一种可用于在生理和病理生理条件下评估治疗化合物的皮肤伤口愈合小鼠模型。
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摘要
摘要
伤口愈合与修复是人类生命过程中最复杂的生物学过程。受伤后，多种生物学通路会被激活。例如糖尿病患者可能出现伤口愈合受损，进而导致截肢等严重不良后果。因此，人们越来越迫切地需要开发能够促进伤口修复的新型药物。然而，这些药物的测试以往主要依赖猪等大型动物模型，往往不切实际。小鼠是理想的临床前模型，因其成本低且易于进行遗传操作，有助于深入探究作用机制。然而，小鼠的伤口愈合过程与人类有本质不同，因其主要通过伤口收缩完成。我们的小鼠模型通过在伤口周围使用固定夹板克服了这一差异。通过夹板固定伤口后，修复过程则主要依赖上皮化、细胞增殖和血管生成，这些过程更接近于人类伤口愈合的生物学机制。尽管该模型需要操作的一致性和细致性，但并不涉及复杂的外科技术，可稳健地测试具有潜力的治疗药物，例如促进血管生成或抑制炎症的化合物。此外，每只小鼠自身即为对照，因每只动物身上制备两个伤口，可在同一动物上同时应用待测化合物和对照溶剂。总之，我们展示了一种实用、易于掌握且稳健的伤口愈合模型，其愈合过程与人类具有可比性。
引言
伤口愈合障碍在全球范围内导致显著的发病率和死亡率，糖尿病患者尤其如此1,2。在人体中，伤口愈合是一个连续的过程，各阶段之间存在显著重叠3。创伤发生后，立即启动炎症反应。炎症细胞释放多种因子，促进细胞增殖、迁移和血管生成等过程。在再上皮化和新生组织形成之后，进入以细胞凋亡和胶原蛋白等基质蛋白重组为特征的组织重塑阶段。
目前尚无法复制伤口愈合的复杂性 体外 这需要使用动物模型。迄今为止，伤口愈合研究仅限于大型动物模型，例如猪，以确保其愈合过程与人类具有等效性和可比性。然而，这类研究使用大型动物在饲养上存在困难，且并非总是具有可行性4实验室小鼠是一种经济的动物模型，可轻松进行遗传操作，适用于机制研究。5-7然而，小鼠伤口的愈合方式与人类不同，主要归因于收缩过程的差异。8这在一定程度上是由于存在一层广泛的皮下横纹肌，称为肉膜肌（panniculus carnosus），而该结构在人类中 largely 缺失。在小鼠中，这一肌层使得皮肤能够独立于深层肌肉移动，并介导伤口形成后皮肤的快速收缩。
为了克服这一局限性，可通过使用固定环（图1）8,9来改良小鼠伤口愈合模型，以模拟人类的伤口愈合过程。本视频展示了这种带固定环的小鼠伤口模型，该模型可消除伤口收缩....
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方案
1. 夹板和封闭敷料的制备
- 在0.5 mm厚的硅胶片上画出直径10 mm的圆，并使用剪刀或活检打孔器制备硅胶圆片。
- 将5 mm活检打孔器置于10 mm圆的中心，用力按压以形成一个孔，制成“甜甜圈”状圆片，用作夹板。
- 在透明闭合性敷料（如Opsite）上画出直径10 mm的圆，并使用剪刀制备圆形敷料。
2. 实验动物
- 获取动物伦理委员会对所有将要进行的实验的批准。
- 从商业育种机构（例如 Jackson 实验室）获取8周龄（22–26克）的雄性C57BL/6J小鼠。
- 将小鼠饲养在标准条件下：21 °C，12小时光照-黑暗循环，并可自由获取食物和水。
- （可选）：可通过腹腔一次性注射165 mg/kg链脲佐菌素（溶于柠檬酸缓冲液，pH 4.5）在6至7周龄小鼠中诱导糖尿病，并通过血糖仪（AccuChek血糖仪）定期监测血糖水平以确认高血糖。糖尿病小鼠可能出现多尿，因此垫料可能需要更频繁更换以消除潮湿，且应密切监测其体重。
3. 麻醉与手术准备
- 使用100%氧气（流速1 L/min）中含5%异氟烷诱导全身麻醉，并以1-3%异氟烷维持麻醉。
- 确认小鼠深部屈肌反射被抑制，将小鼠置于俯卧位。 ....
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结果
通过计算伤口的平均直径并将结果表示为百分比来确定伤口闭合曲线， 即 100 -（第0天直径 / 第X天直径）。在本实验中，每天向伤口施用一种治疗化合物（或对照溶剂）。该治疗化合物显著加速了伤口闭合。图3）。需要注意的是，在整个实验过程中必须持续佩戴夹板，因为一旦移除夹板，将导致伤口迅速收缩（图 2r）且不同于人类伤口愈合的模式。
图 1. 小鼠伤口愈合模型的示意图。 在该模型中.......
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讨论
这是一种小鼠皮肤伤口愈合的实验模型。该模型的一个显著特点是使用硅胶环以防止伤口收缩，从而使再上皮化和新生组织形成得以进行，这一过程类似于人类的伤口愈合。该模型具有良好的适用性，可用于评估生理条件以及病理生理条件下（例如糖尿病）的伤口愈合情况。此外，该模型也可用于在经济高效的条件下评估潜在的促进伤口愈合或血管生成的治疗手段。由于每只小鼠均可作为自身的对照，因此可最大限度地减少实验动物的使用数量。该模型所需的外科技术并不复杂，因此即使外科经验相对较少的研究人员也可广泛使用。
为确保实验的可重复性和准确量化，必须使用缝线将支撑物充分粘附并固定在皮肤上，并且在创建两个伤口之间应尽量缩短时间间隔。由于小鼠伤口在支撑物松动或因小鼠抓挠导致部分脱落之后会迅速收缩，因此需要每天监测支撑物的状况。还需仔细涂抹粘合剂，以尽量减少对支撑物周围健康皮肤的刺激，从而降低小鼠抓挠的可能性。此外，必须严格遵守无菌操作技术，并在每只小鼠之间彻底对器械（尤其是游标卡尺）进行消毒。封闭性敷料的应用也需加以考虑，特别是在伤口不进行每日处理或换药的情况下。Opsite 和 Tegaderm（3M）敷料具.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）提供的资金支持（项目资助号：632512）。Louise Dunn 获得了 NHMRC 早期职业研究员基金的支持，Christina Bursill 获得了国家心脏基金会职业发展研究员基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 厚按压密封硅胶片 | Invitrogen | P18178 | 裁切成外径 1 cm、内径 0.5 cm 的"环形" |
| 5 mm 活检打孔器 | Steifel | BC-B1-0500 | 用于标记需切除的伤口区域 |
| 8.5 cm 弯曲 Vannas 剪刀 | World Precision Instruments | 501232 | 用于伤口切开和切除 |
| Dumont #7b 镊子，11 cm | World Precision Instruments | 501302 | 在切开和切除皮肤时夹持皮肤 |
| 带齿 Graefe 镊子，10 cm | World Precision Instruments | 14142 | 辅助将硅胶夹板固定到皮肤上 |
| 持针器，光滑钳口，弯曲，12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis 镊子，光滑，直型，12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | 用于将硅胶环缝合至皮肤 |
| 刻度尺，0.5 mm 分度 | n/a | ||
| 卡尺，0.25 mm 分度 | Duckworth and Kent | 9-653 | 用于测量伤口面积 |
| Opsite FlexiFix 透明粘性敷膜，10 cm × 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl（卡洛芬） | Pfizer | 462986 |
参考文献
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
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重印与许可
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