一种可用于在生理和病理生理条件下评估治疗化合物的皮肤伤口愈合小鼠模型。
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摘要
摘要
伤口愈合与修复是人类生命过程中最复杂的生物学过程。受伤后，多种生物学通路会被激活。例如糖尿病患者可能出现伤口愈合受损，进而导致截肢等严重不良后果。因此，人们越来越迫切地需要开发能够促进伤口修复的新型药物。然而，这些药物的测试以往主要依赖猪等大型动物模型，往往不切实际。小鼠是理想的临床前模型，因其成本低且易于进行遗传操作，有助于深入探究作用机制。然而，小鼠的伤口愈合过程与人类有本质不同，因其主要通过伤口收缩完成。我们的小鼠模型通过在伤口周围使用固定夹板克服了这一差异。通过夹板固定伤口后，修复过程则主要依赖上皮化、细胞增殖和血管生成，这些过程更接近于人类伤口愈合的生物学机制。尽管该模型需要操作的一致性和细致性，但并不涉及复杂的外科技术，可稳健地测试具有潜力的治疗药物，例如促进血管生成或抑制炎症的化合物。此外，每只小鼠自身即为对照，因每只动物身上制备两个伤口，可在同一动物上同时应用待测化合物和对照溶剂。总之，我们展示了一种实用、易于掌握且稳健的伤口愈合模型，其愈合过程与人类具有可比性。
引言
伤口愈合障碍在全球范围内导致显著的发病率和死亡率，糖尿病患者尤其如此1,2。在人体中，伤口愈合是一个连续的过程，各阶段之间存在显著重叠3。创伤发生后，立即启动炎症反应。炎症细胞释放多种因子，促进细胞增殖、迁移和血管生成等过程。在再上皮化和新生组织形成之后，进入以细胞凋亡和胶原蛋白等基质蛋白重组为特征的组织重塑阶段。
目前尚无法复制伤口愈合的复杂性 体外 这需要使用动物模型。迄今为止，伤口愈合研究仅限于大型动物模型，例如猪，以确保其愈合过程与人类具有等效性和可比性。然而，这类研究使用大型动物在饲养上存在困难，且并非总是具有可行性4实验室小鼠是一种经济的动物模型，可轻松进行遗传操作，适用于机制研究。5-7然而，小鼠伤口的愈合方式与人类不同，主要归因于收缩过程的差异。8这在一定程度上是由于存在一层广泛的皮下横纹肌，称为肉膜肌（panniculus carnosus），而该结构在人类中 largely 缺失。在小鼠中，这一肌层使得皮肤能够独立于深层肌肉移动，并介导伤口形成后皮肤的快速收缩。
为了克服这一局限性，可通过使用固定环（图1）8,9来改良小鼠伤口愈合模型，以模拟人类的伤口愈合过程。本视频展示了这种带固定环的小鼠伤口模型，该模型可消除伤口收缩，更接近人类的再上皮化和新生组织形成过程。在该模型中，在小鼠背部中线两侧各创建一个包含肉膜层（panniculus carnosus）的全层皮肤缺损伤口。随后在黏合剂辅助下将硅胶固定环置于伤口周围，并用间断缝线将固定环固定。每只小鼠自身作为对照，其中一个伤口接受治疗干预，另一个则给予赋形剂对照，从而减少实验动物使用数量。局部给药后，覆盖透明闭塞性敷料。根据需要，可移除敷料以进行后续局部处理和/或测量伤口面积10,11。实验结束后，可通过免疫组织化学方法评估伤口闭合情况、组织形态结构以及新生血管化程度。该模型经济实用、操作简便，也可用于评估糖尿病或其他病理生理状态下（如慢性疾病）的伤口愈合过程。
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方案
1. 夹板和封闭敷料的制备
- 在0.5 mm厚的硅胶片上画出直径10 mm的圆，并使用剪刀或活检打孔器制备硅胶圆片。
- 将5 mm活检打孔器置于10 mm圆的中心，用力按压以形成一个孔，制成“甜甜圈”状圆片，用作夹板。
- 在透明闭合性敷料（如Opsite）上画出直径10 mm的圆，并使用剪刀制备圆形敷料。
2. 实验动物
- 获取动物伦理委员会对所有将要进行的实验的批准。
- 从商业育种机构（例如 Jackson 实验室）获取8周龄（22–26克）的雄性C57BL/6J小鼠。
- 将小鼠饲养在标准条件下：21 °C，12小时光照-黑暗循环，并可自由获取食物和水。
- （可选）：可通过腹腔一次性注射165 mg/kg链脲佐菌素（溶于柠檬酸缓冲液，pH 4.5）在6至7周龄小鼠中诱导糖尿病，并通过血糖仪（AccuChek血糖仪）定期监测血糖水平以确认高血糖。糖尿病小鼠可能出现多尿，因此垫料可能需要更频繁更换以消除潮湿，且应密切监测其体重。
3. 麻醉与手术准备
- 使用100%氧气（流速1 L/min）中含5%异氟烷诱导全身麻醉，并以1-3%异氟烷维持麻醉。
- 确认小鼠深部屈肌反射被抑制，将小鼠置于俯卧位。
- 使用电动剪毛器去除从颈部基底部向下延伸3 cm、介于两侧肩胛骨之间的毛发，以准备手术区域。
- 可涂抹脱毛膏，但时间不得超过2分钟。使用湿润的纱布擦拭，以确保完全清除脱毛膏及残留毛发。
- 用酒精棉片擦拭皮肤，并先后两次涂抹10%聚维酮碘（碘伏），然后对小鼠进行铺巾。
4. 切口与伤口固定
- 小鼠伤口愈合模型的示意图如图所示 图1.
- 使用无菌的4 mm活检打孔器，在小鼠肩部水平、背中线两侧各标记一个圆形伤口区域（参见 图2a-2b).
- 使用有齿镊提起轮廓中点处的皮肤，用虹膜剪剪出贯穿皮下组织的全层伤口图 2c-2d)，包括肉膜（panniculus carnosus）图2e，并切除该圆形组织。
- 重复此过程处理中线另一侧的伤口（图2f).
- 移除硅胶夹板两侧的塑料保护涂层。
- 使用氰基丙烯酸酯粘合剂（例如 超级胶水（Super Glue 或 Krazy Glue）的一侧粘附到硅胶夹板上。
- 将夹板置于伤口正上方图 2g）并使用间断的6-0尼龙缝线将夹板固定，以确保位置正确（图 2h).
- 对另一个伤口重复进行夹板固定操作。
- 如果在此时间点需要，将待测的治疗化合物（最多 100 μl）施加于其中一个伤口（图 2i，溶剂对照组分配至另一组。
- 用透明闭塞性敷料（例如 OpSite）覆盖伤口（图2j-2k).
- 将直尺置于夹板下方，并拍摄显微照片（图 2l).
6. 术后管理
- 术后镇痛通过皮下注射给予卡洛芬（5 mg/kg），每日一次。
- 手术后，动物单独饲养，并置于加热垫上直至完全恢复。
- 每日两次观察动物是否有疼痛表现或体重减轻。我们未观察到明显的疼痛相关行为或体重减轻现象。
7. 伤口测量与治疗
- 可每天测量伤口。
- 使用 5% 异氟烷气体（流速 1 L/min）诱导全身麻醉，然后使用 1–3% 异氟烷维持麻醉，确保小鼠的深部感觉反射被充分抑制。
- 用镊子轻轻掀开闭塞性敷料。
- 使用外科游标卡尺测量伤口直径。我们沿 X、Y 和 Z 轴方向测量三次，取其平均值（图 2m–2o），并拍摄显微照片以供后续参考（图 2p）。
- 可选步骤：此时可使用激光多普勒血流成像仪评估动物的血液灌注情况（图 2q）。
- 此时可重新施用治疗化合物及溶剂对照物。
- 随后重新贴上干净透明的闭塞性敷料，并保持动物体温，直至其完全恢复。
- 注意：若夹板未正确固定，伤口将迅速收缩（图 2r）。
8. 组织学分析
- 10天后，通过过量麻醉处死小鼠。
- 使用镊子和手术刀片拆除缝线，并小心剥离夹板。
- 使用虹膜剪在伤口区域周围及下方进行广泛、完整的切除，并将组织在含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中4 °C过夜孵育。
- 将组织转移至含17%蔗糖的PBS溶液中，于4 °C继续孵育24小时，然后轻轻用纸巾吸去多余液体，将组织置于O.C.T.包埋剂中，并在-80 °C下冷冻。
- 可采用苏木精和伊红染色观察伤口结构及上皮间隙。通过免疫组织化学分析（使用Von Willebrand因子）评估新生血管形成情况，以确定毛细血管数量。
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结果
通过计算伤口的平均直径并将结果表示为百分比来确定伤口闭合曲线， 即 100 -（第0天直径 / 第X天直径）。在本实验中，每天向伤口施用一种治疗化合物（或对照溶剂）。该治疗化合物显著加速了伤口闭合。图3）。需要注意的是，在整个实验过程中必须持续佩戴夹板，因为一旦移除夹板，将导致伤口迅速收缩（图 2r）且不同于人类伤口愈合的模式。
图 1. 小鼠伤口愈合模型的示意图。 在该模型中...
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讨论
这是一种小鼠皮肤伤口愈合的实验模型。该模型的一个显著特点是使用硅胶环以防止伤口收缩，从而使再上皮化和新生组织形成得以进行，这一过程类似于人类的伤口愈合。该模型具有良好的适用性，可用于评估生理条件以及病理生理条件下（例如糖尿病）的伤口愈合情况。此外，该模型也可用于在经济高效的条件下评估潜在的促进伤口愈合或血管生成的治疗手段。由于每只小鼠均可作为自身的对照，因此可最大限度地减少实验动物的使用数量。该模型所需的外科技术并不复杂，因此即使外科经验相对较少的研究人员也可广泛使用。
为确保实验的可重复性和准确量化，必须使用缝线将支撑物充分粘附并固定在皮肤上，并且在创建两个伤口之间应尽量缩短时间间隔。由于小鼠伤口在支撑物松动或因小鼠抓挠导致部分脱落之后会迅速收缩，因此需要每天监测支撑物的状况。还需仔细涂抹粘合剂，以尽量减少对支撑物周围健康皮肤的刺激，从而降低小鼠抓挠的可能性。此外，必须严格遵守无菌操作技术，并在每只小鼠之间彻底对器械（尤其是游标卡尺）进行消毒。封闭性敷料的应用也需加以考虑，特别是在伤口不进行每日处理或换药的情况下。Opsite 和 Tegaderm（3M）敷料具...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）提供的资金支持（项目资助号：632512）。Louise Dunn 获得了 NHMRC 早期职业研究员基金的支持，Christina Bursill 获得了国家心脏基金会职业发展研究员基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 厚按压密封硅胶片 | Invitrogen | P18178 | 裁切成外径 1 cm、内径 0.5 cm 的"环形" |
| 5 mm 活检打孔器 | Steifel | BC-B1-0500 | 用于标记需切除的伤口区域 |
| 8.5 cm 弯曲 Vannas 剪刀 | World Precision Instruments | 501232 | 用于伤口切开和切除 |
| Dumont #7b 镊子，11 cm | World Precision Instruments | 501302 | 在切开和切除皮肤时夹持皮肤 |
| 带齿 Graefe 镊子，10 cm | World Precision Instruments | 14142 | 辅助将硅胶夹板固定到皮肤上 |
| 持针器，光滑钳口，弯曲，12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis 镊子，光滑，直型，12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | 用于将硅胶环缝合至皮肤 |
| 刻度尺，0.5 mm 分度 | n/a | ||
| 卡尺，0.25 mm 分度 | Duckworth and Kent | 9-653 | 用于测量伤口面积 |
| Opsite FlexiFix 透明粘性敷膜，10 cm × 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl（卡洛芬） | Pfizer | 462986 |
参考文献
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重印与许可
