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方法文章

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

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DOI：

10.3791/50433

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2013年5月20日

 ,  ,  ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。

摘要

本文介绍了一种用于分析目标生物样本（包括细胞、血清或组织）代谢谱的工作流程。首先通过液-液相萃取将样本分离为极性和非极性组分，并进行部分纯化以利于后续分析。初始萃取所得的水相（极性代谢物）和有机相（非极性代谢物）均被分别处理，以全面检测多种代谢物。根据代谢物的分配特性，采用不同的液相色谱方法进行分离。本文介绍了微流速超高效液相色谱（UP）LC方法，但该方案可扩展至更高流速和较低压力条件。样品可通过通用或针对特定化合物优化的离子源条件引入质谱仪。使用近期校准的高分辨率仪器，在正离子和负离子模式下，于宽广的 m/z 范围内以全扫描模式检测多种离子。随后在生物信息学平台上进行无标记差异分析。该方法的应用包括代谢通路筛选、生物标志物发现以及药物研发。

引言

由于高分辨质谱（HRMS）领域的近期技术进步，非靶向、假设生成型的代谢组学方法已成为分析复杂样品的可行手段。1 能够实现100,000分辨率并常规达到低百万分之一（ppm）质量精度的质谱仪已由多家供应商广泛提供。2,3 该质量精度可提高对分析物身份初步指认、同位素模式识别以及加合物鉴定的特异性和置信度。4 当与适当的提取方法及高效液相色谱（LC）或超高效液相色谱（UPLC）联用时，还可结合保留时间数据进一步提升分析特异性。5 UPLC具有更高的色谱效率，可实现更高的灵敏度、分辨率和更短的分析时间，从而更全面地覆盖代谢组。6 所获得的大量数据可整合至多种差异分析软件中，用于挖掘有意义的模式或感兴趣的单个分析物。7,8,9,10,11 初步的候选物质可通过峰检测算法、基于精确质量的分子式预测、碎片图谱预测以及化学数据库检索等多种方法联合进行初步鉴定。该策略有助于优先选择目标化合物，用于耗时的完整结构鉴定，或用于开发更灵敏、更特异的稳定同位素稀释超高效液相色谱-选择反应监测/多反应监测质谱（UPLC/SRM或MRM/MS）方法，后者是当前定量分析的金标准方法。12

生物样本的多样性导致了针对尿液13、细胞14、血清15或组织16的提取方案不断优化。本方案涵盖了细胞、血清和组织的提取方法。在适当情况下，还提供了注释和额外参考文献，以说明如何修改该操作流程，以适用于稳定同位素的检测，或特别不稳定的代谢物的检测。

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方案

1. 细胞样品提取

  1. 对于一个10 cm培养皿的细胞：将1.5 ml含细胞的悬浮液收集至预先标记好的10 ml玻璃离心管中。对于贴壁细胞系，应使用刮棒在冰上以1.5 ml培养基轻柔刮下细胞进行收集。可选：若使用内标物，可在该步骤加入适当体积的内标物。
    备注：某些代谢物的分析需迅速淬灭细胞代谢。对于时间敏感性代谢物的分析，应考虑采用如冷甲醇提取等方法。17
  2. 向每个含有样品的10 ml玻璃离心管中加入6 ml氯仿（CHCl3）/甲醇（CH3OH）（2:1, v/v）。将样品置于摇床或多功能涡旋仪上，低速振荡30分钟。振荡后，在4 °C条件下以1,935 × g离心10分钟，离心机加减速设置为低速，以实现完全的相分离。
    可选：为避免使用CHCl3，可采用二氯甲烷（CH2Cl2）进行提取。18,12
  3. 使用长柄巴斯德移液管，将有机相（下层）转移至另一个预先标记好的10 ml玻璃离心管中。继续进行步骤4.1。
  4. 将上层水相转移至洁净的塑料2 ml离心管中。在氮气流下将样品吹干。如需对水相进行脱盐处理，请继续进行步骤2.6.2；如需直接分析，请继续进行步骤4.1。

2. 血清样本提取

  1. 将20 μl血清转移至一个塑料2 ml离心管中。可选：如使用内标物，可在该步骤加入适量分样。
  2. 加入190 μl CH3OH，涡旋振荡10秒。
  3. 加入380 μl CHCl3，涡旋振荡10秒。
  4. 加入120 μl H2O以诱导相分离。涡旋振荡样品10秒，室温下静置平衡10分钟。
  5. 在4 °C条件下以8,000 × g离心10分钟，使两相分离。
  6. 将下层有机相转移至一个新的洁净塑料2 ml离心管中。继续进行步骤4.1。
  7. 将上层水相转移至一个新的洁净塑料2 ml离心管中。在氮气下将样品完全蒸发。
  8. 用200 μl H2O重新溶解样品。可使用酸或碱试剂（0.1%乙酸、甲酸或0.1%氢氧化铵）优先提取对pH敏感的代谢物。在冰上超声处理20分钟，确保样品完全重悬。
  9. 用500 μl CH3OH活化C18离心柱。
  10. 用500 μl H2O洗涤两次以平衡离心柱，然后上样。若使用了酸/碱试剂，则在洗涤步骤中应保持相同浓度。
  11. 用500 μl H2O洗涤以脱盐。同样，若使用了酸/碱试剂，则在洗涤步骤中应保持相同浓度。
  12. 用两份200 μl含80% CH3OH的H2O溶液洗脱，收集至预先标记的洁净2 ml离心管中。同样，若使用了酸/碱试剂，则在洗涤步骤中应保持相同浓度。继续进行步骤4.1。

3. 从组织中提取样本

  1. 根据组织类型，使用 10–100 mg 的冷冻组织。将整块组织加入预标记的 2 ml 低吸附 Eppendorf 管中，管内含 1 ml PBS（1 M，pH 6.8），并置于冰浴中。可选：若使用内标物，应在加入组织前将其添加至缓冲液中。
  2. 在冰上使用电动组织研磨器对每个 Eppendorf 管中的组织进行匀浆，每次 30 秒。样品之间，分别用两个装有 CH3OH 和 H2O 的试管清洗组织研磨器。
  3. 用塑料移液器将组织匀浆转移至预标记的 10 ml 玻璃离心管中。转移后，用 1 ml CH3OH 对每个 Eppendorf 管冲洗 2 次，并将洗涤液加入玻璃管中的组织匀浆中。
  4. 向每个含有组织匀浆和 CH3OH 洗涤液的 10 ml 玻璃管中加入 4 ml CHCl3。将样品置于摇床或多功能涡旋仪上，低速振荡 30 分钟。
  5. 振荡后，在低加速/减速条件下以 1,935 × g 离心 10 分钟，以完全分离两相。可选：为避免使用氯仿，已有采用 CH2Cl2 进行萃取的方法。
  6. 使用长柄巴斯德移液器，将有机相（下层）转移至新的预标记 10 ml 玻璃离心管中。继续进行步骤 4.1。
  7. 使用长柄巴斯德移液器，将水相转移至新的预标记 10 ml 玻璃离心管中。如需脱盐，请转至步骤 2.6.2；否则继续进行步骤 4.1。

4. 超高效液相色谱样品的重悬与过滤

  1. 在氮气下蒸发样品。
  2. 用适用于目标UPLC方法的起始溶液适当体积重新溶解干燥的样品（见表1）。通常建议重悬体积为50–100 μl。轻轻涡旋和/或上下吹打样品，以助溶解分析物。
  3. 将样品转移至0.22 μm尼龙滤管中，以不超过14,000 × g离心，直至样品完全通过滤膜（约5分钟）。确保样品中无可见沉淀残留。
  4. 将滤后样品的上清液转移至预先标记的含插件的UPLC小瓶中。盖上瓶盖后轻弹小瓶，以去除样品瓶底部的气泡。将样品置于冷藏自动进样器（4–5 °C）中。

5. 超高效液相色谱（UPLC）设置

  1. 根据表1中列出的条件，在液相色谱仪控制软件中为有机相样品创建一个运行程序。然后根据表1中列出的条件为水相建立相应的方法。可选：若某些目标分析物尤为重要，可使用这些化合物的重同位素标记类似物优化UPLC条件，并基于这些条件生成分析方法。
  2. 确保UPLC系统充分平衡。在安装色谱柱前应完成流动相的充分预冲洗，并按照制造商的说明对新色谱柱进行平衡（通常为3-5倍柱体积）。记录初始背压值，以便于后续问题的诊断。

6. 质谱仪设置

  1. 使用高分辨质谱仪的控制软件，根据表2中列出的条件建立正离子模式方法。然后使用相同条件建立负离子模式方法。可选步骤：若存在一组已知的高优先级目标分析物，可使用这些化合物的重同位素标记类似物优化离子源和光学系统参数，并基于优化后的条件生成分析方法。
  2. 清洗并校准仪器，建立稳定的喷雾进入质谱仪，并留出足够时间使校准溶液充分从离子源和光学系统中消散。喷雾的稳定性应满足：在与所用液相色谱方法相同的流速下进样校准溶液时，至少连续100次扫描的信号强度相对标准偏差（RSD）在3-5%范围内。
  3. 设置所有样品的进样序列，设定合适的进样体积，并在第一个样品前运行一个空白样品。若怀疑样品间存在残留效应或基质效应，应插入足够的空白或清洗步骤。样品应使用随机数生成器进行随机化排布，并保留记录以避免分析过程中引入批次效应。
    说明：质量控制样品（包括稳定同位素内标或目标化合物的分析标准品）在故障排查以及确保结果的可靠性、可重复性和有效性方面具有重要价值。可在标准品样品的技术重复后运行溶剂空白，用于评估信号强度和保留时间的偏差，以及空白运行中的残留情况。
  4. 启动序列，并定期监测运行过程中是否出现压力波动或信号强度下降等问题。若发现严重问题，应立即停止运行，并从6.2步骤开始重复实验。

7. 差异分析

  1. 本方案提供了两种工作流程。第一种是通过赛默飞公司销售的专有无标记差异分析软件 SIEVE 2.0。第二种工作流程是通过斯克里普斯研究所提供的免费平台 XCMS Online。11 在开始差异分析之前，应手动检查总离子流图（TIC）或查看样品中任何已知化合物的过滤色谱图，以确保所有样品在进样、超高效液相色谱（UPLC）及喷雾过程中运行的重现性与稳定性。
  2. 筛分器
    1. 将质谱仪上的 .raw 数据文件转移至安装有 SIEVE 的工作站硬盘中。注意： 不建议在存储于网络驱动器或通过USB接口连接的驱动器上的数据运行SIEVE，因为这可能会限制分析速度。
    2. 打开 SIEVE，开始新实验。
    3. 将适当的文件载入 SIEVE。
    4. 分配比较组并选择单个参考文件，以使 SIEVE 生成分析参数。
    5. 根据各个实验的具体要求，按照提示调整相应参数。通常建议从严格的参数设置开始，然后逐步放宽参数，因为较宽松的设置可能会延长分析时间。
    6. 在参数中加载适用于正离子模式或负离子模式的正确加合物列表。
  3. XCMS Online
    1. 将文件转换为 XCMS Online 可接受的格式。在本例中，我们将其转换为 mzXML 格式。19
    2. 打开XCMS Online，创建任务。
    3. 上传并命名数据集。仅两个数据集（例如 对照组与处理组）可上传，因为XCMS独立版本仅支持直接比较。
    4. 从下拉列表中选择所需的设置。系统为不同的仪器配置提供了预设参数，可根据实验需求进一步修改。在本实验中，我们使用 HPLC-Orbi2 设置。
    5. 提交并确认工作。
  4. 数据分析
    1. 对于SIEVE和XCMS，在分析完成后将分别生成帧列表和特征列表。请确保液相色谱对齐能够覆盖任何标志性峰。如果未对齐的液相色谱运行中标志性峰出现显著偏移，可能表明样品存在问题。
      可选对于SIEVE，如果使用了内标物，请找到相应的峰组并归一化至选定的帧。对于XCMS在线平台，归一化可在导出后于电子表格中进行。
    2. 通过同类样本群体内的变异系数（CV）绘制数据例如 对照样品）。任何较大的变异系数（CV）值可能表明一个或多个样品存在问题。根据所需性状对列表进行排序（例如 p值<0.05，倍数变化>1.5，组内标准差较低 等等).
    3. 检查各峰在各组间的峰对齐情况、峰积分、高斯峰形、信号强度、同位素及加合物归属。
    4. 根据需要导出数据以进行进一步分析，或生成用于确证和质谱分析的目标质量列表n 实验。

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结果

结果展示了使用杀虫剂及线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮处理SH-SY5Y胶质母细胞瘤细胞6小时后获得的部分数据。为简洁起见，仅呈现有机相正离子模式的数据。样品按上述方法处理和分析（图1，表1，表2），并载入两种非标记定量分析平台——SIEVE和XCMS在线系统进行分析。尽管用于差异分析的两个程序鉴定出大量差异特征峰（图2，图3），但其中可能包含潜在的假象、积分不良的峰以及其他分析价值存疑的特征。可通过筛选具有适当信号强度、同组样品间变异度低、背景信号水平低以及色谱峰形良好的特征来评估其可靠性（图3）。

为了验证初始筛选结果的下游确认，我们在3 ppm范围内分离出一个质荷比对应于处理化合物鱼藤酮的特征峰（图3，图4）。通过超高效液相色谱-高分辨串联质谱（MS/MS）对样品及纯化合物进行分析，确认了该分析物的身份（图5）。我们还鉴定出一个在鱼藤酮处理组中丰度...

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讨论

非靶向代谢组学为研究内源性或外源性物质的生物转化，或获取特定样本的代谢谱，提供了一种强有力的工具。该技术的输出结果取决于所用分析技术对样本的分离与检测分辨率和灵敏度，处理所产生的大规模数据集的能力，以及从数据集中挖掘有用信息的能力。例如 精确质量数据库搜索。近年来，高分辨率质谱仪以及高效或超高效液相色谱技术的进步为此提供了支持。差异分析软件已解决了分析过程中的瓶颈问题，能够高通量地完成峰检测、保留时间漂移校正、过滤及统计分析。20,21,22 选择合适的生物信息学分析流程时，应考虑以下因素：数据质心化算法、峰检测、峰积分、峰对齐、整合串联质谱（MS/MS）数据的能力，以及处理同位素或加合物的能力。23 还应考虑选择合适的化学信息学数据库。24,25,26,27 目前，尚无任何单一数据库能够全面鉴定化合物并整合精确质量数据、二级质谱（MS/MS）数据或液相色谱（LC）数据，这仍是该领域的主要难题。

本文展示的工作流程结合了液液萃取、微流液相色谱和高分辨质谱技术，并在细胞培养处理模型中应用了两种不同的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金P30ES013508和5T32GM008076提供的支持。同时感谢赛默飞世尔科技公司（Thermo Scientific）提供SIEVE 2.0软件的使用权限，以及该公司Eugene Ciccimaro博士和Mark Sanders博士提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
磷酸盐缓冲液Mediatech21-031-CM
水（H2O）Fisher ScientificW7-4（optima）
乙腈（CH3CN）Fisher ScientificA996-4（optima）
甲醇（CH3OH）Fisher ScientificA454-4（optima）
异丙醇Fisher ScientificA464-4（optima）
氯仿（CH3Cl）Sigma-Aldrich366927危险
二氯甲烷（CH2Cl2）Acros Organics61030-1000用于替代氯仿
乙醚Sigma-Aldrich346136用于替代氯仿
甲酸（FA）Fisher Scientific（optima）
NH4OHFisher ScientificA470-250（optima）
甲酸铵（HCOONH4）Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 柱Nest Group IncSS18V
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-200
10 ml 玻璃离心管Kimble Chase73785-10
10 ml 塑料离心管CellTreatCLS-4301-015
液相色谱小瓶（玻璃）Waters60000751CV
液相色谱插入管（玻璃）WatersWAT094171
液相色谱小瓶（塑料）Waters186002640
0.22 μm 滤膜Corning8169尼龙
2 ml Eppendorf 管BioExpressC-3229-1低吸附
设备
高分辨质谱仪Thermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
高效液相色谱/超高效液相色谱WatersnanoACQUITY UPLC
离子源MichromThermo Advance Source
差异分析软件Thermo ScientificSIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μm 粒径，150 mm × 100 μm
Acentis Express C8Sigma-Aldrich542622.7 μm 粒径，15 cm × 200 μm

参考文献

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