在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌 在荧光标记的宿主内 使用自动化共聚焦显微镜观察细胞。
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方法文章
一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管已有治疗手段和疫苗，结核病（TB）仍然是全球最致命且传播最广泛的细菌感染之一。数十年来，耐多药和广泛耐药菌株的突然激增，对结核病的防控构成了严重威胁。因此，迫切需要鉴定出对结核病致病菌至关重要的新靶点和关键通路。 结核分枝杆菌 (Mtb）并寻找可能成为结核病药物的新型化学物质。一种方法是设立 开发适用于大规模文库遗传学和化学筛选的方法，以实现从海量样本中寻找极少数目标的“大海捞针”式搜索。为此，我们建立了一种表型检测方法，依赖于荧光标记的检测 Mtb 在荧光标记的宿主内 使用自动化共聚焦显微镜对细胞进行成像。这 体外 检测方法可实现基于图像的定植过程量化分析 Mtb 进入宿主细胞，并针对384孔微孔板格式进行了优化，适用于siRNA、化学化合物或 Mtb 突变文库。随后对图像进行多参数分析处理，以获得读数 推断其发病机制 Mtb 在宿主细胞内。
引言
在近年来报告的新兴和再发传染性病原体中，Mycobacterium tuberculosis（Mtb）尤为突出，2011年造成140万人死亡和870万例新感染病例（《2012年全球结核病报告》，www.who.int/topics/tuberculosis/en/）。尽管已有多种药物联合疗法，但感染人数仍在持续上升，耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）的Mtb正在全球迅速传播1。此外，考虑到Mtb抗原的存在，全球约三分之一人口被认为处于Mtb潜伏感染状态。统计显示，每十例潜伏感染者中约有一例会发展为活动性结核病，并出现相应的临床症状2。因此，迫切需要开发新的手段来对抗Mtb。在此背景下，我们建立了一种体外可视化表型检测方法，通过自动共聚焦荧光显微镜监测Mtb侵入宿主 细胞及在其中增殖的过程3。将该检测方法适配于384孔微孔板，并结合自动图像采集与分析，实现了对中等规模化合物库、siRNA库及细菌突变体库的高内涵/高通量筛选（HC/HTS）。利用该表型检测方法对全基因组RNAi文库进行筛选，成功鉴定了参与Mtb在细胞内运输和复制的关键宿主因子，同时揭示了结核分枝杆菌所利用的宿主通路。该表型检测方法的另一项应用是鉴定对Mtb在吞噬体内存活至关重要的细菌因子。例如，吞噬体成熟受阻被认为是Mtb<....
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方案
1. 高通量全基因组siRNA筛选
在表达绿色荧光蛋白（GFP）的结核分枝杆菌H37Rv感染人II型肺泡上皮细胞A549细胞系模型中进行的筛选。该流程如图1A所示。
- 将保存在母板（96孔板）中的干燥siRNA文库用1× siRNA缓冲液重悬，使其浓度达到4 μM，然后将10 μl该混合物转移至384孔子板（子板1）中。
- 在子板1中加入10 μl的1× siRNA缓冲液，使siRNA稀释2倍。siRNA重悬后，用可剥离铝封膜密封板子，可在-20 °C保存至少6个月，最长可达2-3年，但具体保存时间可能因siRNA文库生产商的建议而异。
- 将子板1中的siRNA稀释至子板2中，使终浓度为500 nM。siRNA重悬后，用可剥离铝封膜密封板子，可在-20 °C保存至少6个月，最长可达2-3年，但具体保存时间可能因siRNA文库生产商的建议而异。
- 使用前，将子板2在室温下解冻。
- 从子板2中取出2.5 μl siRNA，加入384孔检测板的相应孔中。
- 在步骤1.5所述的同一384孔检测板中，向各自的孔中分别加入2.5 μl阴性对照和阳性对照siRNA。
- 将转染试剂用1× D-PBS稀释，配制足够体积的溶液，使每孔加入0.1 μl转染试剂，并将稀释后的转染溶液在室温下预孵育5分钟。
- 向检测板的每....
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结果
高通量全基因组siRNA筛选
Mtb 能够定植于免疫细胞 体外 以及其他多种肺上皮细胞。例如， Mtb能够感染并损伤常用于模拟人类II型肺泡上皮细胞的A549上皮细胞5-7Dectin-1 被报道为参与宿主细胞识别的受体 Mtb A549细胞中对胞内分枝杆菌生长的摄取、促炎反应及抗菌作用8siRNA处理条件如方案1所述，基因沉默效率达85%（数据未显示）。使用siRNA沉默Dectin-1表达可导致A549细胞内分枝杆菌数量减少。事实上，在沉默3天并感染5天后，与转染非靶向乱序siRNA的细胞相比，Dectin-1沉默的A549细胞中感染细胞的比例降低了一半图2A 和 2B）。我们采用基于样本的标准化方法，将靶向 Dectin-1 的 siRNA 与乱序对照（scramble）进行比较，以计算 Z 值。如图所示 图2C，我们获得了针对 Dectin-1 的 siRNA 平均.......
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讨论
本文描述了一种使用表达GFP的结核分枝杆菌（Mtb）H37Rv菌株感染荧光标记宿主细胞的表型检测方法，适用于高内涵/高通量筛选。该方案可广泛应用于多种化合物、荧光探针以及Mtb突变株。对于上述每种实验方案，均可在图像采集前进行固定和免疫荧光标记步骤。我们采用配备20倍（NA 0.70）或60倍（NA 1.2）水镜的自动荧光共聚焦显微镜进行图像采集。该共聚焦显微镜配备405、488、561和640 nm激发激光器，发射荧光通过三台相机及一组滤光片进行采集，检测波长范围为450–690 nm。需要注意的是，显微镜的激发和发射参数设置需根据各实验所用染料或荧光染料的类型进行调整。在表型检测中，通常使用DAPI或Hoechst以5 μg/ml 浓度染色10分钟以标记细胞核。此外，也可使用针对细胞质、细胞膜或细胞骨架特异性的其他荧光染料对细胞进行染色。图像采集后，应使用基于图像的分析软件对图像进行分析。应采用基于像素强度的细胞分割算法，分别确定细胞数量和胞内细菌区域面积（见图4）。所得数据应依据基于统计学的可接受标准进行评估，以验证该检测方法的稳健性和准确性。
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致谢
本工作的经费支持由欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB 项目编号 n° 260901，MM4TB 项目编号 n° 260872）、法国国家科研署（Agence Nationale de Recherche）、Feder（12001407（D-AL）Equipex Imaginex BioMed）以及北部-加来海峡大区。我们衷心感谢BICeL平台的Gaspard Deloison、Elizabeth Werkmeister、Antonino Bongiovanni和Frank Lafont提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µclear-板 黑色，384孔 | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 毫米，带盖，TC处理 |
| CellCarrier 384孔板 | PerkinElmer | 6007550 | 黑色，透明底，带盖，TC处理 |
| V型底 白色，384孔板 | Greiner Bio-One | 781280 | |
| 透气密封膜，无菌 | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | 转染试剂 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | 细胞培养基 |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's 磷酸盐缓冲液 |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's 磷酸盐缓冲液 |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | 用于外周血单核细胞纯化 |
| CD14 MicroBeads，人源 | Miltenyi | 130-050-201 | CD14+ 单核细胞纯化 |
| 人 M-CSF，优质级（1000 μg） | Miltenyi | 130-096-493 | 巨噬细胞集落刺激因子 |
| LS 柱 | Miltenyi | 130-042-401 | 用于 CD14+ 单核细胞分离的柱子 |
| 吐温80 | Euromedex | 2002-A | 分枝杆菌培养 |
| 高纯度甘油 | Euromedex | 50405-EX | 分枝杆菌培养 |
| Middlebrook OADC 增补剂 | Becton-Dickinson | 211886 | 分枝杆菌培养 |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | 分枝杆菌培养 |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | 非酶细胞解离液 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | 细胞核染料 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 细胞核染料 |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | 细胞核/细胞质染料 |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | HT5014 | 细胞固定液 |
| 靶向 Dectin-1 的 siRNA | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* 非靶向 siRNA 混合物 | Dharmacon | D-001206-14 | |
| 利福平 | Sigma-Aldrich | R3501 | 抗生素 |
| 异烟肼（INH） | Sigma-Aldrich | I3377-50G | 抗生素 |
| 潮霉素B | Life Technologies | 10687-010 | 抗生素 |
| 阿米卡星 | Sigma-Aldrich | A1774 | 抗生素 |
| 自动化共聚焦显微镜 OPERA | PerkinElmer | 图像采集 | |
| Columbus 2.3.1 服务器数据库 | PerkinElmer | 数据传输、存储与分析 | |
| Acapella 2.6 软件 | PerkinElmer | 基于图像的分析 | |
| GraphPad Prism5 软件 | GraphPad | 统计分析 | |
| Excel 2010 | Microsoft | 统计分析 |
参考文献
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of l....
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重印与许可
