用于生物传感器应用的微流控芯片上捕获-环加成反应可逆固定小分子或多组分结构

摘要

我们介绍一种用于表面等离子体共振（SPR）研究中小分子和功能化纳米粒子组装体快速、可逆固定的实验方法，该方法结合了芯片上连续进行的生物正交环加成反应和抗体-抗原捕获技术。

摘要

用于生物传感器和微阵列应用的生物活性小分子快速表面固定化方法，若能精确控制其取向和固定密度，则具有重要价值。在本研究中，我们采用了一种高效的共价生物正交[4+2]环加成反应，该反应发生于 转录反式-环辛烯（TCO）和1,2,4,5-四嗪（Tz）用于实现TCO/Tz衍生分子的微流控固定化。我们在连续流动条件下利用表面等离子体共振（SPR）实时监测该过程。为了实现可逆固定化并扩展传感器表面的实验应用范围，我们将非共价的抗原-抗体捕获组分与环加成反应相结合。通过交替向传感器表面引入TCO或Tz官能团，可在同一传感器表面实现多次捕获-环加成过程，从而用于芯片上多种多组分结构的组装与相互作用研究。我们通过生物传感器芯片上的两个不同固定化实验展示该方法：一种是小分子AP1497与FK506结合蛋白12（FKBP12）的结合；另一种是将相同的小分子作为固定化复合物的一部分进行研究 原位-功能化纳米颗粒

引言

高效的偶联反应是将生物活性分子连接到表面的重要工具，可用于多种生物技术应用。近年来，反式-环辛烯（TCO）与1,2,4,5-四嗪（Tz）之间极快的生物正交[4+2]环加成反应已被用于标记细胞表面、亚细胞结构、抗体和纳米颗粒^1-7。本文中，我们将[4+2]环加成反应与抗原/抗体捕获（GST/抗-GST）相结合，用于芯片上多组分结构的可逆合成，并实时监测该过程，以进行表面等离子体共振（SPR）相互作用分析（图1）^8,9。值得注意的是，这种捕获-环加成策略可利用已建立的方案实现表面再生⁸。因此，现在可以构建稳定的传感器表面，并精确控制配体的方向和密度，适用于多种新型检测模式。利用该策略，我们展示了TCO/Tz衍生化小分子的固定化，并在多种缓冲条件下表征了环加成反应速率。我们以FKBP12与一种结合FKBP12的小分子AP1497之间的经典相互作用为例^10-12，验证了该捕获-环加成策略在小分子直接连接至固定化GST抗原或固定化纳米颗粒（NPs）时，仍能保持其与靶标相互作用的能力。

该方法具有多项优势。首先，现在可实现小分子在传感器芯片上的可逆固定。其次，通过反式环辛烯/四嗪（TCO/Tz）固定小分子，还可实现无标记的相互作用研究，逆转传统表面等离子体共振（SPR）研究的方向，从而为结合相互作用提供互补的视角。第三，该方法支持靶向纳米颗粒的微流控合成，并可立即评估其结合特性。这有望提高评估或筛选靶向纳米颗粒的效率，同时减少所需纳米颗粒的用量。^13-15 第四，该方法可在连续流动条件下实时测量生物正交环加成反应的动力学。最后，TCO/Tz固定化学在血清存在下具有良好的稳定性。综上所述，我们预期这一多功能方法将广泛促进稳定传感表面的构建，适用于多种与体外（in vitro）和体内（in vivo）细胞应用相关的微流控研究。

方案

1. GST与纳米颗粒（NP）偶联物的制备

1. 制备 GST-TCO：
   1. 将 8 μl TCO-NHS 溶液（50 mM，溶于 DMSO）加入 100 μl GST（1 mg/ml，溶于 PBS）中，在室温下振荡反应 1 小时。
   2. 使用 Zeba 脱盐离心柱去除过量试剂。收集含有 GST-TCO 偶联物的滤液，于 4 °C 保存备用。
2. 制备 GST-Tz：
   1. 将 6 μl Tz-NHS 溶液（25 mM，溶于 DMF）加入 75 μl GST（1 mg/ml，溶于 PBS）中，在室温下振荡反应 1 小时。
   2. 用 25 μl PBS 稀释反应混合物，并使用脱盐离心柱进行纯化。收集含有 GST-Tz 偶联物的滤液，于 4 °C 保存备用。
   注意：质谱分析（MALDI-TOF）显示，平均每分子 GST 上偶联了约 10 个 Tz 或 TCO 分子。
3. 制备 NP-TCO：
   1. 将 100 μl TCO-NHS 溶液（50 mM，溶于 DMSO）加入 150 μl 氨基化纳米颗粒（NP-NH₂，8.7 mg Fe/ml，溶于 PBS，铁核直径 3 nm，每个纳米颗粒约含 8,000 个铁原子）中，在室温下振荡反应 1 小时。
   2. 使用 NAP-10 柱以 PBS 缓冲液进行凝胶过滤，去除过量试剂，收集含有 NP-TCO 产物的有色条带。
   3. 使用离心过滤装置（100 k 截留分子量）将滤液浓缩至终体积约 150 μl。
   4. 向 NP-TCO 溶液中加入 50 μl 丁二酸酐溶液（0.1 M，溶于 DMSO），在室温下振荡反应 1 小时（酸酐与剩余的氨基反应生成末端羧基，以防止与葡聚糖表面发生非特异性相互作用）。
   5. 使用 NAP-10 柱以 PBS 洗脱，对 NP-TCO 产物进行纯化。将所得 NP-TCO 溶液于 4 °C 保存备用。

2. 表面准备

所有表面等离子共振实验均在Biacore T100仪器（GE Healthcare）上进行，温度为25 °C，使用CM5传感器芯片，并以PBS-P作为流动缓冲液，除非另有说明。实验的设置和数据分析采用仪器配套的Biacore Control和Evaluation软件。表面准备及芯片上捕获-环加成反应的监测将采用两种操作模式：应用向导模式和手动运行模式。方法构建模式将用于设置反向取向结合实验以及测定环加成反应速率。数据经过双重参考扣除，动力学分析采用1:1 Langmuir结合模型进行。

1. 使用胺偶联固定向导模板，选择在流通池1（参比）和流通池2（检测）上进行固定。修改胺偶联方法，通过注入0.4 M EDC与0.1 M NHS的1:1混合溶液，以10 μl/min的流速持续480秒，以活化表面羧基。设置乙醇胺注入步骤，以淬灭剩余的活化酯，接触时间为420秒，流速为10 μl/min。
2. 输入配体名称：抗GST抗体（18 μg/ml，溶于pH 5.0的乙酸盐缓冲液），设定注入接触时间为420秒，流速为10 μl/min。
3. 将所需溶液瓶放入试剂架2中，并确保其位置与内容列表一致。保存并启动固定化程序。
   注意：以该方式运行固定化向导，可获得约14,000至17,000 RU范围内的抗GST抗体固定水平。
4. 编辑固定化向导，仅对参比流通池1注入GST配体溶液（20 μg/ml），流速为5 μl/min，持续420秒。

3. 监测芯片上功能化分子的捕获-环加成反应

1. 实时监测芯片上捕获-环加成反应（图 2）。
   1. 将 GST-TCO（20 μg/ml）、Tz-BnNH₂（10 μM）和再生液（10 mM 甘氨酸，pH = 2.0）溶液瓶放入试剂架 2 中。选择仪器手动运行方法，设置流速为 5 μl/min，流路为流通池 2。
   2. 注入 GST-TCO 溶液 420 秒。
   3. 注入 Tz-BnNH₂ 溶液 600 秒。
   4. 用再生溶液进行两次 30 秒的注入，以再生表面。
2. 实时监测芯片上多组分结构的组装（图 3）：
   1. 将 GST-Tz（20 μg/ml）、NP-TCO（100 μg Fe/ml）、Tz-BnNH₂（10 μM）和再生液（10 mM 甘氨酸，pH = 2.0）溶液瓶放入试剂架 2 中。选择仪器手动运行方法，设置流速为 5 μl/min，流路为流通池 2。
   2. 注入 GST-Tz 溶液 60 秒。
   3. 注入 NP-TCO 溶液 60 秒。
   4. 注入 Tz-BnNH₂ 溶液 60 秒。
   5. 用再生溶液进行两次 30 秒的注入，以再生表面。

4. 监测固定化密度及叠氮化反应速率的测定

1. 小分子环加成反应速率的表征（图 4）。
   1. 选择新方法并输入常规参数。在“实验步骤”面板中创建新步骤，并将其命名为“Sample”。将“Purpose”和“Connect base”设置为“Sample”。
   2. 在“Cycle Types”面板中创建新的循环步骤，并插入以下命令：Capture、Sample、Regeneration 1 和 Regeneration 2。
   3. 选择“Capture”命令；输入配体名称（GST-TCO，20 μg/ml），接触时间为 120 秒，流速为 5 μl/min，并将流路设置为：Second。选择“Sample”命令；输入接触时间 180 秒，解离时间 60 秒，流速 30 μl/min，并将流路设置为：Both。选择“Regeneration 1”命令；输入再生溶液名称（10 mM glycine-HCl pH 2.0），接触时间 30 秒，流速 30 μl/min，并将流路设置为：Second。对“Regeneration 2”命令重复相同设置。
   4. 选择“Setup Run”，并将流路设置为：2-1。点击“Next”，在样品列表中填入分析物溶液（Tz-BnNH₂）及其浓度梯度（0.3–10 μM，1:2 稀释）。点击“Next”进入样品板位置面板。将溶液瓶置于试剂架 2 中，稀释系列置于 96 孔板中，确保位置与内容列表一致。保存方法模板并开始结合实验。结合数据与动力学分析结果如 图 4 所示。
2. 纳米颗粒（NP）环加成反应速率的表征（图 4）。
   1. 打开上述保存的方法模板，并更改以下参数。选择“Capture”面板；将配体名称更改为 GST-Tz，20 μg/ml。选择“Sample”面板；将接触时间更改为 120 秒，解离时间更改为 120 秒。
   2. 选择样品列表；将分析物更改为 NP-TCO，浓度梯度为（7 至 224 nM，1:2 稀释）。将溶液瓶置于试剂架 2 中，稀释系列置于 96 孔板中，确保位置与内容列表一致。保存方法模板并开始结合实验。结合数据与动力学分析结果如 图 4 所示。

5. 测定FKBP12与固定化AP1497的结合

反向结合研究采用FKBP12作为分析物，化合物AP1497作为固定化配体（图5）。该检测的一般方法通过方法构建工具按如下步骤设置：

1. 选择新方法并输入常规参数。在检测步骤面板中创建并命名捕获（Capture）、样品（Sample）和再生（Regeneration）步骤。选择相应的用途（Purpose）和连接基础（Connect base）设置。
2. 选择循环类型（Cycle Types）面板，并创建三个循环步骤：捕获、样品和再生。
3. 在捕获循环步骤下插入两次捕获（Capture）命令。选择捕获1（Capture 1）面板，将捕获溶液设为变量，接触时间为300秒，流速为5 μl/min，流路设为：Second。选择捕获2（Capture 2）面板，将捕获溶液设为变量，接触时间为250秒，流速为5 μl/min，流路设为：Second。
4. 在样品循环步骤下插入样品（Sample）命令。选择样品（Sample）面板，设置接触时间为60秒，解离时间为200秒，流速为30 μl/min，流路设为：Both。
5. 在再生循环步骤下插入再生（Regeneration）命令两次。选择再生1（Regeneration 1）面板，输入再生溶液名称（10 mM glycine-HCl pH 2.0），接触时间为30秒，流速为30 μl/min，流路设为：Second。对再生2（Regeneration 2）面板重复相同设置。
6. 选择运行设置（Setup Run），将流路设为：2-1。点击下一步，输入捕获溶液名称（GST-TCO 和 AP1497-Tz）、样品名称（FKBP12）、浓度梯度（0.020 至 5 μg/ml，1:2 稀释）和分子量（MW，13,000）。将溶液瓶置于试剂架2中，将稀释系列置于96孔板中，并确保位置与内容列表一致。保存方法模板并开始结合检测。动力学分析数据见图5。

6. 测定FKBP12与固定化纳米颗粒上连接的AP1497的结合

使用方法构建工具建立纳米颗粒固定、小分子衍生化及FKBP12结合实验的通用方法如下：

1. 打开上方保存的方法模板并进行修改。在捕获循环步骤下插入一个额外的捕获命令。选择捕获1面板；取消选中捕获溶液为变量，并将捕获溶液1命名为（GST-Tz）。设置接触时间为60秒，流速为5 μl/min，流路设为第二通道。选择捕获2面板；取消选中捕获溶液为变量，并将捕获溶液2命名为（NP-TCO）。设置接触时间为90秒，流速为5 μl/min，流路设为第二通道。选择捕获3面板；取消选中捕获溶液为变量，并将捕获溶液3命名为（AP1497-Tz）。设置接触时间为180秒，流速为5 μl/min，流路设为第二通道。
2. 选择设置运行，并将流路设置为：2-1。连续点击“下一步”两次。将试剂瓶放入2号试剂架，将稀释系列样品放入96孔板中，并确保其位置与内容列表一致。保存方法模板并开始结合分析实验。动力学分析数据如图5所示。

结果

数据和图表已根据参考文献8进行调整。

高效且可逆地固定具有生物活性的小分子，并对其取向和密度进行精确控制，在新型生物传感器应用的开发中起着关键作用。利用TCO与Tz之间快速的生物正交反应，我们描述了一种逐步组装并再生配体表面的方法，同时保持其生物活性。图2展示了Tz-BnNH₂固定过程的实时监测。将GST-TCO溶液注入预先固定了抗GST抗体的表面，导致响应值上升约400 RU；随后注入Tz-BnNH₂，响应值迅速上升约15 RU。切换至运行缓冲液后，未观察到衍生化抗原的解离，表明结构具有良好的稳定性。在循环的最后一步对表面进行再生，从而实现多次捕获-环加成循环。采用该方法并将Tz-BnNH₂替换为AP1497-Tz分子，可构建用于与其靶标FKBP12相互作用研究的生物活性表面（图5）。通过破坏抗体/抗原之间的相互作用（如图2所示），可使抗GST表面再生，进而构建新的分子组装结构。在此情况下，先注入GST-Tz（...

讨论

此处所述的捕获-环加成方法可实现修饰纳米颗粒及小分子的快速、可逆固定化，适用于无标记芯片上的相互作用与动力学研究。该固定化方案可在数分钟内完成，仅需 <10 μM 浓度的小分子配体。通过调节配体浓度和接触时间，可精确控制固定化密度。我们的数据表明，芯片上的生物正交反应能够保持 原位 功能化纳米颗粒或固定化小分子与其靶标相互作用。我们还表征了两种低分子量小分子（TCO 和 Tz）之间的双分子环加成反应速率。我们设想，类似的方法可用于测量和比较其他快速生物正交反应的反应速率。

可逆、连续流动的芯片上纳米颗粒固定化及原位功能化方法，可在同一实验中快速获得多种经修饰的纳米颗粒，用于筛选和相互作用分析^13-15。与传统的纳米颗粒合成方法相比（后者需要分别进行纯化、固定化和筛选等步骤），该方法显著减少了生物材料、溶剂和试剂的用量，同时降低了与纳米颗粒使用和处置相关的环境问题¹⁶。重要的是，纳米颗粒功能化反应对细胞培养实验中常用的血清浓度具有良好的耐受性，甚至能耐受极高的血清浓度。这一特性有助于在血清存在条件下（血清可能影响纳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
传感器芯片 CM5	GE Healthcare	BR-1005-30
胺偶联试剂盒	GE Healthcare	BR-1000-50
GST 捕获试剂盒	GE Healthcare	BR-1002-23
NAP-10 柱	GE Healthcare	17-0854-01
GST，以 1X PBS 冻干	Genscript	Z02039	1 mg/ml
rhFKBP12	R&D Systems	3777-FK
表面活性剂 P-20	GE Healthcare	BR-1000-54
甘氨酸 2.0	GE Healthcare	BR-1003-55
Zeba 旋转脱盐柱	Thermo	89882	7 K MWCO
Amicon Ultra 4	Fisher	UFC810096	100 K 离心滤膜
TCO-OH	Ref. 8		实验室自制
TCO-NHS	Ref. 8		实验室自制，*可从 Click Chemistry Tools 购得 #1016-25
Tz-BnNH2	Ref. 8		实验室自制
Tz-NHS	Ref. 8	764701	实验室自制，*可从 Sigma Aldrich 购得 #764701
NP-NH2 = CLIO-NH2	Ref. 8		实验室自制
AP1497, AP1497-Tz	Ref. 8		实验室自制
设备
表面等离子共振生物传感器（SPR Biosensor）	GE Healthcare	Biacore T100