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焦磷酸测序用于微生物鉴定与特征分析

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DOI：

10.3791/50405

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2013年8月22日

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1Center for Biotechnology Education, Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 2Qiagen Sciences, Inc.

本文内容

摘要

焦磷酸测序是一种多功能技术，可促进微生物基因组测序，用于鉴定细菌种类、区分细菌菌株以及检测赋予微生物抗药性的遗传突变。本视频将演示微生物扩增子的制备、扩增子焦磷酸测序以及DNA序列分析的操作流程。

摘要

焦磷酸测序是一种多功能技术，可促进微生物基因组测序，用于鉴定细菌种类、区分细菌菌株以及检测赋予微生物对抗菌药物耐药性的遗传突变。焦磷酸测序在微生物学应用中的优势包括快速、可靠的高通量筛查，以及对微生物及其基因组突变的准确识别。焦磷酸测序通过一次一个碱基地合成互补链来实现DNA测序，同时确定在合成反应中掺入的特定核苷酸。该反应发生在固定的单链模板DNA上，四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）被依次加入，未掺入的dNTP在下一个dNTP加入前通过酶促反应降解。掺入模板的特定碱基通过化学发光信号的产生进行检测。产生化学发光信号的dNTP顺序决定了模板DNA的序列。焦磷酸测序技术的实时测序能力使得在单次检测中快速鉴定微生物成为可能。此外，焦磷酸测序仪器能够分析抗菌药物耐药性的全部遗传多样性，包括SNP分型、点突变、插入和缺失，以及某些抗菌耐药模式中可能出现的多个基因拷贝的定量分析。

引言

焦磷酸测序是一种基于“边合成边测序”原理的快速且准确的核酸测序方法。“边合成边测序”是指利用单链DNA模板逐个碱基地合成互补链，并在每一步通过检测化学发光信号来识别所掺入的碱基（A、T、G或C）。焦磷酸测序反应体系包括模板DNA、脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素、荧光素酶和焦磷酸酶。测序反应开始时，向单链生物素标记的模板DNA中加入四种dNTP之一以及DNA聚合酶。DNA聚合酶将互补的dNTP掺入模板，同时释放出焦磷酸（图1）。ATP硫酸化酶将焦磷酸等比例地转化为ATP。ATP作为催化剂，驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，从而产生光信号（图2）。光信号的强度与掺入的核苷酸数量成正比，由此可判断模板链上连续位置是否存在一种或多种特定的dNTP（dATP、dTTP、dGTP或dCTP）（图3）。在加入下一个dNTP之前，未掺入的dNTP会被焦磷酸酶降解，以确保反应的连续进行。这一“边合成边测序”反应循环依次加入四种dNTP，直至完成对单链DNA模板序列的测定。

要查看焦磷酸测序反应的动画，请点击此处观看视频。

方案

简介：应使用单个细菌菌落接种适当的液体培养基，并过夜培养。然后对细菌沉淀进行处理，利用 commercially available 基因组提取试剂盒纯化基因组 DNA。纯化后的基因组 DNA 其 260/280 (nm) 比值应>1.8，以确保样品无蛋白质污染。用于生成焦磷酸测序模板的基因组 DNA 用量为 10–20 ng。

A. 模板的扩增

（PyroMark PCR 手册；www.qiagen.com/handbooks1）

设置 PCR 反应

注意：其中一条引物必须在其5'端进行生物素标记，并且建议在模板制备时使用HPLC纯化的引物。我们推荐使用PyroMark引物设计软件2.0进行PCR引物和测序引物的设计，该软件针对短读长测序进行了优化；但也可使用NCBI提供的Primer-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）进行引物设计。

  1. 解冻所有所需溶液（见表1），并充分混匀。按照表1配制反应体系。所有操作均可在室温下进行。

注意： PCR预混液含有MgCl2，终浓度为1.5 mM，在大多数情况下可获得满意结果。若需要更高的Mg2+浓度，可向反应体系中添加最多3.5 μl的25 mM MgCl2。

  1. 轻轻吹打反应混合液以充分混匀，然后将适量体积分装至PCR管中。
  2. 向每根PCR管中加入模板DNA。建议使用10 ng基因组DNA。
  3. 根据表2设置PCR仪程序。为方便起见，建议最后在4 °C下保存。若使用的PCR仪无加热盖，需在反应液上覆盖100 μl矿物油。
  4. 将PCR管放入PCR仪中，启动扩增程序。

B. 真空工作站操作规程

固定生物素标记的PCR产物

  1. 按照图4配制主混合液。

注意：在移液前，轻轻摇动链霉亲和素包被的Sepharose珠子瓶，以确保形成均匀的悬浮液。

  1. 根据所用PCR产物的体积，向PCR板的每个孔中加入60-75 μl的预混液，使每孔总体积达到80 μl。
  2. 向每个孔中加入5-20 μl的生物素标记PCR产物。
  3. 用条形盖密封各孔，并使用旋转摇床在室温（15-25 °C）下以1,400 rpm振荡PCR板5-10分钟。

DNA 变性及测序引物的添加

  1. 用退火缓冲液将测序引物稀释至 0.3 μM，并向反应板的每个孔中分装 25 μl。将该板放置于工作站上。
  2. 根据 图 5 所示示意图填充工作站的槽位。
  3. 打开真空泵，并确保真空工具上的开关处于开启状态（图 6）。使用高纯度水（Milli-Q 18.2 MW × cm 或同等纯度）冲洗滤膜探针，该操作在槽 5 中进行（图 5）。随后用新鲜的高纯度水重新填充该槽，供第 12 步使用。
  4. 操作需迅速，将含有磁珠的 PCR 板放置于工作站上。确保该板与加样时的方向一致。
  5. 保持真空开关开启，将真空工具插入 PCR 板的各孔中，持续 20 秒或直至所有液体被完全吸出。磁珠将被真空工具截留（图 7）。
  6. 保持真空持续开启，使用 70 % 乙醇（槽 1）冲洗工具 20 秒或直至所有液体被完全吸出。
  7. 保持真空开启状态，使用变性溶液（槽 2）冲洗工具 20 秒或直至所有液体被完全吸出。

注意： 变性溶液含有氢氧化钠，对眼睛和皮肤有刺激性。操作时务必穿戴实验服、手套和护目镜。

  1. 开启真空泵，用洗涤缓冲液（第3槽）冲洗工具20秒，或直至所有液体被抽吸完毕。
  2. 保持真空泵开启，将真空工具抬升至超过垂直90°的位置，持续5秒，使工具内所有液体完全排出。关闭真空泵，将真空工具对准反应板，缓慢将其插入孔中，并轻轻左右摇动，使磁珠释放至含有测序引物的孔中。
  3. 为清洁真空工具，将滤膜探头浸入高纯水中（第4槽），振荡10秒。
  4. 打开真空泵，用高纯水（第5槽）冲洗工具20秒，或直至所有液体被抽吸完毕。
  5. 将真空工具抬升至超过垂直90°的位置，保持5秒，然后关闭真空泵，并将其置于“停放”位置保存。

将测序引物退火至DNA链

  1. 将反应板放入预热的板架中。
  2. 在80 °C的加热块上加热2分钟。
  3. 从板架中取出反应板，置于实验台上，在室温下冷却5分钟。

Pyromark Q24 操作

注意：使用电源线正上方的电源开关打开仪器。启动可能需要长达 1 分钟的时间。

  1. 根据提供的说明填充色谱柱 PyroMark Gold Q24 试剂手册 2. 确定所需体积时，在仪器软件中设置运行文件，然后在“工具”菜单下选择“运行前信息”
  2. 如果仪器已开启，请确保其未在运行，然后打开盖子。若在不安全的情况下打开盖子，将发出 audible warning signal。
  3. 打开卡盒盖，将卡盒插入，标签面向前方（图8确保弹匣正确插入（前端应可见一条线），然后关闭舱门。
  4. 打开板架固定框，将含有样本的板放入仪器内。
  5. 关闭培养皿固定架和仪器盖图9).

开始运行

  1. 将使用仪器软件创建的运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口。
  2. 在主菜单中选择“Run”，然后按“OK”。
  3. 使用滚动箭头选择所需的运行文件，然后按“Select”。

注意： 当所有预设的压力和温度水平均达到后，仪器将开始分配试剂（此过程可能需要几分钟）。在运行过程中，仪器屏幕会实时显示所选孔的热裂解图谱。使用滚动箭头查看其他孔的热裂解图谱。

完成一次运行

  1. 当仪器确认运行已完成且运行文件已保存至U盘时，按下“关闭”。
  2. 取出U盘。如果U盘在运行完成前已被拔出，请重新插入U盘，选择“管理”然后选择“复制未保存的运行”。
  3. 现在可以使用仪器软件打开并分析该运行文件，并通过Identifire软件将其与已知微生物数据库进行比对。

结果

使用该软件进行典型焦磷酸测序运行的结果显示了用于扩增子生成的正向和反向引物，以及在保守的16S核糖体序列内用于焦磷酸测序反应的测序引物的位置（图10）。引物结合位点之间的高变序列区域允许利用保守的测序引物（5'-TACATGCAAGTCGA）对大量细菌物种进行鉴定。作为内部质量控制，可检查可变区两侧的DNA序列，以确认分析的是正确的DNA区域。焦磷酸测序软件可将生成的序列与内部细菌核糖体序列数据库进行比对和序列比对，从而实现细菌鉴定。此外，还可分析序列以确定导致抗生素耐药性的突变。例如，对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）23S核糖体基因中突变的分析显示存在两种突变模式（GAA或AGA），可导致抗生素耐药性（图11）。来自同一患者的多个分离株可同时进行分析，以追踪耐药性随时间的出现情况，从而辅助对微生物耐药暴发的流行病学调查。

PCR 示意图：使用生物素标记的引物和模板，DNA 聚合酶在 DNA 复制过程中的活性。
图 1. 使用生物素标记的 PCR 产物作为模板，由 DNA 聚合酶掺入 dNTPs，从而生成焦磷酸盐（PPi）。

焦磷酸测序过程示意图；展示DNA掺入；光信号释放；焦测序图峰分析。
图2. ATP硫酸化酶按比例将焦磷酸转化为ATP。 ATP作为催化剂，促进荧光素酶介导的荧光素向氧荧光素的转化，该反应产生与ATP量成正比的光信号。该光信号在焦测序图上记录为一个峰，表示核苷酸的掺入。在加入下一个dNTP以继续合成之前，未掺入的dNTP由焦磷酸酶降解。

核苷酸序列分析；DNA测序图谱；峰表示核苷酸的添加顺序。
图 3. 产生的光信号强度表明特定的脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP 或 dCTP）是否依次被整合到模板链上。

PCR 准备示意图；含磁珠、结合缓冲液、高纯度水的主混合液制备流程。
图 4. 制备主混合液以固定生物素化 PCR 产物的流程图。

PCR工作站示意图，其中缓冲液、变性剂、乙醇、水分别置于标有标签的槽中。

图5. PyroMark工作站，显示PCR板、PyroMark板和槽的位置。

静态平衡装置、电开关、电路组件、物理实验室、能量流动分析。
图6. 真空开关开启与关闭位置的示意图。

用于移液的实验设备；戴手套的手持多通道移液器进行液体转移。
图7. 真空工具。 真空工具的正确操作方法。

用于DNA分析的自动化电泳系统，显示样品托盘和仪器界面。
图8. 打开卡盒门且卡盒已就位。

用于生化研究中微孔板分析的酶标仪设置，侧重于吸收光谱研究。
图9. 卡盒已正确插入且闸门已关闭。

DNA测序比较；PCR引物标注，基因组分析比对图示。
图10. 基于焦磷酸测序的细菌鉴定结果。 PCR引物针对DNA模板的保守区域设计，测序引物则位于扩增子内一段特征明确的高变区DNA序列的紧邻上游（以蓝色显示）。

23S基因突变分析；色谱图；遗传性耐药；DNA测序数据。
图11. 利用焦磷酸测序检测幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的抗生素耐药性。 对含有GAA或AGA序列的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）中导致抗菌耐药性的23S基因突变进行分析。 点击此处查看高清大图。

组分每反应体积终浓度
Pyro PCR Master Mix, 2x12.5 μl1x
CoralLoad Concentrate, 10x2.5 μl1x
25 mM MgCl2（可选）可变≥1.5 mM
Q-Solution, 5x（可选）5 μl1x
引物A/引物B可变/可变0.2 μM/0.2 μM
无RNase水可变-
总体积（加入模板DNA后）25 μl 

表1. PCR反应体系。

   附加说明
初始PCR激活步骤15 min95 °CHotStartTaq DNA聚合酶被激活
三步循环：变性30 sec94 °C 
退火30 sec60 °C
56 °C		用于基因组DNA
用于亚硫酸氢盐转化DNA
延伸30 sec72 °C 
循环次数45  
最终延伸10 min72 °C 

表2. PCR循环参数。

讨论

近年来，多种新一代测序技术已实现商业化。其中应用最为广泛的三种方法是离子半导体测序、单分子实时测序以及合成测序法（SBS）。3-11 这些方法均依赖于边合成边测序的原理，但在检测掺入核苷酸时采用了新颖的检测平台。在离子半导体测序中，单链DNA作为测序链的模板。12 聚合酶和核苷酸像焦磷酸测序一样依次加入。当核苷酸被添加到正在延伸的DNA链上时，会释放出一个氢离子，该氢离子由基于场效应晶体管的传感器检测。

单分子实时测序依赖于零模波导（ZMW）13。ZMW 是一种微小结构，其中单个聚合酶分子被固定在孔的底部。该结构的照明方式使得可以检测到荧光分子。每种核苷酸都标记有荧光分子。当标记有荧光的核苷酸被掺入时，检测器可识别该核苷酸。当下一个核苷酸加入时，荧光分子被切割脱落14。

合成测序（SBS）采用一种独特的方法扩增目标DNA，从而生成具有独特序列的簇。15 首先生成单链模板，然后合成其互补链。每个核苷酸都标记有荧光分子，每次加入一个碱基后，记录所加入碱基的荧光信号。

披露

本文的制作和免费访问由Qiagen赞助。
作者Ahmed、Durocher、Jessen和Vardi为Qiagen Inc.的员工，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

致谢

本项目部分得到了约翰斯·霍普金斯大学教务长办公室的资助 门户科学计划 和 Qiagen 公司

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PyroMark PCR Master Mix, 2xQiagen978703
CoralLoad Concentrate, 10xQiagen978703, 978705
Q-Solution, 5xQiagen978703, 978705
MgCl2, 25 mMQiagen978703, 978705
无RNase水Qiagen129112
引物Qiagen978776 或 978777引物应从可靠的寡核苷酸制造商处购买（例如 QIAGEN Pyromark Custom Assays、IDT等）。冻干引物应溶解于TE缓冲液中，配制成100 μM的储存液。
Pyromark Gold Q24 试剂Qiagen970802
高纯度水（Milli-Q 18.2 MΩ × cm 或同等纯度）
链霉亲和素Sepharose高性能力珠GE Healthcare17-5113-07
PyroMark 退火缓冲液Qiagen979009
PyroMark 变性溶液Qiagen979007
PyroMark 洗涤缓冲液Qiagen979008
PyroMark Q24Qiagen9001514
PyroMark Q24 反应板卡Qiagen979202
PyroMark Q96 HS 吸头架盒Qiagen979105
PyroMark Q24 真空工作站Qiagen9001516
PyroMark Q24 板架Qiagen9022273
旋转摇床Fisher11-675-297
加热金属块Fisher11-718Q

参考文献

  1. PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
  2. PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
  3. Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
  4. Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
  5. Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
  6. Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).
  7. Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
  8. J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
  9. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
  10. Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
  11. King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630(2008).
  12. Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
  13. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
  14. Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
  15. Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).

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细菌种类16S核糖体DNA聚合酶链式反应生物素化引物链霉亲和素磁珠DNA测序化学发光信号抗菌药物耐药性
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