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利用锌指核酸酶制备载脂蛋白C-III基因敲除兔

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DOI：

10.3791/50957

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2013年11月18日

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1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Department of Molecular Pathology, University of Yamanashi

本文内容

摘要

基因靶向工具的最新进展使得制备基因敲除（KO）兔成为可能。在本研究中，我们利用锌指核酸酶（ZFN）成功构建了五种载脂蛋白（Apo）C-III基因敲除兔。该工作表明，ZFN是一种高效制备基因敲除兔的方法。

摘要

载脂蛋白（Apo）C-III（ApoCIII）存在于血浆乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）和高密度脂蛋白（HDL）的表面。已有研究证实，血浆中ApoCIII水平升高是心血管疾病（CVD）的一个风险因素。血浆ApoCIII水平升高常与胰岛素抵抗、肥胖和高甘油三酯血症相关。通过转基因小鼠模型（包括ApoCIII基因敲除（KO）小鼠）的研究，已获得了关于ApoCIII在脂质代谢和心血管疾病中作用的宝贵知识；然而，需要注意的是，小鼠的脂蛋白代谢在许多方面与人类存在差异。目前尚不清楚血浆ApoCIII水平升高是否具有直接致动脉粥样硬化作用。在本研究中，我们致力于建立ApoCIII基因敲除兔模型，基于兔可作为研究人类脂质代谢和动脉粥样硬化的合理模型的假设。我们设计了靶向兔ApoCIII基因的锌指核酸酶（ZFN）系统，并对其进行验证 体外 在胚胎显微注射前进行验证。将mRNA注射至35只兔原核期胚胎的细胞质中，并在囊胚阶段评估其突变率。在检测的16个囊胚中，靶位点的突变率达到令人满意的50%（8/16），支持使用Set 1 体内 实验。接下来，我们将Set 1 mRNA显微注射到145枚胚胎中，并将这些胚胎移植至7只受体兔。经过30天妊娠后，共产下21只仔兔，其中经PCR测序鉴定确认有5只为ApoCIII基因敲除（KO）兔。基因敲除动物率（#KO仔兔/总出生数）为23.8%。总体生产效率为3.4%（5只仔兔/145枚移植胚胎）。本研究结果表明，ZFN是一种高效制备基因敲除兔的方法。这些ApoCIII基因敲除兔是研究ApoCIII在脂质代谢中作用的新型资源。

引言

载脂蛋白C-III（ApoCIII）是一种小型O-糖基化分泌蛋白，主要在肝脏和肠道中合成。它存在于血浆乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）和高密度脂蛋白（HDL）的表面。ApoCIII已被公认为心血管疾病的危险因素1。遗传性ApoCIII缺乏的患者血浆甘油三酯（TG）水平较低，亚临床冠状动脉粥样硬化程度减轻2,3。相反，血浆ApoCIII水平升高通常与胰岛素抵抗、肥胖和高甘油三酯血症（HTG）相关4,5。

基因敲除（KO）是研究基因功能的有力手段。与在人类突变群体中的观察结果一致，在小鼠中敲除 ApoCIII 基因可导致血浆 TG 水平降低，并对餐后高甘油三酯血症（HTG）具有保护作用6ApoCIII 的这种积极作用似乎独立于载脂蛋白 E（ApoE），因为同时缺乏 ApoE 和 ApoCIII 的小鼠同样受到保护，免于餐后高脂血症的影响。7尽管这些ApoCIII基因敲除小鼠模型为了解ApoCIII在人体中的可能功能提供了宝贵信息，但需注意的是，小鼠的脂蛋白代谢在许多方面与人类存在差异。例如，小鼠缺乏血浆胆固醇酯转移蛋白（CETP），而该酶在人类极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）的转运过程中起着关键作用8因此，有必要建立合适的动物模型，以进一步理解ApoCIII的生理作用。 体内.

兔是一种经典的模式动物物种9-11。其妊娠期较短（30–31天），每胎产仔数较多（4–12只/窝），且可在室内设施中方便地饲养。与小鼠相比，兔在系统发育上更接近人类10。更重要的是，与人类相似而不同于小鼠，兔是富含低密度脂蛋白（LDL）的哺乳动物，并具有较高水平的胆固醇酯转运蛋白（CETP）10,12。此外，兔对高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化具有易感性，其病变特征与人类动脉粥样硬化相似13。基于上述原因，我们假设载脂蛋白CIII基因敲除（ApoCIII KO）兔可作为比小鼠更理想的模型，用于研究ApoCIII在人类脂质代谢和动脉粥样硬化中的作用。

基因靶向转基因（GTT）兔的制备一直存在挑战，主要原因是缺乏能够传递生殖系的胚胎干细胞（ESC），以及兔体细胞核移植（SCNT）效率极低。ESC是制备GTT小鼠的主要工具，而SCNT已成功用于缺乏生殖系传递能力ESC的物种中制备基因敲除（KO）动物，包括猪、绵羊和牛，但在兔中尚未成功。近年来，锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）14和RNA引导的内切酶（RGEN）15成为强大的基因组编辑工具。这些核酸酶被称为"分子剪刀"，可在多种物种的基因组中高效诱导双链断裂（DSB），从而导致靶基因功能失活，或用于在基因组特定位点整合DNA序列16。2011年，我们是最早采用ZFN技术的研究团队之一，通过该方法成功获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因敲除的猪体细胞，并利用这些细胞通过SCNT成功培育出PPARγ基因敲除猪17。同年，也有研究报道利用ZFN在兔中实现了高效的免疫球蛋白基因破坏和靶向替换18。

在本研究中，使用ZFN Set 1通过PCR测序确认成功制备了五只ApoCIII基因敲除兔（见图1流程图示意图）。这些动物是研究ApoCIII在脂质代谢中作用的新型资源。

方案

所有动物的饲养、护理和使用程序均经密歇根大学动物使用与护理委员会审查并批准。

1. ZFN 设计与筛选

  1. 提供目标基因的基因组序列信息（例如 将兔ApoCIII的ZFN序列提供给制造商。根据ZFN评分选择适用于实验的ZFN组合。

2. 兔胚胎采集

  1. 对性成熟（6-18个月龄）的新西兰白兔（NZW）雌兔进行超数排卵，采用皮下（s.c.）注射促卵泡激素（FSH），每日两次；前两次注射剂量为3 mg，随后两次为5 mg，最后两次为6 mg。
  2. 在首次注射FSH后72小时，静脉注射（i.v.）200 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）以诱导排卵。在注射hCG后立即用雄性兔与超排雌兔交配。
  3. 在人工授精后16-18小时 （p.s.i.），通过静脉注射戊巴比妥钠（150 mg/kg，i.v.）处死超排的供体兔。
  4. 通过仔细采集完整的输卵管及卵巢结构，取出输卵管壶腹部。
  5. 用10 ml含10%胎牛血清的HEPES缓冲TCM 199操作液冲洗每条输卵管，从输卵管的子宫端注入液体，并在卵巢端开口处将冲洗液收集至培养皿中。
  6. 在冲洗液中观察并鉴定回收的胚胎，将胚胎在操作液中洗涤三次，置于38.5 °C的空气中保温，并在体视显微镜下观察受精情况。在授精后19-21小时（p.s.i.）准备对原核期胚胎进行显微注射。

3. ZFN mRNA 的制备

  1. 将获得的mRNA在无RNase的0.1X TE（1 mM Tris-Cl pH 8.0，0.1 mM EDTA）中重悬前进行纯化。测定其浓度，并于-80°C保存，直至使用。
  2. 制备编码ZFN配对的mRNA（4–10 ng/μl，溶于pH 7.5的1 mM Tris-Cl、0.1 mM EDTA中），分装至10 μl的冻存管中。于-80 ºC保存，直至使用。显微注射前，将RNA冻存管解冻并置于冰上保存。

4. 胚胎显微注射

  1. 通过在已去除培养腔的1孔腔室载玻片上放置5 μl操作液滴，制备显微注射平台。用矿物油覆盖液滴，并将其置于加热的显微镜载物台上。
  2. 将持卵针（直径120 μm）插入显微操作臂的夹持器中，并将其定位至操作液滴内。
  3. 使用显微拉针仪加热并拉制硼硅酸盐玻璃毛细管，制备注射用微针。将待注射的mRNA加载至注射微针中。
  4. 打开连接至显微注射仪的压缩空气供应。
  5. 将注射微针插入注射夹持器，安装到显微操作臂上，并将其定位至操作液滴中。
  6. 设置显微注射仪，建议参数如下：持卵压力（holdP）= 2 p.s.i.，注射压力（InjP）= 20 p.s.i.，清洁压力（ClearP）= 60 p.s.i.，注射时间（Injtime）= 1秒，可实现每次注射体积为1–5 pl。
  7. 通过轻轻敲击持卵针以打开注射微针的尖端。
  8. 将胚胎（30–50枚）转移至平台上的显微操作液滴中。使用持卵针捕获一枚胚胎，并沿x轴方向对齐注射针、胚胎与持卵针。
  9. 在400倍放大倍数下，推进注射针穿过胚胎。注意避免刺入细胞核。一旦刺破质膜，即踩下脚踏开关进行注射。注射完成后，撤回注射针，释放胚胎。对所有剩余胚胎重复此过程。
  10. 用胚胎培养液将注射后的胚胎洗涤三次，培养液成分为Earle's平衡盐溶液（EBSS），添加非必需氨基酸（NEAA）、必需氨基酸（EAA）、1 mM L-谷氨酰胺、0.4 mM丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS）。
  11. 将胚胎在38.5 °C、5% CO2的空气环境中孵育1–2小时，随后通过手术将其移植至同步化的受体新西兰白兔（NZW）雌兔的输卵管中（见步骤5.1）。或者，将胚胎体外培养至囊胚阶段，用于后续的in vitro验证或检测分析。

5. 胚胎移植

  1. 选择一只健康、年龄在5至12个月之间、体重约为4.0至5.0 kg的新西兰白兔（NZW）雌兔作为受体动物。在供体动物注射hCG的同一时间点，对受体动物进行促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH）肌肉注射（i.m.，50 mcg/ml，0.3 ml/动物）（参见步骤2.2）。
  2. 完成显微注射后，准备受体兔进行胚胎移植（通常在GnRH注射后16-24小时）。通过肌肉注射给予10-40 mg/kg的氯胺酮（i.m.）和/或通过吸入2-4%的异氟烷气体进行麻醉。使用无菌眼膏保护兔子眼睛，防止过度干燥。持续观察动物直至其完全失去意识，i.e. 对足底反射无反应；通过挤压足垫检查是否缺乏足底反射，以判断麻醉是否充分。
  3. 剃除兔子腹部的毛发，先用消毒液清洗，再用消毒溶液处理，并用无菌纱布擦拭剃毛区域。
  4. 在无菌条件下进行手术，整个手术过程中约每15分钟记录一次受体兔的生命体征。
  5. 根据可获得的胚胎数量，将10-25枚胚胎移植至一只受体动物体内。
  6. 手术结束时，使用带涂层的可吸收缝线缝合肌肉层。皮肤缝合可采用可吸收缝线进行皮下连续缝合，或使用不可吸收缝线（e.g. 单股尼龙线或类似材料）进行间断缝合。
  7. 保持动物体温，密切监测直至其恢复胸卧位。
  8. 每日观察动物状况，按照兽医指导进行护理。如兽医判断必要，术后每日皮下注射美洛昔康（s.c. 1.0 mg/kg）以缓解疼痛和/或退热。
  9. 术后约10-14天拆除不可吸收的皮肤缝线。

6. ZFN 诱导基因破坏的检测

  1. 对于 体外 验证，进行基因分型分析 体外 培养的胚胎。将发育至桑葚胚/囊胚阶段的单个胚胎置于5 μl NP40溶液（含1% NP40和1 ug/ml蛋白酶K的Taq缓冲液）中，在55 °C裂解0.5–1小时，然后在95 °C处理10分钟。
  2. 对后代进行基因分型时，采集新生仔兔的耳部皮肤样本，提取基因组DNA，并将其作为PCR测序的模板。采样后在取样部位使用Kwik-Stop止血，以减少出血和不适。
  3. 使用步骤6.2或6.3获得的裂解液作为模板，采用LA-Taq DNA聚合酶及位于ZFN靶位点上游（5’- TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3’）和下游（5’-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3’）的PCR引物对进行PCR扩增。
  4. 纯化PCR产物，并使用测序引物（5’-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3’）进行测序。
  5. 通过在靶向位点附近的测序图谱中寻找双峰曲线来识别突变样本。将具有双峰曲线的样本标记为 "阳性".
  6. 克隆 "阳性" 将PCR产物连接至TA克隆载体，挑取10-20个克隆，对插入片段进行测序，并确认靶位点周围的突变情况。

结果

体外验证ZFN配对
最初设计了16对ZFN。Set 1的靶向破坏序列位于兔ApoCIII的第2外显子（图2A）。选取其中3对（Set 1、Set 2和Set 3，图2A），并通过酵母MEL-1报告基因检测法评估ZFN活性（图2B）。Set 1的ZFN活性得分为224.2%，高于Set 2（196.9%）和Set 3（177.8%），且远高于筛选阈值（即 内部阳性对照的50%）。因此选择Set 1进行体外验证实验。

特定组合需使胚胎中的阳性率达到10%或更高方可通过 体外 胚胎验证，依据内部验证标准进行。将第1组的mRNA（5 µg/ml）显微注射至35个兔原核期胚胎的细胞质中。图3A）。未进行显微注射处理的冲洗胚胎（n=31）作为对照组。显微注射组中有18枚胚胎在第5天发育至囊胚（BL）阶段，其中16枚进行了测序，获得8枚（BL#apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17） 图3B，红色下划线）在靶向位点（用黑框标出）显示出突变序列 图2B，第一行，apoC3wt.seq）。显微注射组的囊胚率（51.4%）低于对照组（77.4%），表明显微注射胚胎的发育潜能略有下降。显微注射胚胎的阳性突变率为50.0%（8/16），远高于筛选阈值即 10%）。这些结果表明，Set 1 是一组有效的ZFN，可在兔ApoCIII靶位点诱导突变。因此选择Set 1用于后续实验。 体内 ApoCIII基因敲除兔的制备

ApoCIII 基因敲除兔的制备
将 ZFN 第1组的 mRNA 显微注射至兔原核期胚胎的细胞质中，并将145枚显微注射后的胚胎移植到7只假孕受体兔体内（图4A）。作为对照组，将未经 ZFN 显微注射的新鲜冲出胚胎（n=75）移植至6只受体兔体内。妊娠30天后，显微注射组共出生21只仔兔。PCR 测序鉴定出其中5只为阳性基因敲除仔兔（apoC3-R1、R9、R11、R12 和 R16）（图4B）。以足月仔兔数与移植胚胎总数之比计算，实验组的足月率为14.5%（21/145），而对照组为29.3%（22/75）。以基因敲除仔兔数与足月仔兔总数之比计算，基因敲除率为23.8%（5/21）。其中1只基因敲除仔兔（apoC-R16）在出生后第5天死亡（20.0%，1/5）。靶位点处的插入缺失突变包括两个插入和三个缺失，分别为 Rabbits # R1、R9、R11、R12 和 R16 的 Δ1、+1、+1、Δ20 和 Δ21（图4B）。

生物信息学分析用于鉴定与Set 1序列存在7个或更少错配的潜在ZFN脱靶位点，方法如前所述17。仅预测到一个可能的脱靶位点，位于14号染色体上，具有7个错配的碱基对。PCR检测未在任何创始动物中发现脱靶事件。

讨论

在本研究中，利用ZFN技术成功构建了五只ApoCIII基因敲除兔。此前唯一一篇关于制备GTT兔的报道也采用了ZFN技术18。本研究结果证实，ZFN技术可有效用于靶向兔的基因编辑。

本研究中，转基因率（阳性仔兔数/总出生数）为23.8%（5/21），与此前在兔子中使用ZFN技术的报道结果（30.8%，16/52）18相近，也与其他动物物种中使用ZFN技术所报道的结果相似，包括斑马鱼19、小鼠20、大鼠21和猪17。该比率实际上高于许多传统转基因兔制备研究中的比率，后者通常在5–20%之间。例如，Ding et al. 通过传统的DNA显微注射法培育ApoCIII转基因兔时，共出生54只仔兔，获得3只阳性 founder 个体（5.6%）22。

与先前的研究结果一致，靶位点的突变具有多样性，包括不同碱基数目的缺失或插入（在五只基因敲除兔中，缺失或插入的碱基数范围为1-21个）。根据创始动物的特异性序列信息预测，至少有四只即含有 Δ1、+1、+1 或 Δ20 突变的个体可能丧失 ApoCIII 功能。动物 R-16 携带 Δ21 突变，可能不会表现出功能丧失，因为该突变预计仅导致七个氨基酸缺失，而不会引起读码框移位。最终仍需通过表型检测来确定这些 Founder 动物是否真正表现出 ApoCIII 功能的缺失。

本研究中产生的五只基因敲除兔均未出现双等位基因修饰。有趣的是，此前关于ZFN兔的报道中也存在同样情况。相比之下，当将靶向α1,3-半乳糖基转移酶的ZFN应用于猪细胞时，单等位基因靶向频率为7%-46%，其中约三分之一的突变可一步实现双等位基因敲除23。与此一致的是，当TALEN应用于猪成纤维细胞时，在全部阳性克隆中约有15%-40%检测到双等位基因修饰14。本研究未能获得双等位基因敲除兔，可能提示核酸酶介导的基因靶向能力存在物种差异（i.e. 兔与猪之间）。然而更可能的原因是本项目产生的基因敲除兔数量相对较少。我们认为ZFN具备在兔中产生双等位基因突变的能力，这应被视为基于ZFN的基因靶向兔生产的另一潜在优势。仍需进一步实验以验证ZFN在兔中的这一能力。

综上所述，本研究证明基于ZFN的基因靶向技术在制备基因敲除兔方面是有效的。特别是，我们成功获得了5只ApoCIII基因敲除兔，转基因效率达到23.8%，结果令人满意。相较于相应的小鼠模型，这些动物被认为能更有效地揭示该蛋白在人类脂质代谢中的作用。我们预测，基于ZFN的基因靶向技术以及其他基于核酸酶的技术（如TALEN和RGEN）在非啮齿类动物中的应用将显著促进多种人类疾病新型动物模型的建立。

Gene editing process diagram using ZFN; microinjection, embryo validation, genotyping steps.
图1. 利用ZFN技术制备基因敲除兔的流程图使用ZFN技术生产基因敲除兔的第一步是选择目标基因。提供基因序列信息后，设计ZFN组合，并进行基于酵母的内部验证。在检查点1（CP-1）阶段，仅将通过内部验证（相对于内部阳性对照效率达到50%或更高）的ZFN组合提供给用户进行选择。若无任何组合通过CP-1，则可能需要提供额外的序列信息以设计有效的ZFN组合。 体外 胚胎验证用于确保所选的ZFN组合能够在目标位点诱导突变（CP-2）。只有通过CP-2验证的ZFN组合才能被使用。>突变率约为10% 体外 胚胎）。若在CP-2阶段失败，则需重新设计ZFN组合。将准备胚胎供体，并对原核期胚胎显微注射经验证的ZFN组合。显微注射后的胚胎将移植至同步化的胚胎受体中。经过约一个月的妊娠期后，对新生仔兔进行基因型鉴定（CP-3）。若所有新生仔兔均为阴性，则需进行额外的显微注射实验。假设实验过程中无失败，从项目启动至完成CP-2阶段需时2–3个月，从CP-2至CP-3阶段还需额外2–3个月。因此，利用ZFN技术可在4–6个月内获得基因敲除兔。 单击此处以查看大图.

Gene editing diagram with ZFN binding sites, exon structure, and activity scores analysis table.
图2. ZFN设计三组ZFN（ZFN第1组、第2组和第3组）被设计用于靶向兔ApoCIII基因的第1外显子或第2外显子上的不同序列 （A）. 所有三组均接受酵母MEL-1报告基因检测，以确定ZFN活性。根据制造商的操作规程，显示活性的ZFN >制造商内部阳性对照活性的50%被视为有效 体外 和 体内 基因组编辑实验。ZFN 活性在第1组为224.2%，第2组为196.9%，第3组为177.8% （B）因此，本研究选用了第一组。 单击此处以查看大图.

ZFN gene editing; mutation data table and sequence alignment; DNA analysis for research study.
图3. 体外 ZFN 胚胎验证。mRNA（5 μg/ml将第1组的)微量注射至35个处于原核期的兔胚胎的细胞质中 （A）未进行显微注射处理的冲洗胚胎（n=31）作为对照组。对照组的囊胚发育率为77.4%。显微注射组的囊胚率为51.4%。在进行PCR测序的16个囊胚中，有8个（50%）被鉴定为阳性，表明Set 1是一组有效的ZFN，可在靶位点诱导突变B，apoc3wt.seq，黑箱）的兔ApoCIII。含突变的BL包括BL#apoc-3、4、5、7、11、13、15和17（B，红色下划线）。其余BLs（#apoc-2、6、9、10、12、14和16）在靶向位点处无突变。 单击此处以查看大图.

锌指核酸酶（ZFN）基因编辑结果；胚胎移植表格及DNA序列分析图。
图4. ApoCIII基因敲除兔的制备。将145枚显微注射ZFN Set 1 mRNA的胚胎移植至7只假孕受体兔中(A)。作为对照组，将未进行ZFN显微注射的新鲜冲出胚胎（n=75）移植至6只受体兔中。实验组的分娩率（以出生幼兔总数/移植胚胎总数计算）为14.5%（21/145），而对照组为29.3%（22/75）(A)。在显微注射组出生的21只幼兔中，经PCR测序鉴定出5只（R1、R9、R11、R12和R16）为阳性基因敲除个体(B)。靶位点处的插入缺失突变包括两处插入（R9和R11均为+1）和三处缺失（R1、R12和R16分别为Δ1、Δ20、Δ21）。点击此处查看高清图像。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：HL105114、HL088391、NS066652 和 HL068878，授予 Y.E.C.），以及美国心脏协会（国家科学家发展项目 0835237N，授予 J.Z.）资助。Y.E.C. 获密歇根大学医学中心（UMMC）设立的弗雷德里克·许特韦尔冠心病医学讲席教授基金支持。本研究使用了由密歇根大学医学中心先进转化科学与治疗模型中心（CAMTraST）支持的核心服务设施。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APOC3-ZFNSigma AldrichCSTZFNY-1KT靶基因：APOC3，批号：12201118MN
mMESSAGE 试剂盒InvitrogenAM1344MmRNA 合成
MEGAclear 试剂盒 InvitrogenAM1908MmRNA 纯化
卵泡刺激素Bioniche Life SciencesFolltropin-V用于处理胚胎供体兔
人绒毛膜促性腺激素IntervetChorulon用于处理胚胎供体兔
促性腺激素释放激素ProspecbioHOR-255用于处理胚胎受体兔
Earle's 平衡盐溶液（EBSS） Thermo Fisher ScientificSH30029.02胚胎培养基础培养基
MEM（非必需氨基酸）Sigma AldrichM7145胚胎培养补充剂
BME 氨基酸溶液Sigma AldrichB6766胚胎培养补充剂
谷氨酰胺Gibco25030-149胚胎培养补充剂
丙酮酸钠 Gibco11360-070胚胎培养补充剂
胎牛血清Sigma Aldrich12003C胚胎培养补充剂
HEPES 缓冲 TCM 199 Gibco12350039胚胎操作培养基
培养箱EppendorfGalaxy 170胚胎培养设备
显微操作仪 EppendorfTransferMan NK 2胚胎操作设备
微量移液器拉制仪Sutter Instruments Inc.P-1000胚胎操作设备
显微注射仪 Tritech ResearchMINJ-D胚胎操作设备
硼硅酸盐玻璃毛细管 World Precision Instruments, Inc.TW100F-6胚胎操作耗材
Euthasol（戊巴比妥钠）Virbac AH, Inc.ANADA#200-071胚胎供体兔的安乐死

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