需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

7.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51114

⸱

2014年1月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

通讯作者： Priscille Brodin <priscille.brodin@inserm.fr>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌 在荧光标记的宿主内 使用自动化共聚焦显微镜观察细胞。

摘要

尽管已有治疗手段和疫苗，结核病（TB）仍然是全球最致命且传播最广泛的细菌感染之一。数十年来，耐多药和广泛耐药菌株的突然激增，对结核病的防控构成了严重威胁。因此，迫切需要鉴定出对结核病致病菌至关重要的新靶点和关键通路。 结核分枝杆菌 (Mtb）并寻找可能成为结核病药物的新型化学物质。一种方法是设立 开发适用于大规模文库遗传学和化学筛选的方法，以实现从海量样本中寻找极少数目标的“大海捞针”式搜索。为此，我们建立了一种表型检测方法，依赖于荧光标记的检测 Mtb 在荧光标记的宿主内 使用自动化共聚焦显微镜对细胞进行成像。这 体外 检测方法可实现基于图像的定植过程量化分析 Mtb 进入宿主细胞，并针对384孔微孔板格式进行了优化，适用于siRNA、化学化合物或 Mtb 突变文库。随后对图像进行多参数分析处理，以获得读数 推断其发病机制 Mtb 在宿主细胞内。

引言

在近年来报告的新兴和再发传染性病原体中，Mycobacterium tuberculosis（Mtb）尤为突出，2011年造成140万人死亡和870万例新感染病例（《2012年全球结核病报告》，www.who.int/topics/tuberculosis/en/）。尽管已有多种药物联合疗法，但感染人数仍在持续上升，耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）的Mtb正在全球迅速传播1。此外，考虑到Mtb抗原的存在，全球约三分之一人口被认为处于Mtb潜伏感染状态。统计显示，每十例潜伏感染者中约有一例会发展为活动性结核病，并出现相应的临床症状2。因此，迫切需要开发新的手段来对抗Mtb。在此背景下，我们建立了一种体外可视化表型检测方法，通过自动共聚焦荧光显微镜监测Mtb侵入宿主 细胞及在其中增殖的过程3。将该检测方法适配于384孔微孔板，并结合自动图像采集与分析，实现了对中等规模化合物库、siRNA库及细菌突变体库的高内涵/高通量筛选（HC/HTS）。利用该表型检测方法对全基因组RNAi文库进行筛选，成功鉴定了参与Mtb在细胞内运输和复制的关键宿主因子，同时揭示了结核分枝杆菌所利用的宿主通路。该表型检测方法的另一项应用是鉴定对Mtb在吞噬体内存活至关重要的细菌因子。例如，吞噬体成熟受阻被认为是Mtb在巨噬细胞内存活和复制的主要机制之一。通过监测Mtb基因敲除突变体在荧光标记的酸性区室中的亚细胞定位，可鉴定出参与该存活过程的细菌基因4。最后，对Mtb进行高内涵成像也为量化药物抑制细胞内细菌生长等现象的效力提供了优良方法3。综上所述，此类高通量表型检测方法有助于加速抗结核药物的发现，而通过这些不同方法所获得的数据也有助于更深入理解Mtb对宿主的操控机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 高通量全基因组siRNA筛选

在表达绿色荧光蛋白（GFP）的结核分枝杆菌H37Rv感染人II型肺泡上皮细胞A549细胞系模型中进行的筛选。该流程如图1A所示。

  1. 将保存在母板（96孔板）中的干燥siRNA文库用1× siRNA缓冲液重悬，使其浓度达到4 μM，然后将10 μl该混合物转移至384孔子板（子板1）中。
  2. 在子板1中加入10 μl的1× siRNA缓冲液，使siRNA稀释2倍。siRNA重悬后，用可剥离铝封膜密封板子，可在-20 °C保存至少6个月，最长可达2-3年，但具体保存时间可能因siRNA文库生产商的建议而异。
  3. 将子板1中的siRNA稀释至子板2中，使终浓度为500 nM。siRNA重悬后，用可剥离铝封膜密封板子，可在-20 °C保存至少6个月，最长可达2-3年，但具体保存时间可能因siRNA文库生产商的建议而异。
  4. 使用前，将子板2在室温下解冻。
  5. 从子板2中取出2.5 μl siRNA，加入384孔检测板的相应孔中。
  6. 在步骤1.5所述的同一384孔检测板中，向各自的孔中分别加入2.5 μl阴性对照和阳性对照siRNA。
  7. 将转染试剂用1× D-PBS稀释，配制足够体积的溶液，使每孔加入0.1 μl转染试剂，并将稀释后的转染溶液在室温下预孵育5分钟。
  8. 向检测板的每个孔中加入7.5 μl转染试剂/PBS混合液，在室温下孵育30分钟。
  9. 向各孔中加入40 μl悬浮于RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清（FBS））中的A549细胞（1,500个细胞/孔）。在37 °C、含5% CO2的环境中培养3天。这些细胞每24小时分裂一次，因此转染后三天，每孔约有12,000个细胞。
  10. 取两周龄表达GFP的Mtb H37Rv培养物，用不含MgCl2和CaCl2的D-PBS洗涤，4,000 × g离心5分钟，弃去上清。重复此步骤3次。（GFP-Mtb H37Rv培养条件参见方案3）。
  11. 将菌体沉淀重悬于10 ml含10% FBS的RPMI 1640培养基中，室温静置1小时，使细菌聚集体沉降。
  12. 收集细菌上清液，使用酶标仪测定OD600（OD600应在0.6–0.8之间）和GFP荧光（RFU值），以确定细菌浓度。根据实验前在相同条件下制备的另一培养物所建立的RFU值 = f（CFU值）的参考回归曲线，计算悬液滴度。配制含2.4 × 106 个细菌/ml的菌悬液，相当于感染复数（MOI）为5。
  13. 移除384孔检测板中的培养基，加入25 μl新鲜配制的细菌悬液。
  14. 将384孔检测板置于37 °C、含5% CO2的环境中孵育5小时。
  15. 移除培养基，用含10% FBS的RPMI培养基轻柔洗涤细胞3次。
  16. 为杀灭残留的胞外细菌，加入含50 μg/ml阿米卡星的新鲜RPMI-FBS培养基50 μl，在37 °C、含5% CO2的环境中处理1小时。
  17. 移除含阿米卡星的培养基，加入50 μl含10% FBS的新鲜RPMI培养基。将384孔检测板置于37 °C、含5% CO2的环境中继续孵育5天。
  18. 成像前，加入10 μl新鲜配制的PBS中含30 μg/ml DAPI的溶液（终浓度为5 μg/ml），在37 °C孵育10分钟。
  19. 将板放入自动共聚焦显微镜中。
    光谱仪设置、激光配置、多波长激光参数、光学激发表。
    点击此处查看大图。
  20. 设置曝光参数。使用405 nm激发激光和450 nm发射滤光片记录DAPI荧光，使用488 nm激发激光和520 nm发射滤光片记录GFP荧光。
    显微镜实验设置、光源配置、激光激发、相机控制面板。
    点击此处查看大图。
    显微镜设置；显示光谱光源和相机控制的光学实验示意图。
    点击此处查看大图。
  21. 选择待采集的孔及每个孔中的视野，该设置称为布局和子布局参数。
    显微镜板布局设置；荧光研究中多孔实验的网格。
    点击此处查看大图。
    显微镜配置软件界面，用于设置图像视野和光学实验中的激光参数。
    点击此处查看大图。
  22. 根据步骤1.20和1.21的参数生成实验文件，并运行自动采集。
    显微镜实验设置示意图，自动显微分析的布局配置。
    点击此处查看大图。
    微孔板分析软件界面，显示数据网格和各孔的荧光显微图像。
    点击此处查看大图。
  23. 将图像传输至远程服务器。
    数据导入配置界面；软件设置、文件系统、导入选项、数据类型选择。
    点击此处查看大图。
  24. 使用图像分析软件评估图像。利用细胞核检测算法从DAPI通道检测细胞核，利用像素强度特性算法从GFP通道检测细菌区域（图4A）。

注意：本方案经过优化，用于研究基因沉默对胞内 Mtb 生长的影响。Mtb 是一种生长缓慢的细菌，在最佳条件下每 20 小时分裂一次。感染后 5 天内，若无细胞裂解发生，胞外 Mtb 的数量仍然较低，不会影响分析结果的质量。若需将本方案用于针对快速生长细菌（如 Mycobacteria smegmatis 和 Escherichia coli）的 siRNA 筛选，则必须对抗生素处理时间和孵育时长进行优化，因为这些细菌会大量释放并可感染新的细胞。

2. 高通量化合物筛选

对感染结核分枝杆菌H37Rv的宿主细胞进行筛选。该流程如图1B所示。

  1. 解冻含有溶于100% DMSO中的化合物文库的384孔母板。将0.5 μl化合物转移至含有10 μl添加10% FBS的RPMI 1640培养基的384孔子板中。
  2. 用不含MgCl2和CaCl2的D-PBS洗涤两周龄表达GFP的Mtb H37Rv菌液，4,000 × g离心5分钟，弃去上清。重复此步骤3次（GFP-Mtb H37Rv菌液培养条件参见方案3）。
  3. 将菌体沉淀重悬于10 ml添加10% FBS的RPMI 1640培养基中，室温静置1小时，使细菌聚集体沉降。
  4. 收集菌体上清液，使用酶标仪测定OD600（OD600应在0.6–0.8之间）和GFP荧光强度（RFU值）。根据实验前建立的RFU值 = f (CFU值) 的参考回归曲线，计算菌液滴度。典型浓度为1 × 108 个细菌/ml。
  5. 收获培养6天的人原代巨噬细胞，以4 × 105 个细胞/ml的密度悬浮于添加10%胎牛血清（FBS）和50 ng/ml重组人M-CSF的RPMI 1640培养基中（人外周血单核细胞分离及巨噬细胞分化参见方案4）。
  6. 将稀释后的原代细胞与不同感染复数（MOI）的分枝杆菌（MOI范围为1–5）在37 °C、90 rpm轻度振荡条件下共孵育2小时。
  7. 以350 × g离心洗涤感染细胞，去除胞外细菌。每次离心后，将沉淀重悬于添加10% FBS的RPMI 1640培养基中。重复此步骤2次。
  8. 将感染细胞重悬于添加10% FBS和50 μg/ml阿米卡星的RPMI 1640培养基中，37 °C轻度振荡孵育1小时。
  9. 以350 × g离心去除含阿米卡星的细胞培养基，并用添加10% FBS和50 ng/ml重组人M-CSF的完全RPMI 1640培养基洗涤感染细胞一次。
  10. 将40 μl感染巨噬细胞悬液加入步骤2.1中已含有10 μl化合物稀释液的同一检测板孔中。此时每孔中DMSO的终浓度达到1%。
  11. 将检测板置于含5% CO2的环境中，37 °C孵育5天。
  12. 使用细胞膜通透性远红荧光染料对活细胞进行染色。
  13. 将培养板放入自动共聚焦显微镜中。
    光谱仪设置、激光配置、多波长激光参数、光学激发表。
    点击此处查看大图。
  14. 设置曝光参数。使用640 nm激发激光和690 nm发射滤光片记录远红荧光，使用488 nm激发激光和520 nm发射滤光片记录GFP荧光。
    显微镜实验设置、光源配置、激光激发、相机控制面板。
    点击此处查看大图。
    显微镜设置；显示光谱光源和相机控制的光学实验示意图。
    点击此处查看大图。
  15. 选择待采集的孔及每孔中的视野，该设置称为布局（layout）和子布局（sublayout）参数。
    显微镜板布局设置；荧光研究中多孔实验的网格设置。
    点击此处查看大图。
    显微镜配置软件界面，用于设置成像视野和光学实验中的激光参数。
    点击此处查看大图。
  16. 根据步骤2.14和2.15的参数生成实验文件，并运行自动采集。
    显微镜实验设置示意图，自动显微分析的布局配置。
    点击此处查看大图。
    微孔板分析软件界面，显示数据网格和各孔的荧光显微图像。
    点击此处查看大图。
  17. 将图像传输至远程服务器。
    数据导入配置界面；软件设置、文件系统、导入选项、数据类型选择。
    点击此处查看大图。
  18. 使用图像分析软件评估图像。通过远红通道的像素强度属性算法检测细胞区域，通过GFP通道的像素强度属性算法检测细菌区域（图4B）。

注意：通过将化合物替换为表达荧光蛋白的突变株（每孔一种突变株）（图1C，另见 Brodin et al.4），本方案可适用于Mtb突变文库筛选。首先将荧光标记的突变株接种至孔板中（每孔20 μl细菌悬液）。然后加入30 μl细胞悬液回收细菌。在350 × g条件下离心1分钟后，将培养板置于含5% CO2的环境中37 °C孵育。孵育时间及感染复数（MOI）取决于具体实验类型。例如，为观察吞噬体酸化等早期细胞事件，可使用MOI为1–20的条件感染细胞2小时。使用2 μM Lysotracker染料在含5% CO2的环境中37 °C染色溶酶体1.5小时，随后用10%福尔马林或4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。最后通过共聚焦显微镜采集图像，并利用包含适当算法的图像分析脚本对溶酶体的检测与亚细胞定位进行分析4。

3. 表达绿色荧光蛋白的Mycobacterium tuberculosis H37Rv（GFP-H37Rv）培养条件

长期保存时，将GFP-H37Rv菌株在D-PBS中冷冻（每管约含1 x 108个分枝杆菌）。

  1. 将一管冻存的GFP-H37Rv菌种重悬于含有50 ml 7H9液体培养基的锥形瓶中，培养基中添加Middlebrook OADC营养添加剂10%、甘油0.5%、Tween-80 0.05%以及潮霉素B（50 μg/ml）。
  2. 在37 °C条件下培养8天。
  3. 测定GFP-H37Rv菌液在600 nm处的光密度（OD600）。
  4. 用新鲜的7H9液体培养基将GFP-H37Rv菌液稀释至OD600 = 0.1，培养基中添加Middlebrook OADC营养添加剂10%、甘油0.5%、Tween-80 0.05%以及潮霉素B（50 μg/ml）。
  5. 将稀释后的GFP-H37Rv菌液在37 °C继续培养8天，之后用于实验。

4. 从全血或血沉棕黄层制备物中纯化人外周血单核细胞

  1. 用含有1% FBS的1× D-PBS（不含MgCl2和CaCl2）将血袋稀释2倍。
  2. 通过Ficoll密度梯度离心法在400 × g条件下离心20分钟，分离单核细胞。
  3. 收集分离得到的单核细胞。
  4. 用含有1% FBS的1× D-PBS（不含MgCl2和CaCl2）在室温下以400 × g离心10分钟，洗涤单核细胞3次。
  5. 将细胞浓缩至最多1 × 107 个细胞/ml。
  6. 根据制造商说明书（见材料部分），使用CD14磁珠纯化单核细胞。
  7. CD14单核细胞纯化后，将细胞以1.5 × 106 个细胞/ml的密度接种于RPMI 1640培养基中，培养基中添加10% FBS和40 ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF），于37 °C、含5% CO2的环境中培养4天。
  8. 培养4天后，更换为新鲜的RPMI 1640培养基（含10% FBS和40 ng/ml hM-CSF），继续在37 °C、含5% CO2的环境中培养2天。
  9. 培养6天后，细胞可用于实验。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

高通量全基因组siRNA筛选

Mtb 能够定植于免疫细胞 体外 以及其他多种肺上皮细胞。例如， Mtb能够感染并损伤常用于模拟人类II型肺泡上皮细胞的A549上皮细胞5-7Dectin-1 被报道为参与宿主细胞识别的受体 Mtb A549细胞中对胞内分枝杆菌生长的摄取、促炎反应及抗菌作用8siRNA处理条件如方案1所述，基因沉默效率达85%（数据未显示）。使用siRNA沉默Dectin-1表达可导致A549细胞内分枝杆菌数量减少。事实上，在沉默3天并感染5天后，与转染非靶向乱序siRNA的细胞相比，Dectin-1沉默的A549细胞中感染细胞的比例降低了一半图2A 和 2B）。我们采用基于样本的标准化方法，将靶向 Dectin-1 的 siRNA 与乱序对照（scramble）进行比较，以计算 Z 值。如图所示 图2C，我们获得了针对 Dectin-1 的 siRNA 平均...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文描述了一种使用表达GFP的结核分枝杆菌（Mtb）H37Rv菌株感染荧光标记宿主细胞的表型检测方法，适用于高内涵/高通量筛选。该方案可广泛应用于多种化合物、荧光探针以及Mtb突变株。对于上述每种实验方案，均可在图像采集前进行固定和免疫荧光标记步骤。我们采用配备20倍（NA 0.70）或60倍（NA 1.2）水镜的自动荧光共聚焦显微镜进行图像采集。该共聚焦显微镜配备405、488、561和640 nm激发激光器，发射荧光通过三台相机及一组滤光片进行采集，检测波长范围为450–690 nm。需要注意的是，显微镜的激发和发射参数设置需根据各实验所用染料或荧光染料的类型进行调整。在表型检测中，通常使用DAPI或Hoechst以5 μg/ml 浓度染色10分钟以标记细胞核。此外，也可使用针对细胞质、细胞膜或细胞骨架特异性的其他荧光染料对细胞进行染色。图像采集后，应使用基于图像的分析软件对图像进行分析。应采用基于像素强度的细胞分割算法，分别确定细胞数量和胞内细菌区域面积（见图4）。所得数据应依据基于统计学的可接受标准进行评估，以验证该检测方法的稳健性和准确性。

...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

本工作的经费支持由欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB 项目编号 n° 260901，MM4TB 项目编号 n° 260872）、法国国家科研署（Agence Nationale de Recherche）、Feder（12001407（D-AL）Equipex Imaginex BioMed）以及北部-加来海峡大区。我们衷心感谢BICeL平台的Gaspard Deloison、Elizabeth Werkmeister、Antonino Bongiovanni和Frank Lafont提供的技术协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µclear-板 黑色，384孔Greiner Bio-One781091127.8/86/15 毫米，带盖，TC处理
CellCarrier 384孔板PerkinElmer6007550黑色，透明底，带盖，TC处理
V型底 白色，384孔板Greiner Bio-One781280 
透气密封膜，无菌Corning3345 
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150转染试剂
二甲基亚砜Sigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010细胞培养基
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco's 磷酸盐缓冲液
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco's 磷酸盐缓冲液
胎牛血清Life Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03用于外周血单核细胞纯化
CD14 MicroBeads，人源Miltenyi130-050-201CD14+ 单核细胞纯化
人 M-CSF，优质级（1000 μg）Miltenyi130-096-493巨噬细胞集落刺激因子
LS 柱Miltenyi130-042-401用于 CD14+ 单核细胞分离的柱子
吐温80Euromedex2002-A分枝杆菌培养
高纯度甘油 Euromedex50405-EX分枝杆菌培养
 Middlebrook OADC 增补剂Becton-Dickinson211886分枝杆菌培养
7H9Becton-DickinsonW1701P分枝杆菌培养
Versene 1xLife Technologies15040033非酶细胞解离液
DAPILife TechnologiesD1306细胞核染料
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570细胞核染料
Syto60Life TechnologiesS11342细胞核/细胞质染料
福尔马林Sigma-AldrichHT5014细胞固定液
靶向 Dectin-1 的 siRNASanta-Cruzsc-63276 
*siGenome* 非靶向 siRNA 混合物 DharmaconD-001206-14 
利福平Sigma-AldrichR3501抗生素
异烟肼（INH）Sigma-AldrichI3377-50G抗生素
潮霉素BLife Technologies10687-010抗生素
阿米卡星Sigma-AldrichA1774抗生素
自动化共聚焦显微镜 OPERAPerkinElmer图像采集
Columbus 2.3.1 服务器数据库PerkinElmer数据传输、存储与分析
Acapella 2.6 软件PerkinElmer基于图像的分析
GraphPad Prism5 软件GraphPad统计分析
Excel 2010Microsoft统计分析

参考文献

  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

细胞内分枝杆菌定量高通量筛选共聚焦显微镜表达GFP的分枝杆菌宿主细胞感染siRNA文库筛选化合物筛选自动化图像分析每细胞细菌面积剂量反应曲线
一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。