在同源免疫活性宿主中评估，基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗相较于使用异质性整体肿瘤细胞致敏的传统DC疫苗，显示出显著更强的抗肿瘤免疫反应。
本文内容
摘要
摘要
我们利用ALDEFLUOR/ALDH作为标志物，从与C57BL/6小鼠同源的鼠黑色素瘤D5细胞以及与C3H小鼠同源的鳞状细胞癌SCC7细胞中鉴定出富含肿瘤干细胞（CSC）的细胞群，并使用细胞裂解物作为抗原来源致敏树突状细胞（DCs），以检测其免疫原性。在两种模型中，无论是肺转移模型还是皮下（s.c. ）肿瘤生长模型，经ALDHhigh CSC裂解物致敏的DCs所诱导的保护性抗肿瘤免疫反应均显著高于经未分选全肿瘤细胞裂解物致敏的DCs。该现象归因于CSC疫苗所诱导的体液和细胞抗CSC免疫应答。特别是，来自接受CSC-DC疫苗免疫的宿主的脾细胞产生IFNγ和GM-CSF的水平显著高于来自接受未分选肿瘤细胞裂解物致敏DC疫苗的宿主的脾细胞。这些结果支持开发基于自体CSC的治疗性疫苗，用于辅助治疗环境下的临床应用。
引言
肿瘤干细胞对传统的化疗和放疗具有相对较强的耐受性1,2。另一方面，这类细胞可能是导致传统癌症治疗后肿瘤复发和进展的关键细胞群体1-4。由于肿瘤干细胞不表达分化的肿瘤抗原，因此它们可能逃避免疫治疗中的现有干预手段——这些手段大多旨在靶向作用于已分化的肿瘤细胞表面的抗原。因此，开发专门针对并清除肿瘤干细胞的新型治疗策略，有望提高当前癌症治疗的疗效。为此，我们从两种动物肿瘤（黑色素瘤D5和鳞状细胞癌SCC7）中分离出富含肿瘤干细胞（CSC）的细胞群体，并将其作为抗原来源，用于刺激抗原呈递细胞（树突状细胞，DC），从而制备CSC-TPDC疫苗。随后，我们在同基因型免疫健全的宿主小鼠（分别为B6小鼠和C3H小鼠）中评估了该CSC-TPDC疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应。我们将CSC-TPDC疫苗诱导的抗肿瘤效果与传统的DC疫苗进行了比较，后者使用未经分选的异质性肿瘤细胞裂解物（H-TPDC）进行致敏，此前我们研究组5,6以及其他研究者7已在临床前研究和临床试验中应用过该方法。
方案
1. ALDEFLUOR 染色
- 细胞样品制备：制备肿瘤细胞的单细胞悬液，可来源于培养的肿瘤细胞或新鲜收获的肿瘤组织样品。计数细胞，并用 ALDEFLUOR 检测缓冲液将细胞悬液调整至浓度为 1 × 106 个细胞/ml。
- 标记四个 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯试管作为对照管，编号如下：#1：未染色，#2：ALDEFLUOR，#3：ALDEFLUOR 加 DEAB，以及 #4：7AAD。
- 向对照管中加入 1 ml 细胞悬液至 #1 和 #4 管，向 #2 管加入 2 ml。向 #3 管中加入 5 µl DEAB（ALDH 抑制剂），并置于冰上。然后向 #2 管中加入 10 µl 活化的 ALDEFLUOR 底物，混匀后立即转移 1 ml 混合液至 #3 管。
- 同时，向其余细胞（样品管）中每百万细胞加入 2 µl 活化的 ALDEFLUOR 底物，细胞浓度同样为 1 × 106 个细胞/ml，使用 ALDEFLUOR 检测缓冲液配制。
- 将 4 个对照管和样品管在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
- 孵育结束后，向对照管 #4 中加入 5 µl 7AAD，向样品管中每 1 × 106 个细胞加入 1 µl 7AAD，4 °C 孵育 10 分钟。
- 将所有试管在 250 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 用 ALDEFLUOR 检测缓冲液重悬细胞。
- 进行基于流式细胞术的分选。
- 使用经 DEAB 处理的 ALDEFLUOR 染色细胞作为阴性对照，以碘化丙啶（PI）7AAD 染色细胞作为活性对照来设定分选门。根据这些对照设定门控，以区分 ALDEFLUOR+/ALDHhigh、D5 和 SCC7 细胞。随后将此门控用于分选上述制备的所有样品细胞中的 ALDEFLUOR+/ALDHhigh D5 和 SCC7 细胞。
2. 肿瘤干细胞裂解物致敏树突状细胞（CSC-TPDC）疫苗的制备
- 使用CO₂处死小鼠（分别为同源B6和C3H小鼠）2 分离股骨和胫骨。
- 将骨骼置于75%乙醇中，室温下处理1分钟。随后使用HBSS洗涤骨骼。
- 用21号针头和10 ml注射器将细胞从骨头上冲洗至培养皿中。
- 使用注射器吹打细胞以制备单细胞悬液。
- 离心1,500 rpm 5分钟后，弃上清。随后加入5 ml红细胞裂解缓冲液，在37℃裂解红细胞1分钟 °C 水浴
- 计数细胞数量，并用完全培养基将细胞悬液调整至浓度为100万个细胞/毫升 含有10 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4的培养基（CM）
- 培养细胞，3天后在CM中补充IL-4和GM-CSF。
- 在第5th 第几天收获未成熟树突状细胞（DCs），并配制DC分离液，其中含4.2 ml溶液C和1 ml OptiPrep密度梯度介质。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml CM中，缓慢将细胞悬液加至分离介质上。离心处理，条件为 2,000 rpm，室温条件下。
- 收集CM与分离介质之间的DCs，计数细胞数量，并用含有10 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4的培养基将细胞悬液调整至浓度为1×10⁶ 个细胞/ml。
- 通过悬浮ALDH制备肿瘤裂解液高 或培养基中的未分选D5或SCC7细胞，经过四次快速冻融处理，随后离心 ∼100 x 离心5分钟以收集裂解物的膜组分。
- 制备CSC-TPDC，需用自体ALDH裂解物脉冲致敏DC高 细胞。制备H-TPDC时，用未分选的异质性肿瘤细胞裂解物刺激树突状细胞（DC）。树突状细胞与肿瘤细胞裂解物的比例相同。
3. 疫苗接种与效力评估
- 分别在正常 B6 小鼠皮下（s.c.）接种 2,500 D5 CSC-TPDC 或 D5 H-TPDC 肿瘤细胞。分别在正常 C3H 动物皮下（s.c.）接种 5,000 SCC7 CSC-TPDC 或 SCC7 H-TPDC 肿瘤细胞。
- 接种疫苗后，通过静脉（i.v.）攻击 B6 小鼠以异源性 D5 肿瘤细胞。 于接种后 20 天使用 CO2 处死小鼠，取出肺组织并计数肺转移灶。
- 在 SCC7 模型中，于 DC 疫苗注射对侧皮下（s.c）接种未分选的 SCC7 肿瘤细胞以攻击 C3H 小鼠，并监测肿瘤大小。
- 实验结束时，使用 CO2 处死 B6 和 C3H 小鼠。 在首次接种疫苗后的第 34 天， 使用 CO2 处死 小鼠，同时采用无菌操作采集各组小鼠的 脾脏。
- 使用包被型抗 CD3 抗体联合抗 CD28 单克隆抗体，在含重组人 IL-2（hrIL-2）的完全培养基中激活脾脏 T 细胞和/或 B 细胞；或在含 LPS 及抗 CD40（FGK45）单克隆抗体腹水的培养基中进行激活。
- 激活后，收集上清液用于 ELISA 检测。
- 进行 ELISA 检测时，于 4 °C 过夜用针对 IFNγ、GM-CSF 和 IgG 的抗体包被酶标板。
- 加入封闭缓冲液后，添加样本和标准品，并在室温下孵育。
- 洗涤酶标板后，加入 HRP 标记的检测抗体及 TMB 底物进行孵育。
- 反应终止后 30 分钟内，在酶标仪上于 450 nm 波长处测定吸光度。
结果
ALDEFLUOR/ALDH 已被用作单一标记物，在多种恶性肿瘤中分离干细胞8-11我们利用ALDEFLUOR作为标记物，在两种肿瘤模型D5和SCC7中鉴定出富含癌症干细胞的细胞群体。我们在小鼠黑色素瘤B16-D5和鳞状细胞癌SCC7中均检测到ALDEFLUOR+细胞。研究发现，ALDEFLUOR+细胞在培养的D5和SCC7肿瘤细胞系中所占比例分别约为0.5%和5.2%。图1）。已对来自已形成肿瘤的新鲜收获肿瘤细胞进行分析，以确认ALDEFLUOR+细胞的存在。同样如图所示 图1，ALDEFLUOR+ 细胞中分别有 2.5% 和 4.2% 的细胞来自 体内 已建立的D5和SCC7肿瘤。这些分选后的D5和SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH+细胞的成瘤性及自我更新能力高 分别在同源免疫活性宿主C57BL/6小鼠和C3H小鼠中评估了种群特性8.
我们在动物实验和临床试验中均使用了异质性未分选的肿瘤细胞裂解物来刺激树突状细胞（H-TPDC）5,6。为了评估肿瘤干细胞（CSCs）的免疫原性，我们分离了ALDHhigh的肿瘤干细胞，并用其裂解物刺激树突状细胞，从而制备CSC-TPDC（图2），并以H-TPDC作为传统的癌症疫苗对照，检测CSC-TPDC是否在抑制肿瘤生长方面具有任何优势作用。
我们通过检测CSC-TPDC诱导的保护性抗肿瘤免疫反应来评估CSC的免疫原性。在D5模型中，将未致敏的免疫健全小鼠在皮下（s.c）接种CSC-TPDC或H-TPDC（裂解物与DC的比例相同），对照组小鼠注射生理盐水（PBS）。末次免疫一周后，通过静脉（i.v.）接种未分选的D5肿瘤细胞进行攻击，3周后处死小鼠并收获肺组织，以计数肺转移灶数量。如表1所示，与PBS组相比，接受H-TPDC处理的小鼠肺转移灶较少。更重要的是，在两次独立实验中，接受CSC-TPDC处理的小鼠肺转移灶数量均显著少于H-TPDC疫苗组。在SCC7模型中，正常的C3H小鼠分别在右侧胁部皮下（s.c）接种SCC7 CSC-TPDC或H-TPDC，随后在左侧胁部皮下（s.c）接种未分选的SCC7肿瘤细胞进行攻击。与PBS组相比，H-TPDC对肿瘤生长仅诱导了轻微的抗肿瘤免疫反应。然而，与对照组和H-TPDC组相比，接受CSC-TPDC处理的小鼠肿瘤生长受到显著抑制（p<0.05，图3）。这些结果表明，在诱导针对肿瘤细胞攻击的保护性免疫反应方面，CSC可作为比传统未分选肿瘤细胞更有效的抗原来源用于DC的抗原负载。
为了进一步理解所观察到的CSC诱导的保护性抗肿瘤免疫的机制，我们在实验结束时采集了接受DC疫苗免疫动物的脾脏。随后，脾细胞通过抗CD3/CD28/IL-2或抗CD3/CD28/IL-2联合LPS/抗CD40进行激活。然后收集培养上清液，检测细胞因子和抗体的表达。由接种D5 CSC-TPDC或SCC7 CSC-TPDC的动物获得的脾细胞产生更高水平的IFNγ和GM-CSF（图4）。此外，与接种D5 H-TPDC或SCC7 H-TPDC的动物相比，接种D5 CSC-TPDC或SCC7 CSC-TPDC的动物其经LPS/抗CD40激活的脾细胞产生的IgG显著更高（p<0.05）。这些抗体可分别结合D5和SCC7 CSC，并且在补体存在的情况下，此类结合可导致CSC裂解8。
图1. 在培养的以及新收获的中国台湾小鼠D5黑色素瘤和SCC7鳞状细胞肿瘤中均检测到ALDHFLUOR+/ALDHhigh细胞群。 使用50 mmol/L DEAB（一种特异性ALDH抑制剂）处理的肿瘤细胞作为阴性对照。
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图2. 基于树突状细胞的肿瘤干细胞疫苗的制备。 为制备CSC-TPDC和H-TPDC，分别使用ALDHhigh或未分选的肿瘤细胞裂解物对骨髓来源的树突状细胞进行致敏。
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图3. CSC裂解物脉冲DC（CSC-TPDC）疫苗可在体内诱导更有效的保护性抗肿瘤免疫反应 皮下 SCC7 肿瘤模型
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图4. 接受CSC-TPDC疫苗免疫的免疫健全宿主中产生更强的全身性细胞免疫应答。从小鼠体内分离脾细胞，这些小鼠分别接受了H-TPDC或CSC-TPDC疫苗免疫，并按所示方法进行激活。随后收集培养上清液，采用ELISA法检测细胞因子水平。
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讨论
免疫缺陷宿主（如SCID小鼠）由于缺乏适应性免疫系统，无法用于肿瘤干细胞（CSCs）的免疫学评估。本研究在免疫功能健全的宿主中评估了CSCs的免疫原性，该模型更接近患者实际情况。富集的CSCs具有免疫原性，将其裂解物负载于树突状细胞（DCs）作为疫苗时，相较于未筛选肿瘤细胞裂解物致敏的DCs，可诱导更强效的肿瘤保护性免疫反应。 从机制上讲，这种保护作用是通过选择性诱导产生针对CSC的抗体和T细胞而实现的8 以及I型细胞因子的产生， 例如 IFNγ 和 GM-CSF
目前大多数免疫疗法，包括基于树突状细胞的疫苗和过继性T细胞转移，均旨在靶向肿瘤分化抗原。而肿瘤干细胞（CSCs）可能不表达这些分化抗原，因此可能逃避免疫系统的靶向攻击。相比之下，专门针对肿瘤干细胞设计的疫苗有可能清除这类特殊的癌细胞群体，从而通过防止肿瘤复发和转移，提高疫苗的治疗效果。
在培养的肿瘤细胞和新鲜获取的肿瘤组织中，我们通过流式细胞术根据高醛脱氢酶活性鉴定出富含肿瘤干细胞的细胞群体。此类ALDH高 可通过流式分选分离细胞，用作抗原来源以刺激树突状细胞（DC），从而生成CSC-TPDCs。使用ALDH进行比较高 从培养的肿瘤细胞中分离的细胞 与 来自新鲜收获的肿瘤的实验结果显示，在诱导抗肿瘤干细胞免疫方面无显著差异8这些结果表明，无论是从培养的肿瘤细胞中分离的肿瘤干细胞，还是从新鲜获取的肿瘤组织中分离的肿瘤干细胞，均具有用于临床应用的潜力。
为了具有临床相关性，疫苗需要在治疗环境中进行评估。目前，这些实验正在我们实验室中进行。
披露
STEMCELL Technologies 已支持开放获取出版费用。
致谢
本工作由密歇根大学综合癌症中心设立的 Will 和 Jeanne Caldwell 研究基金资助，部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA82529 及 Gillson Longenbaugh 基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ALDH荧光检测试剂盒 | Stemcell Technologies | 1700 | |
| 小鼠IL-4 | Pepro Tech | 214-14 | |
| 小鼠GM-CSF | Pepro Tech | 315-03 | |
| 小鼠GM-CSF ELISA检测试剂盒 | BD Biosciences | 555167 | |
| OptiPrep密度梯度介质 | Sigma Aldrich | D1556 | |
| BD OptEIA TMB底物试剂套装 | BD Biosciences | 555214 | |
| 仪器 | |||
| BD FACS Aria细胞分选仪 | BD Biosciences | 336834 | |
| Kcjunior | Bio-Tek Instruments | 176058 |
参考文献
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