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利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

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DOI：

10.3791/50930

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2014年4月2日

 ,  ,  , 
1Institute of Laboratory Animal Science, University of Zurich, 2Department of Genetics, Cell Biology & Development and Center for Genome Engineering, University of Minnesota

本文内容

摘要

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。

摘要

携带位点特异性基因组修饰（基因敲除、基因敲入）的转基因小鼠对于解析复杂的生物系统以及模拟人类疾病和测试治疗策略具有至关重要的意义。近年来，借助设计核酸酶（如锌指核酸酶 ZFNs、转录激活因子样效应物核酸酶 TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统进行位点特异性基因组编辑的技术取得进展，使得几乎在任何实验室物种中均可快速实现靶向基因组修饰，而无需依赖胚胎干细胞（ES 细胞）技术。基因组编辑实验通常首先在目标基因内确定设计核酸酶的作用靶位点，随后构建定制的 DNA 结合结构域，以引导核酸酶活性至研究者指定的基因组位点。设计核酸酶质粒 体外 转录生成mRNA，用于受精小鼠卵母细胞的显微注射。本文中，我们提供了一种通过直接将TALEN mRNA注射到受精小鼠卵母细胞中以实现靶向基因组修饰的实验方案。

引言

小鼠是迄今为止构建转基因动物模型最常用的平台。近年来，基于设计核酸酶的基因组编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）1-3、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）4-6以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统7,8，进一步拓展了小鼠胚胎基因工程的工具箱9。ZFN 和 TALEN 均以成对方式发挥作用，各自包含两个定制设计的基于蛋白质的 DNA 结合结构域（分别为锌指蛋白阵列和可变重复二残基（RVD）），每个结构域均与 FokI 内切酶相连10-12。相反，Cas9 介导的 DNA 切割特异性则由转录激活的 CRISPR RNA（crRNA 和 tracrRNA，二者也可融合为一种称为向导 RNA 的嵌合 RNA 分子）11提供，这些 RNA 与 CRISPR 蛋白形成复合物共同发挥作用。

通过多种可选的组装策略，实验人员能够快速构建具有特定RVD序列的TALENs13-17。CRISPR/Cas9技术有望以更低的劳动强度实现定制核酸酶的构建，但向导RNA与DNA结合的特异性问题尚未完全解决18,19。迄今为止，定制ZFNs的制备仅限于少数专业学术实验室以及Sangamo Biosciences和Sigma CompoZr服务等商业供应商。

通常，利用设计核酸酶进行基因组编辑的目标是在特定基因组位点引入双链断裂（DSB），随后招募非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）DNA修复机制10,12。由NHEJ介导的DSB修复常在修复位点附近引入插入和缺失序列。因此，可通过在基因的蛋白质编码序列中引入移码突变，利用NHEJ修复来敲除目标基因的功能4,7,9。另一种策略是，将DNA供体与设计核酸酶共同引入，以实现遗传信息的特定添加或替换。DNA供体包含由与靶位点同源区域所侧翼包围的研究者设计的DNA序列，从而作为HR介导的DSB修复的模板。质粒5,6,20和单链寡核苷酸8,9,21 均已被成功用作供体。无论是通过NHEJ还是HR介导的基因组编辑，均无需将可筛选标记引入小鼠胚胎基因组，这使得这些策略特别适用于在不干扰整体遗传结构的前提下，实现核苷酸序列的微小修饰。

在本方案中，我们描述了利用TALENs对小鼠胚胎进行基因组编辑的全部关键步骤，包括：1）TALEN靶位点的确定22，2）通过黄金门克隆技术构建TALENs13, 3) 体外 TALEN mRNA的合成，4）将TALEN mRNA显微注射至受精小鼠卵母细胞，5）胚胎移植的手术操作，以及6）对 founder 动物中TALEN诱导的突变进行分析。我们重点介绍TALEN mRNA的显微注射以及针对NHEJ介导的插入/缺失对founder个体的筛选。为此，我们构建了双功能TALEN载体，该载体在以质粒形式转染时可实现哺乳动物细胞中的表达，并同时支持 体外 用于小鼠胚胎显微注射的 TALEN mRNA 的合成。这些构建体包含截短的 TALE 骨架23 融合至异源二聚体FokI结构域24,25 用于哺乳动物细胞中实现最佳基因组编辑。该方案也可适用于其他设计核酸酶的显微注射，或设计核酸酶与供体构建体的联合注射（DNA供体的设计已在Wefers发表的优秀技术文献中详细描述） 等26,27).

伦理声明

所有动物实验均按照苏黎世州州立兽医办公室的指南和规定进行。

方案

1. TALEN 靶位点的鉴定

  1. 访问 TAL 效应子核苷酸靶点设计工具 2.0 网站（http://tale-nt.cac.cornell.edu），并选择 “TALEN 靶点设计”。
  2. 输入目标基因的序列。如果使用 pCAG-T7-TALEN 表达载体（图 1C），请在 “使用预设结构” 下选择 “Miller et al., 2011”，以预测适用于该 TALEN 结构的最佳间隔区长度（15–20 bp）和 TALE RVD 数量（15–20）的靶点。
  3. 在 “G 替代” 项下选择 “NN”（针对鸟苷的 NH 型 RVD 也可使用，但目前尚未在 TALEN 组装中得到充分验证）。
  4. 可选：其他设置和选项请参考网站上的说明及其提供的链接。
  5. 系统将生成包含潜在靶点的文本文件，可导入电子表格程序以便更方便地查看。从中选择用于 Golden Gate 组装的 TALEN 配对。
  6. 可选：对将用于显微注射的小鼠品系中感兴趣的基因组区域进行测序，以检测公共数据库中可能未收录的单核苷酸多态性（SNPs），这些多态性可能影响核酸酶的结合。
  7. 可选：参见 表 3 获取其他与设计型核酸酶相关的在线资源。
  8. 构建 ZFN 和 TALEN 所需的大多数质粒均可从 Addgene 获取：
    http://www.addgene.org/special-collections/
    Golden Gate TALEN 试剂盒和哺乳动物 TALEN 表达载体的 Addgene 编号见 表 2。
    此外，也可向基因合成服务提供商订购特定功能模块，例如锌指结构域。

2. 黄金门 TALEN 组装

本部分描述了使用Cermak发表的方案组装TALENs的方法 等13 全长TALENs通过两个连续的Golden Gate克隆步骤构建（图1）。该方法允许将12至31个任意数量的RVDs插入最终的表达载体中。组装方案已适配用于生成mRNA的目的载体（图1C）在卵母细胞显微注射后表达高活性的TALENs。有关建立和维护质粒文库的详细信息，请参阅Golden Gate TALEN试剂盒的在线实验方案。http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/).

  1. 第1天 - 金门反应#1 - 将RVD阵列组装至pFUS载体中
    1. 可选：针对方案1中设计的每一对TALEN, 输入两个靶位点的DNA序列（包括起始的T，5'至3'方向）到 TALEN_Voytas_移液 使用电子表格为每个Golden Gate反应生成移液方案（同时输入所有用于组装的质粒浓度）。该电子表格还提供所有RVD的预期DNA序列，可用于2.5.2节中测序结果的比对。
    2. 针对方案1中设计的每一对独特的TALEN：
      如果 TALEN 长度为 12-21（标准），选择重复可变二核苷酸（RVDs）1-10及目的载体pFUS_A。选择剩余的RVDs及目的载体pFUS_B， 例如 对于具有15个RVD的TALEN（包括将在2.3.3节最终组装中添加的最后一个重复序列），选择RVDs 11-14和目的载体pFUS_B4（图1A).
      如果 TALEN 长度为 22-31，使用RVDs 1-10和目的载体pFUS_A30A。选择RVDs 11-20及目的载体pFUS_A30B。选取剩余的RVDs及一个pFUS_B目的载体， 例如 对于具有24个RVD的TALEN，选择第21-23位RVD及目的载体pFUS_B3。
    3. 为每种 pFUS + RVD 组合分别设置 Golden Gate 反应 #1， 即 1-10号RVD与pFUS_A载体连接，其余RVD与相应的pFUS_B载体连接；对于RVD数量超过21个的TALEN，使用1-10号RVD与pFUS_A30A载体连接，11-20号RVD与pFUS_A30B载体连接，其余RVD与相应的pFUS_B载体连接。每种RVD载体使用150 ng，pFUS载体使用150 ng，BsaI 1 µl，T4 DNA连接酶1 µl，10x T4 DNA连接酶缓冲液2 µl，以及H₂O补足至总体积2O至20 µl总体积。（建议每次进行Golden Gate组装时使用新鲜分装的T4连接酶缓冲液，因为T4连接酶缓冲液反复冻融会降低反应效率。）
    4. 将Golden Gate反应置于热循环仪中。
      项目：
      37 °C 5 分钟
      16 °C 10 分钟
      10 个循环
      50 °C 5 分钟
      80 °C 5 min
    5. 加入1 µl 10 mM ATP和1 µl Plasmid-Safe核酸酶至每个反应体系中，37 °C孵育1小时。该处理可去除可能被克隆至目的载体中的线性不完全连接产物 体内 转化细菌中的同源重组
    6. 转化 E. coli 使用单独的连接反应（电转感受态或化学感受态） E. coli 可用于α-互补的菌株，如 XL1-Blue 或 DH5α，可用于此处及后续的转化实验。
    7. 在含有壮观霉素（50 µg/ml）、X-Gal 和 IPTG（各 40 µg/ml）的平板上涂布细菌，进行蓝白斑筛选。
  2. 第2天 - 验证pFUS-RVDs正确组装
    1. 使用引物 pCR8_F1 和 pCR8_R1 进行菌落 PCR（参见 表1 针对引物序列，从每块平板中筛选1-3个白色菌落。正确的pFUS-RVDs组装产物通常会显示一条对应于所克隆的所有RVD片段总长度的条带。例如 约1.1 kb（对应10个RVDs）以及一系列较小且条带较弱的“梯状”条带图1B).
      PCR程序：
      95 °C 3 min
      95 °C 30 秒
      55 °C 30 秒
      72 °C 1分45秒
      30-35 个循环
      72 °C 10 分钟
    2. 使用已确认的克隆接种过夜培养（2–5 ml LB 培养基，含 50 µg/ml 链霉素）。
  3. 第3天 - 黄金门连接反应 #2 - 将RVD阵列连接至TALEN表达载体
    1. 进行“小提”以分离 pFUS-RVD 组装产物（根据 RVD 数量，分别为 pFUS_A 和 pFUS_B，或 pFUS_A30A、pFUS_A30B 和 pFUS_B）。
    2. 可选：使用引物 pCR8_F1、pCR8_R1 对单个 pFUS 载体进行测序（参见 表1 关于引物序列，请参见相关说明）。也可对最终的TALEN构建体进行测序（第2.5.2节）；然而，对于较长的TALEN，使用Sanger测序可能无法获得所有RVD的完整读长。
    3. 为每个单体TALEN设置第二次Golden Gate反应。根据RVD序列设计，分别加入150 ng的每种pFUS载体以及150 ng的pLR-HD、pLR-NG、pLR-NI或pLR-NN（最后一个“半重复单元”），并针对左侧左TAL效应子核酸酶 使用 75 ng 的 pCAG-T7-TALEN-ELD-目的地和用于 右侧 TALEN 使用 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-目的地（或反之亦然）。加入1 µl Esp3I、1 µl T4 DNA连接酶、2 µl 10x T4 DNA连接酶缓冲液、H₂O2O至20 µl总体积。
    4. 将Golden Gate反应置于热循环仪中。
      项目：
      37 °C 5 分钟
      16 °C 10 分钟
      10 个循环
      37 °C 15 分钟
      80 °C 5 min
    5. 使用第2.3.4节中的反应进行转化 E. coli.
  4. 第4天 - TALEN正确组装的验证
    1. 从每个平板中挑取1-3个白色菌落，使用引物TAL_F1和TAL_R2进行菌落PCR筛选（参见 表1 （引物序列详见相关说明）。正确组装的 TALEN 应显示出一条 PCR 产物，其长度对应于所插入的 RVD 总数图1D，该条带有时难以检测，而“梯形效应”则是成功组装的可靠指标。
      PCR程序：
      95 °C 3 min
      95 °C 30 秒
      55 °C 30 秒
      72 °C 3 分钟
      30-35 个循环
      72 °C 10 分钟
    2. 使用验证正确的克隆接种细菌过夜培养（2-5 ml LB 培养基，含 100 µg/ml 氨苄青霉素）。
  5. 第5天 - TALEN正确组装的验证
    1. 进行“小量提取”以分离 pCAG-T7-TALEN 质粒。
    2. 如果未在第2.3.2节中进行测序，则使用引物TAL_Seq_5-1和TAL_R2（参见 表1 用于引物序列）以确定全长 TALEN 中正确的 RVD 组装。

3. 核酸酶 mRNA 合成

  1. DNA模板的制备
    1. 制备高质量的 midi 或 maxiprep 级 pCAG-T7-TALEN 质粒，用于 mRNA 合成。
    2. 使用一种优先在核酸酶终止密码子下游且靠近该位点的限制性内切酶，将10 µg的TALEN或ZFN mRNA合成质粒线性化（对于pCAG-T7-TALEN载体，使用 SacImRNA合成质粒通常在核酸酶编码序列的上游包含T7或SP6噬菌体启动子。
    3. 在0.7-1%琼脂糖凝胶上电泳200-500 ng酶切质粒，以检测酶切是否完全。
    4. 在室温下，用0.1倍体积的乙酸钠和3倍体积的乙醇沉淀DNA，1小时后通过离心去除质粒消化液中的盐分。在14,000 × g或更高条件下离心10分钟以沉淀DNA，用200 µl 70%乙醇洗涤沉淀，再离心5分钟，弃去乙醇，将沉淀空气干燥后溶于适量无RNase的水中。也可使用基于离心柱的系统纯化线性化质粒。 例如 QIAquick PCR 纯化试剂盒
    5. 测定线性模板的浓度，并取 1 µg 用于后续反应体系的建立 体外 转录
  2. mRNA合成与多聚腺苷酸化
    1. 对于 体外 使用mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra试剂盒进行pCAG-T7-TALEN质粒的体外转录。将每个TALEN的转录反应体系置于冰上配制：加入无核酸酶水至终体积20 µl，10 µl T7 2x NTP/ARCA，2 µl 10x T7反应缓冲液，1 µg DNA模板，2 µl T7酶混合物。混匀反应体系后，在37 °C孵育1–2小时。
    2. 在冰上使用完整的20 µl转录反应混合物配制多聚腺苷酸化反应：36 µl无核酸酶水、20 µl 5x EPAP缓冲液、10 µl 25 mM MnCl₂、10 µl 10 mM ATP。混匀后，取出2.5 µl反应混合物作为对照样品 L1 和 R1 （分别对应左侧和右侧核酸酶）。加入4 µl E-PAP酶，于37 °C孵育反应45–60分钟。另取2.5 µl反应混合物作为对照样品 L2 和 R2.
  3. mRNA纯化
    1. 使用 NucAway 离心柱进行 mRNA 纯化（缓冲液置换及未掺入核苷酸的去除）。轻敲柱子，使干燥凝胶沉降至柱底。用 650 µl 无 RNA 酶的显微注射缓冲液（1 mM Tris-Cl，0.1 mM EDTA，pH 7.5）水化柱子。盖紧盖子，涡旋混匀，轻敲以去除气泡，并在室温下水化 5–15 分钟。
    2. 将柱子放入收集管中，在 750 × g、4 °C 条件下离心 2 分钟，以去除多余的间质液。弃去收集管，将柱子置于 1.5 ml 洗脱管中。
    3. 将3.2.2节中的完整反应混合物加入柱中，在750 × g、4 °C条件下离心2分钟。核酸酶mRNA现应溶解于显微注射缓冲液中。取出2.5 µl纯化后的样品 L3 和 R3.
    4. 将 mRNA 储存于 -80 °C，直至制备显微注射分装样品。
  4. mRNA 凝胶电泳
    1. 使用10% SDS溶液或RNaseZAP清洁凝胶电泳槽，以去除RNase污染。
    2. 在1×TBE电泳缓冲液中制备1%琼脂糖凝胶。
    3. 混合每个RNA样本 L1/R1, L2/R2, L3/R3 加入3体积的NorthernMax甲醛上样缓冲液，65 °C孵育15分钟。
    4. 上样 RNA 样品及 RNA 分子量标记物（RNA size ladder）例如 在凝胶上使用RNA Millennium大小标记，在1x TBE缓冲液中以10 V/cm的电压电泳，直至加样染料迁移至凝胶末端。
    5. 使用SYBR Green溶液（Invitrogen）在室温下振荡染色30-60分钟。
    6. 成像凝胶并比较 L1/R1 与 L2/R2 和 L3/R3 的条带大小。样品 L2/R2 和 L3/R3 应显示出较 L1/R1 增大的条带，表明在（图2).
    7. 使用分光光度计测定 mRNA 浓度。
    8. 将左侧核酸酶和右侧核酸酶的mRNA按1:1比例混合，制备用于显微注射的mRNA分装样品。建议用显微注射缓冲液稀释，配制总浓度为200 ng/µl（每种核酸酶各100 ng/µl）的分装样品。将mRNA分装样品储存于-80 °C。

4. 胚胎分离与显微注射

  1. 胚胎分离该方案已成功应用于C57BL/6J和BDF1品系，也很可能适用于其他常用于显微注射实验的小鼠品系，如FVB或CBF1。小鼠饲养于温度和湿度受控的环境中，采用12小时光照-12小时黑暗循环，自由供应食物和水 随意摄取.
    1. 通过超数排卵处理供体雌性小鼠以增加胚胎产量。对16只4周龄雌性小鼠进行腹腔（i.p.）注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48小时后再次进行腹腔注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
    2. 将16只经超数排卵处理的雌性小鼠在hCG注射后立即与16只适配年龄（2–8个月）的雄性小鼠进行交配。
    3. 使用经批准的安乐死方案（如CO₂）处死雌性动物2 吸入
    4. 回收受精卵母细胞。于次日上午从输卵管中收集卵母细胞，随后将卵母细胞置于含0.1%牛透明质酸酶的M2培养基中处理3–5分钟，以去除残留的卵丘细胞。根据交配效果和所用小鼠品系的不同，获得的胚胎数量可能有所差异。通常16只C57BL/6J雌鼠可获得150–250枚受精卵母细胞，而BDF1雌鼠则可获得300–400枚。
  2. 胚胎显微注射
    1. 注射核酸酶mRNA。原核期卵母细胞通常在下午早些时候进行注射。细胞质mRNA显微注射在矿物油下的M2培养基中进行，使用配备微分干涉差（Nomarski DIC）光学系统、20倍物镜的倒置显微镜，以及胚胎显微操作仪和注射装置。我们建议以10 ng/µl（总体积20 ng/µl）的浓度开始TALEN mRNA的注射。
    2. 用持卵毛细管吸住卵母细胞，将核酸酶mRNA注入胚胎细胞质中，避免接触原核。注射应较浅，靠近质膜进行。注射体积应保持较低，一旦出现细胞质膨胀的迹象，应立即撤出显微注射针。一次显微注射实验通常包括100至300个卵母细胞。通常情况下，至少应有80%至90%的胚胎在注射后存活，且未发生立即裂解。
    3. 显微注射后，将胚胎置于M16（Sigma）培养基中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。2 将存活的胚胎移植到假孕的代孕母体中。

5. 手术胚胎移植

  1. 在mRNA显微注射的前一天准备假孕胚胎受体（代孕母鼠）。选用3-6月龄、体质健壮的远交品系成熟雌鼠（如CD-1）作为代孕母鼠较为合适。通过在前一天将雌鼠与经手术或遗传学方法去势的雄鼠交配，以诱导假孕状态28。仅使用受精后0.5天（0.5 dpc）且具有明显交配栓的雌鼠作为胚胎移植受体。未使用的雌鼠假孕状态约3周后自然消失，因此可重复使用。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为120 mg/kg和16 mg/kg）对0.5 dpc的代孕母鼠进行麻醉。该麻醉配方可保证约30分钟的手术耐受时间，远超过预计5-10分钟的手术操作时间。
  3. 将麻醉后的动物俯卧位置于保温表面，并使用适当的消毒剂（如70%乙醇或氯己定与酒精混合液）对切口区域进行消毒。
  4. 用无菌剪刀在动物背部切开皮肤，并打开腹膜腔。
  5. 通过牵拉附着于卵巢的脂肪垫以暴露并外置子宫角。使用温热的0.9% NaCl溶液保持器官湿润。请注意，根据当地兽医规范，手术区域可能需要覆盖无菌敷料或进行剃毛处理。
  6. 使用动脉夹固定卵巢脂肪垫，以稳定生殖器官位置。
  7. 用钟表镊轻轻夹住壶腹部上游的输卵管，并用30 G皮下注射针头在输卵管壁上刺出一个小孔。
  8. 拔出针头后，将装有胚胎的细玻璃毛细管插入该小孔，通过轻轻吹气至毛细管持具的吹嘴，使胚胎被送入壶腹部。待胚胎完全注入壶腹部后，撤出毛细管，并将生殖器官复位至体腔内。
  9. 使用一系列无菌缝线（Prolene 6-0）缝合腹膜腔。
  10. 根据切口大小，使用1-2个伤口夹（Autoclip 9 mm）闭合皮肤。
  11. 术后将动物放回其原有笼具，并持续监护直至麻醉作用完全消退。
  12. 为尽量减少应激反应，应尽可能将小鼠饲养于稳定的社交群体中（每II型笼2-4只）。
  13. 术后在饮水中添加Dafalgan（对乙酰氨基酚，200 mg/kg体重）作为镇痛剂，连续给药3天。

6. 通过 PCR 和 T7 核酸酶或限制性酶切分析创始人个体

  1. 设计引物以扩增核酸酶结合位点周围 200-700 bp 的区域。正向引物与核酸酶间隔区之间、以及核酸酶间隔区与反向引物之间的距离应有明显差异，以便在琼脂糖凝胶电泳中可检测到两种不同的消化条带（示例见图 3和图 4）。
  2. 在优化条件下进行 PCR 扩增。通过琼脂糖凝胶检测 PCR 扩增产物的大小。
  3. 可选：纯化 PCR 产物，例如使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒去除 PCR 体系中的盐离子和核苷酸。许多限制性内切酶可在添加相应限制性内切酶缓冲液的 PCR 样品中直接发挥作用，因此无需纯化。我们亦成功在 QiagenTaq PCR 缓冲液中添加 NEBuffer 2 后，直接使用 T7 核酸内切酶进行检测。
    1. T7 核酸内切酶检测。将 17 µl PCR 产物与 2 µl NEBuffer 2 混合，并在热循环仪中运行异源双链形成程序（图 3b）：
      95 °C 2 min
      95 °C 至 85 °C（-2 °C/sec）
      85 °C 至 25 °C（-0.1 °C/sec）
      4 °C 保温。
      向每个样品中加入 1 µl T7 核酸内切酶，37 °C 孵育 20 分钟。（也可使用依赖于 CEL 1 核酸酶的 Surveyor 检测（Transgenomic），请参考生产商说明书。）
    2. PCR 产物的限制性酶切。将 17 µl PCR 产物与 2 µl 10× 限制性内切酶缓冲液及 1 µl 限制性内切酶混合。在适当温度下酶切 1 小时或更长时间。
  5. 向样品中加入 DNA 上样染料，并在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，以检测野生型动物与携带突变等位基因的 founder 个体之间的不同酶切图谱。预期结果参见图 3和图 4。
  6. 对检测出携带突变等位基因的 founder 个体的 PCR 产物进行克隆，并进行 Sanger 测序（例如通过 TA 克隆至 pGEM-T Easy 载体），或使用高通量测序技术直接对 PCR 产物混合物进行测序。

结果

我们构建了与Cermak发表的Golden Gate TALEN组装方法相兼容的载体质粒 等13 可在哺乳动物细胞中表达TALENs的 体外 T7噬菌体启动子介导的mRNA合成（图1C）。这些质粒携带异源二聚体FokI结构域（ELD或KKR突变），与FokI同源二聚体相比，已被证明可降低脱靶效应，并相较于第一代FokI异源二聚体增强切割活性25,29Golden Gate 连接反应 #1 和 #2 通常效率很高，经菌落 PCR 分析，每个白色菌落均显示出与所克隆的 RVD 数目相对应的预期条带模式图1B 和 1D).

凝胶分析 体外 合成的 mRNA图2应显示每份分析样品均有一条清晰可辨的条带，且条带弥散极少或无弥散。L1/R1 与 L2/R2、L3/R3 样品之间应出现明显的大小迁移，表明多聚腺苷酸化成功。

可通过基因分型PCR结合T7核酸内切酶消化（图3）或使用能切割核酸酶配对间隔区中野生型序列的限制性酶进行限制性消化（图4），对创始动物（founder animals）中由NHEJ诱导产生的突变等位基因进行筛选。T7核酸内切酶检测适用于所有类型的突变，不受所注射核酸酶配对间隔区特定基因组序列的影响；然而，该方法仅能检测异源双链PCR产物中DNA链之间的错配。因此，在极少数情况下，若某创始动物携带两个完全相同的突变等位基因，则PCR产物将不会显示出任何T7消化条带。相比之下，当核酸酶间隔区内部存在一个特定的限制性酶切位点，并且该位点会被NHEJ诱导的插入/缺失所破坏时，此类情况的区分始终是可行的（图5）。在此情况下，未被消化的条带表明突变的存在，而完全缺乏被消化的产物则强烈提示该创始动物在靶基因的两个等位基因上均携带突变（如图4b中标有星号的样本所示）。

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图1. 将TALEN RVDs通过黄金门克隆技术插入异源二聚体pCAG-T7-Destination载体. ARVD阵列组装至pFUS载体。此处示例展示了一对TALEN，其各自的TALE阵列分别包含15个RVD和17个RVD（对于RVD数量超过21个的TALE阵列，需要进行三次pFUS-RVD组装，未示出）。箭头表示用于pFUS载体特异性菌落PCR反应的引物。 B正确组装的 pFUS 载体经 PCR 扩增后，其产物通常显示一条与所克隆的所有 RVD 序列总长度相对应的条带例如 约1.1 kb（对应10个RVDs）以及 "梯状条带" 由于RVD阵列的重复性，出现较小且不明显的条带。 C) Final assembly of pFUS-RVD arrays and a plasmid containing the last repeat (pLR) into heterodimeric TALEN expression vectors with FokIELD and FokIKKR variants, respectively. The TALEN backbone (annotated as N and C) resembles the architecture published by Miller 等23 CAG（CMV早期增强子元件/鸡β-肌动蛋白）启动子可确保转染的哺乳动物细胞中高水平表达，而T7噬菌体启动子则允许 体外 mRNA合成（在核酸酶终止密码子下游使用SacI线性化载体）。 D使用箭头所示引物进行菌落PCR C）可用于鉴定正确组装的TALENs。全长PCR产物通常不够明显，而较短的产物则更为突出。 "梯度效应" 是组装成功的一个可靠指标。 单击此处以查看大图.

figure-results-2
图2. 核酸酶mRNA的质量控制 体外 使用琼脂糖凝胶电泳进行合成产物分析。 ZFN mRNA 以示例形式展示（L，左侧 ZFN；R，右侧 ZFN）。样本 L1/R1 显示聚腺苷酸化前的 mRNA，样本 L2/R2 显示聚腺苷酸化后的 mRNA，L3/R3 显示纯化的聚腺苷酸化 mRNA。 单击此处以查看大图.

figure-results-3
图3. 使用T7核酸内切酶检测法鉴定携带核酸酶诱导的靶位点突变的创始人动物的示例。A) 设计一对TALEN，用于切割小鼠朊病毒蛋白基因（Prnp）编码区内的特定位点（TALEN靶序列可根据要求提供）。使用位于TALEN切割位点上游110 bp处的正向引物（F）和下游250 bp处的反向引物（R）扩增得到PCR产物。B) 将PCR产物进行异源双链形成，并用T7核酸内切酶消化。C) 在单个创始人动物的靶向基因组区域中，若存在由TALEN诱导产生的突变，则电泳结果中除全长PCR产物外，还会出现大小分别为250 bp和110 bp的消化产物。点击此处查看高清图像。

figure-results-4
图4. 用于鉴定携带核酸酶诱导的靶位点突变的奠基者动物的PCR产物限制性酶切示例。 针对小鼠 Rosa26 位点的锌指核酸酶（ZFN）29 靶向内含子1中的一个XbaI限制性位点。A) 使用位于切割位点上游500 bp处的正向引物（F）和下游250 bp处的反向引物（R）通过基因分型PCR对奠基者动物进行筛选。B) 用XbaI酶切PCR产物，显示出不同的酶切模式：提示存在双等位基因突变的个体（以星号标记）、单等位基因突变的个体（出现酶切与未酶切条带，例如 动物2）以及野生型小鼠（完全酶切，例如 动物21）。C) 对可能存在双等位基因修饰的小鼠进行测序，结果显示最多存在3种（动物24）不同的插入/缺失变异。点击此处查看高清图像。

引物名称序列 5’ 至 3’
pCR8_F1ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1catcgcgcaatgcactgac

表1. 在Golden Gate TALEN组装流程中用于菌落PCR和测序的引物序列。

质粒/文库投稿人Addgene ID评论
Golden Gate TALEN和TAL效应子试剂盒2.0Voytas 实验室1000000024包含进行Golden Gate TALEN组装所需的所有质粒
pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD 目的载体Pelczar 实验室40131, 40132用于哺乳动物细胞中TALEN表达的附加型质粒 体外 mRNA合成

表2. 用于Golden Gate TALEN组装的质粒及质粒文库可从Addgene获取（www.addgene.org）。

在线资源备注
http://tale-nt.cac.cornell.eduTALEN 设计；TALEN 脱靶预测
http://zifit.partners.org/ZiFiT/TALEN、OPEN ZFN、CoDA ZFN、CRISPR/Cas9 设计
http://www.genome-engineering.orgTALEN、CRISPR/Cas9 设计；CRISPR/Cas9 脱靶预测
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.htmlTALEN 序列组装，用于测序结果验证
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html模块化组装 ZFN 设计
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab/segallabsoftware模块化组装 ZFN 设计

表3. 用于设计ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9的在线资源。

讨论

由设计核酸酶驱动的基因组编辑技术显著拓展了可进行基因组靶向修饰的物种范围10,12。在小鼠中，胚胎干细胞（ES细胞）的基因靶向技术已有二十多年的历史，已成为标准方法；然而，该技术在除小鼠以外的其他物种ES细胞中的应用一直存在困难，尽管近期在大鼠ES细胞中取得了一些进展。即使目前已有EUCOMM、KOMP或NorCOMM等联盟提供的“即用型”基因靶向小鼠ES细胞克隆3，利用ZFN和TALEN进行的基因组编辑仍能在可引入小鼠基因组的修饰类型方面提供更高的精确性和灵活性。携带核酸酶介导突变的创始人动物似乎具有很高的生殖系传递能力4-6,20,21，而通过囊胚注射ES细胞获得的嵌合体则并不总是具备这一特性。因此，在某些情况下，显微注射设计核酸酶可显著加快具有靶向基因组修饰的小鼠新品系的建立。

通过注射ZFN和TALEN成功产生基因敲除小鼠在很大程度上取决于所注射核酸酶对的活性。研究表明，TALEN在多种生物中靶向多种基因均具有较高的成功率；然而，最近的研究提示TALEN的结合对胞嘧啶甲基化敏感30,31。因此，新构建的核酸酶对（例如克隆至pCAG-T7载体中的TALEN）可瞬时转染入小鼠细胞系（如NIH-3T3或Neuro-2a），这些细胞系在一定程度上模拟了小鼠胚胎的染色质状态。在此类细胞中，可在进行mRNA合成和显微注射之前，采用T7核酸酶检测法或如第5节所述对PCR产物进行限制性酶切消化，以评估核酸酶活性。我们建议对用于显微注射实验的相应细胞系和小鼠品系中目标基因组区域进行测序。

在小鼠受精卵中，不同的TALEN或ZFN配对在不同的mRNA浓度下效果最佳，因此显微注射的核酸酶mRNA的最佳工作浓度可能需要通过实验来确定。根据核酸酶配对的不同，浓度过低将导致无切割效果，而浓度过高则可能导致胚胎致死。针对不同的核酸酶配对，我们已成功使用总mRNA浓度低至2 ng/µl、高至200 µg/µl的条件。这些效应难以从细胞培养实验中预测，因此需要通过经验确定既能保证胚胎存活又能实现靶位点有效修饰的核酸酶最佳浓度。

高活性的ZFN或TALEN可在显微注射胚胎的单细胞阶段之后切割其靶序列，从而在创始个体中导致复杂的诱变模式和嵌合现象。我们及其他研究者4已在单个创始个体中观察到三种或更多不同的突变等位基因（图5C）。因此，在利用这些创始个体建立新的小鼠品系时，应通过测序对后代进行仔细筛选，以确认是否存在理想的突变，因为消化实验仅能证明存在某种未明确的突变，而无法提供具体信息。

人们经常批评ZFN和TALEN系统的一个问题是，这些核酸酶可能还会切割基因组中其他与靶位点相似的序列。早期使用同源二聚体FokI结构域的试剂已观察到此类脱靶效应，为此设计了异源二聚体结构以减轻脱靶效应25。潜在的脱靶位点可在一定程度上通过in silico方法进行预测32,33，并利用PCR和测序进行筛选。相较于细胞系，使用ZFNs和TALENs构建小鼠模型的一个明显优势在于，可通过将后代与所选野生型品系进行多次回交，从而消除与目标基因组修饰无关的脱靶突变。在分析大量 founder 小鼠时，对核酸酶靶向位点以及in silico预测的脱靶位点扩增的PCR产物进行高通量深度测序，可能为PCR产物的酶切分析提供一种替代性的定性和定量检测手段。

本方案中描述的辅助生殖技术已针对常用于显微注射实验的标准小鼠品系（如 C57Bl/6J 或 B6D2F1）进行了优化。原则上，也可使用不同来源的小鼠，例如远交系小鼠，进行基因组编辑操作，这些品系可能为特定研究问题提供更合适的遗传背景。某些品系的辅助生殖技术（如超数排卵）效果已有预测依据34-36，但对于非标准品系，为获得足够数量的胚胎用于核酸酶显微注射，可能需要进一步优化相关技术条件。

除了ZFN和TALEN，目前还引入了新型设计核酸酶，例如RNA引导的CRISPR/Cas9系统9,37,38，用于基因组编辑应用。本文所述所有显微注射及创始人动物分析方法同样适用于CRISPR/Cas9以及未来的基因组编辑方式。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢Monika Tarnowska、Cornelia Albrecht和Ewa Skoczylas提供的出色技术协助。本研究由SNF Sinergia基金项目CRSI33-125073资助，资助对象为PP。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BsaINEBR0535S 或 L
Esp3IThermo ScientificER0451
T4 连接酶NEBM0202S 或 L
壮观霉素SigmaS0692-1ML
氨苄青霉素 SigmaA0166
X-GalSigmaB4252
IPTGSigmaI6758
Plasmid-Safe 核酸酶EpicentreE3101K
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27106
QIAGEN 质粒中量提取试剂盒Qiagen12143
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra 试剂盒InvitrogenAM1345
NucAway Spin 柱InvitrogenAM10070
RNaseZAPSigmaR2020-250ML
NorthernMax 甲醛上样染料InvitrogenAM8552
RNA Millennium 标记物InvitrogenAM7150
10x TBE 缓冲液Thermo ScientificB52
T7 核酸酶NEBM0302S 或 L
pGEM-T Easy 载体系统 IPromegaA3600
SYBR Green I 核酸凝胶染料InvitrogenS-7563
孕马's 血清促性腺激素 (PMSG)SigmaG4877
人绒毛膜促性腺激素 (hCG)SigmaCG5
M2 胚胎培养基SigmaM7167
M16 胚胎培养基SigmaM7292
矿物油（胚胎检测用）SigmaM8410
氯胺酮CentraVetKet 201
赛拉嗪Sigma Aldrich46995
仪器/工具
配备诺马尔斯基微分干涉差（DIC）光学系统的倒置显微镜（例如 Nikon Eclipse TE200）Nikon
显微操作仪（例如 Narishige NT88NF）Narishige
胚胎固定毛细管Sutter InstrumentsB100-75-10
胚胎注射毛细管NarishigeGD-1
毛细管拉制仪（例如 Sutter P97）Sutter Instruments
显微玻璃针加工仪（例如 Narishige MF-900）Narishige
Walton 皮肤剪刀FST14077-10
手术剪刀FST14041-10
手术探针FST10140-03
Reflex 伤口夹系统（9 mm）FST12031-09
Reflex 伤口夹（9 mm）FST12032-09
Dumont 5 号精细镊子FST11254-20
Moria 弯头镊子FST11370-31
Moria 精细镊子FST11399-80
Dietrich 蛙嘴夹FST18038-45
C57BL/6J 小鼠Jackson Labs品系编号 000664
CD-1 小鼠Charles River品系编号 000664

参考文献

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
  2. Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
  3. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  4. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  5. Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
  6. Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  10. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
  11. ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  12. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
  13. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
  14. Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
  15. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
  16. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
  17. Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
  18. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
  19. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  20. Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
  21. Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
  22. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  23. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
  24. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  25. Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
  26. Wefers, B., et al. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  27. Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  28. Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
  29. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
  30. Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
  31. Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
  32. Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
  33. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  34. Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
  35. Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
  36. Pease, S., Saunders, T. L. International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , Springer. (2011).
  37. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  38. Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).

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利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑
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