使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

摘要

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。

摘要

本文介绍了一种用于分析目标生物样本（包括细胞、血清或组织）代谢谱的工作流程。首先通过液-液相萃取将样本分离为极性和非极性组分，并进行部分纯化以利于后续分析。初始萃取所得的水相（极性代谢物）和有机相（非极性代谢物）均被分别处理，以全面检测多种代谢物。根据代谢物的分配特性，采用不同的液相色谱方法进行分离。本文介绍了微流速超高效液相色谱（UP）LC方法，但该方案可扩展至更高流速和较低压力条件。样品可通过通用或针对特定化合物优化的离子源条件引入质谱仪。使用近期校准的高分辨率仪器，在正离子和负离子模式下，于宽广的 m/z 范围内以全扫描模式检测多种离子。随后在生物信息学平台上进行无标记差异分析。该方法的应用包括代谢通路筛选、生物标志物发现以及药物研发。

引言

由于高分辨质谱（HRMS）领域的近期技术进步，非靶向、假设生成型的代谢组学方法已成为分析复杂样品的可行手段。¹ 能够实现100,000分辨率并常规达到低百万分之一（ppm）质量精度的质谱仪已由多家供应商广泛提供。^2,3 该质量精度可提高对分析物身份初步指认、同位素模式识别以及加合物鉴定的特异性和置信度。⁴ 当与适当的提取方法及高效液相色谱（LC）或超高效液相色谱（UPLC）联用时，还可结合保留时间数据进一步提升分析特异性。⁵ UPLC具有更高的色谱效率，可实现更高的灵敏度、分辨率和更短的分析时间，从而更全面地覆盖代谢组。⁶ 所获得的大量数据可整合至多种差异分析软件中，用于挖掘有意义的模式或感兴趣的单个分析物。^7,8,9,10,11 初步的候选物质可通过峰检测算法、基于精确质量的分子式预测、碎片图谱预测以及化学数据库检索等多种方法联合进行初步鉴定。该策略有助于优先选择目标化合物，用于耗时的完整结构鉴定，或用于开发更灵敏、更特异的稳定同位素稀释超高效液相色谱-选择反应监测/多反应监测质谱（UPLC/SRM或MRM/MS）方法，后者是当前定量分析的金标准方法。¹²

生物样本的多样性导致了针对尿液¹³、细胞¹⁴、血清¹⁵或组织¹⁶的提取方案不断....

方案

1. 细胞样品提取

1. 对于一个10 cm培养皿的细胞：将1.5 ml含细胞的悬浮液收集至预先标记好的10 ml玻璃离心管中。对于贴壁细胞系，应使用刮棒在冰上以1.5 ml培养基轻柔刮下细胞进行收集。可选：若使用内标物，可在该步骤加入适当体积的内标物。
   备注：某些代谢物的分析需迅速淬灭细胞代谢。对于时间敏感性代谢物的分析，应考虑采用如冷甲醇提取等方法。¹⁷
2. 向每个含有样品的10 ml玻璃离心管中加入6 ml氯仿（CHCl₃）/甲醇（CH₃OH）（2:1, v/v）。将样品置于摇床或多功能涡旋仪上，低速振荡30分钟。振荡后，在4 °C条件下以1,935 × g离心10分钟，离心机加减速设置为低速，以实现完全的相分离。
   可选：为避免使用CHCl₃，可采用二氯甲烷（CH₂Cl₂）进行提取。^18,12
3. 使用长柄巴斯德移液管，将有机相（下层）转移至另一个预先标记好的10 ml玻璃离心管中。继续进行步骤4.1。
4. 将上层水相转移至洁净的塑料2 ml离心管中。在氮气流下将样品吹干。如需对水相进行脱盐处理，请继续进行步骤2.6.2；如需直接分析，请继续进行步骤4.1。

2.....

结果

结果显示了杀虫剂鱼藤酮（一种线粒体复合物I抑制剂）处理SH-SY5Y胶质母细胞瘤细胞6小时后的部分数据。为简洁起见，仅展示了有机相正离子模式的数据。样品按上述方法处理和分析（图1，表1，表2），并载入两种非标记定量分析平台——SIEVE和XCMS在线系统进行差异分析。尽管这两种差异分析程序鉴定出大量差异代谢物（图2，图3），但其中可能包含潜在的假象、积分不良的峰以及其他分析价值存疑的特征峰。可通过筛选信号强度适当、同组样品间变异度低、背景信号水平合理且色谱峰形良好的特征峰来评估其可靠性（图3）。

为了验证初始筛选结果的下游确认，我们在3 ppm范围内分离出一个质荷比对应于处理化合物鱼藤酮的特征峰（图3，图4）。我们通过超高效液相色谱-高分辨串联质谱（MS/MS）对样品及纯化合物进行分析，确认了该分析物的身份（图5）。此外，我们还鉴定出一个在鱼藤酮处.......

讨论

非靶向代谢组学为研究内源性或外源性物质的生物转化，或获取特定样本的代谢谱，提供了一种强有力的工具。该技术的输出结果取决于所用分析技术对样本的分离与检测分辨率和灵敏度，处理所产生的大规模数据集的能力，以及从数据集中挖掘有用信息的能力。例如 精确质量数据库搜索。近年来，高分辨率质谱仪以及高效或超高效液相色谱技术的进步为此提供了支持。差异分析软件已解决了分析过程中的瓶颈问题，能够高通量地完成峰检测、保留时间漂移校正、过滤及统计分析。^20,21,22 选择合适的生物信息学分析流程时，应考虑以下因素：数据质心化算法、峰检测、峰积分、峰对齐、整合串联质谱（MS/MS）数据的能力，以及处理同位素或加合物的能力。²³ 还应考虑选择合适的化学信息学数据库。^24,25,26,27 目前，尚无任何单一数据库能够全面鉴定化合物并整合精确质量数据、二级质谱（MS/MS）数据或液相色谱（LC）数据，这仍是该领域的主要难题。

本文展示的工作流程结合了液液萃取、微流液相色谱和高分辨质谱技术，并在细胞培养处理模型中应用了两种不同的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
磷酸盐缓冲液	Mediatech	21-031-CM
水（H2O）	Fisher Scientific	W7-4	（optima）
乙腈（CH3CN）	Fisher Scientific	A996-4	（optima）
甲醇（CH3OH）	Fisher Scientific	A454-4	（optima）
异丙醇	Fisher Scientific	A464-4	（optima）
氯仿（CH3Cl）	Sigma-Aldrich	366927	危险
二氯甲烷（CH2Cl2）	Acros Organics	61030-1000	用于替代氯仿
乙醚	Sigma-Aldrich	346136	用于替代氯仿
甲酸（FA）	Fisher Scientific		（optima）
NH4OH	Fisher Scientific	A470-250	（optima）
甲酸铵（HCOONH4）	Sigma-Aldrich	78314
MicroSpin C18 柱	Nest Group Inc	SS18V
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-200
10 ml 玻璃离心管	Kimble Chase	73785-10
10 ml 塑料离心管	CellTreat	CLS-4301-015
液相色谱小瓶（玻璃）	Waters	60000751CV
液相色谱插入管（玻璃）	Waters	WAT094171
液相色谱小瓶（塑料）	Waters	186002640
0.22 μm 滤膜	Corning	8169	尼龙
2 ml Eppendorf 管	BioExpress	C-3229-1	低吸附
设备
高分辨质谱仪	Thermo Scientific	LTQ XL-Orbitrap
高效液相色谱/超高效液相色谱	Waters	nanoACQUITY UPLC
离子源	Michrom	Thermo Advance Source
差异分析软件	Thermo Scientific	SIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130	Waters	186003546	1.7 μm 粒径，150 mm × 100 μm
Acentis Express C8	Sigma-Aldrich	54262	2.7 μm 粒径，15 cm × 200 μm