肉位于背部皮肤下方，便于通过活体显微镜进行系列成像观察，并可通过表面灌流或薄膜植入实现局部药物递送²。这些特点使其成为研究新型治疗靶点在动脉闭塞后对血管重塑和功能性血管舒张作用的理想小型动物模型。

需要注意的是，由于存在若干关键差异，在将背部斜方肌结扎模型中获得的数据与后肢结扎模型中的数据进行比较时应谨慎。首先，背部斜方肌属于稳定肌，其功能和肌纤维类型分布与腿部肌肉不同。本课题组先前已证实，在具有发达侧支小动脉网络的小鼠品系中，背部斜方肌的小动脉结扎所导致的缺氧程度较轻甚至可忽略不计，而相比之下，后肢模型中股动脉结扎后在足垫引发的缺氧则更为显著^1,8-10。我们还发现，在Balb/c小鼠与C57bl/6小鼠之间，背部斜方肌结扎模型诱导的血管重塑反应存在差异：Balb/c小鼠主要通过毛细血管侧支形成进行重塑，而C57bl/6小鼠则通过现有小动脉连接的扩张实现重塑³。这些发现与后肢结扎模型中的观察结果存在有趣的相似性，即在后肢结扎后，Balb/c小鼠的灌注恢复过程较C57bl/6小鼠更为缓慢^9,11,12。在其他组织缺血模型中，小鼠年龄¹³、性别¹⁴以及疾病状态¹⁵也会影响组织对小动脉闭塞的反应，尽管这些预测因素尚未在背部斜方肌结扎模型中进行验证。

其次，脊柱-斜方肌模型中结扎的动脉直径明显小于股动脉，因此结扎所影响的组织体积更小，且位置更偏下游。 即 在循环系统的较低层级，与后肢相比，斜方肌脊部³因此，在比较这两种模型各自的生理反应时，应考虑结扎部位解剖位置上的差异。例如 血管重塑）对此干预的反应。

第三，与上述后肢模型中存在的缺血和低氧相结合的情况相比，脊背棘肌的薄度可能允许氧气从邻近组织扩散至未灌注区域³。第四，脊背棘肌结扎远端血流的恢复速度比后肢结扎模型更快。脊背棘肌结扎模型是一种独特的慢性模型，不应与其他短暂性动脉闭塞模型或缺血-再灌注损伤模型相混淆。我们认为，有可能对该模型进行调整以适应这些类型的条件，但这超出了本文所呈现工作的范围。最后，我们提醒不要将该模型中的临床前观察结果直接外推至人类缺血性疾病的临床表现，尤其是在使用年轻且整体健康的小鼠时，以及由于固有的生理限制（如较高的心率）⁵。尽管如此，我们认为这一新模型是在活体（in vivo）环境中揭示组织对结扎反应的基本机制并识别潜在治疗靶点的有力工具。

除了脊柱斜方肌供血动脉结扎术中提供的手术记录（解剖学注意事项（6a）、区分动脉与静脉（9a）以及使用单个结扎线（11a））之外，该手术的其他几个方面也值得进一步讨论。

首先，在背侧脂肪垫边界处（或肩胛骨后方数毫米处，若无法经皮观察）做初始切口，切口大小以术者操作舒适为宜，术中可根据需要再行扩大。该做法可尽量减少缝合切口所需的工作量，便于术者操作，缩短手术时间，同时减轻动物恢复期间的不适。 Alternatively，根据术者偏好也可采用较大的皮肤切口，因为术野扩大后更易于定位肌肉。此种情况下，切口可采用马蹄形，内侧开放，以便向脊柱方向折叠。在切开皮肤并逐层深入至皮下组织时，若损伤表层血管导致出血，应使用无菌纱布轻压止血，并留出足够时间以实现止血。

值得注意的是，操作组织时应使用尽可能小的力度，且在可能的情况下，用镊子夹持肌肉的外侧边缘，远离预期的缺血区域。这种操作方式有助于避免挤压损伤，从而防止引发额外的炎症介导的组织反应，以免干扰动脉结扎所诱导的血管重塑反应。

总之，我们已证明可将小鼠脊柱棘肌用作手术模型，以研究小动脉结扎后血管和组织的反应。该模型适用于活体评估血管变化（例如，功能性血管舒张）以及 离体 血管变化的评估（例如，血管网络的免疫荧光成像与定量）。多项临床前和临床研究已表明，个体对小动脉阻塞的反应例如 通过小鼠的结扎或人类动脉粥样硬化斑块）与其年龄及疾病的存在与否有关例如 糖尿病、阻塞动脉的直径、个体的遗传组成以及组织的代谢需求 ^11-15小鼠模型（如本文所述模型）可为研究者提供品系特异性的解剖学和遗传学差异以及疾病特异性的表型，从而有助于深入探究这些复杂的相互关系。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
虹膜剪	FST	14090-09	类型：工具
7号镊子	FST	11271-30	类型：工具
5号镊子	FST	11251-20	类型：工具
弹簧剪	Roboz	RS5671	类型：工具
微探针	FST	10140-03	类型：工具 可用直探针替代
持针器	FST	12500-12	类型：工具
麻醉诱导室	JD Medical Dist. Co., Inc.	IC-1086	类型：设备
眼用凝胶	Dechra	NDC 17033-211-38	类型：试剂
加热垫	FST	21060-01	类型：设备
直肠温度探头	FST	21060-01	类型：设备
刺激电极	FHC	UEWSGCSE0N1M	类型：设备
艺术家聚合物黏土	Polyform	N/A	类型：设备
PowerLab 数据采集系统	ADInstruments	ML 845	类型：设备
刺激隔离器	ADInstruments	FE 180	类型：设备
LabChart	ADInstruments	ML S060/7	类型：软件
落射式荧光显微镜	Olympus	BFXM	类型：设备
高分子量荧光葡聚糖	Sigma	FD250S-100MG	类型：试剂
视频测径器	Colorado Video	308	类型：设备
自动血管分析软件（AVA）	Microvision Medical		类型：软件
抗-αSMA 荧光偶联抗体	Sigma	1A4-Cy3	类型：试剂 克隆型，1:100
荧光显微镜	Olympus	BFXM	类型：设备
高分子量荧光葡聚糖	Sigma	FD250S-100MG	类型：试剂