方法文章

用于适应高通量/高含量筛查的细胞内分枝杆菌定量的微观表型检测

DOI：

10.3791/51114

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2014年1月17日

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1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里，我们描述了一种表型检测，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化合物和 结核 分枝杆菌突变库的高通量/高含量屏幕。该方法依靠使用自动共聚焦显微镜检测荧光标记的荧光结 核分枝杆菌 。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管有治疗和疫苗，结核病（TB）仍然是世界上最致命和最普遍的细菌感染之一。几十年来，多重耐药菌株的突然爆发对结核病的控制构成了严重威胁。因此，必须确定新的靶点和途径，对结核病的致病剂，结核分枝杆菌（Mtb）至关重要，并寻找可能成为结核病药物的新化学物质。一种方法是建立适合大型图书馆的基因和化学屏幕的方法，以便在大海捞针。为此，我们开发了一种表型检测，依靠使用自动共焦显微镜检测荧光标记的Mtb。这种体外测定允许对Mtb的殖民化过程进行基于图像的定量，并针对 384 井微板格式进行了优化，该格式适合锡RNA、化合物或Mtb突变库的屏幕。然后对图像进行多参数分析处理，从而提供主机单元内Mtb发病机理的读取推断。

引言

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在过去几年报告的新兴和重新出现的传染性病原体中，结核病分枝杆菌（Mtb）在2011年造成140万人死亡和870万新感染（2012年全球结核病报告，www.who.int/topics/tuberculosis/en/）中占有突出地位。尽管有多种药物疗法，感染人数仍在上升，耐多药（MDR）以及广泛耐药（XDR）Mtb正在迅速蔓延到世界各地1。 此外，在考虑Mtb抗原的存在时，很明显，全球三分之一的人口被认为是潜在的感染Mtb。 据统计，在十分之一的病例中，有1个病例正在向该病的活跃形式发展，随后出现临床症状2。因此，迫切需要新的手段来打击Mtb。在此背景下，我们开发了一种体外视觉表型检测，依靠自动共聚焦荧光显微镜3监测Mtb入侵并繁殖成宿主细胞。将检测结果与自动图像采集和分析相结合，在 384 井微晶板中进行适应，允许对化合物、硅RNA 和细菌突变体的中尺度库进行高含量/高通量筛选 （HC/HTS）。因此，在这种表型检测上筛选一个基因组宽的RNAi库，能够识别与Mtb贩运和细胞内复制有关的关键宿主因素，并能够阐明块茎杆菌利用的宿主通路。这种特殊的表型检测的另一个适应是识别细菌因素，这些细菌因素对Mtb内法戈索马尔的持久性至关重要。例如，逮捕法戈索姆成熟被认为是促进Mtb在巨噬细胞中生存和复制的主要机制之一。监测荧光标记酸性隔间中Mtb淘汰突变体的亚细胞定位，使参与生存过程的细菌基因得以识别。最后，Mtb的高含量成像也为量化药物效率提供了一个很好的方法，用于抑制细胞内细菌生长3等各种现象。总之，这种高通量表型检测可以加速对结核病的药物发现，这些不同方法收集的数据有助于更好地了解Mtb施加的宿主操纵。

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方案

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1. 高通量全基因组硅纳筛查

在感染Mtb H37Rv表达绿色荧光蛋白（GFP）时，在人类II型肺炎细胞模型A549细胞系中进行筛查。此过程在图 1A中概述。

  1. 用 1x siRNA 缓冲器重新存放在母板 （96 井板） 中的干燥硅纳库，以达到 4 μM 的浓度，然后将 10 μl 的混合物转移到 384 井女儿板（女儿板 1）中。
  2. 在女儿板 1 中加入 10μl 的 1x siRNA 缓冲区，将 siRNA 稀释 2 倍。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
  3. 将女儿板 1 中的 siRNA 稀释成女儿板 2，以达到 500 nM 的浓度。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
  4. 使用前，在室温下解冻女儿板2。
  5. 从女儿板 2 中取 2.5μl 的 siRNA，放入 384 井检测板中。
  6. 在第 1.5 步的同一 384 井检测板中，在各自的井中添加 2.5μl 负和正控制 siRNA。
  7. 将转染试剂稀释为 1x D-PBS，以产生足够的溶液，在每口井中提供 0.1μl 变异试剂，并在室温下预孵化稀释的输血液 5 分钟。
  8. 在检测板中将 7.5 μl 的转染试剂/PBS 溶液混合物添加到每个井中，并在室温下孵育 30 分钟。
  9. 加入40μl的A549细胞（1，500个细胞/井）悬浮在RPMI 1640中等补充10%胎儿牛血清（FBS）。在含有5%CO2的大气中，将细胞保持在37°C的3天潜伏期。这些细胞每24小时分裂一次，因此大约12，000个细胞在输血后三天在井中。
  10. 通过离心处理4，000 x g 5分钟，用D-PBS（从MgCl2和CaCl2免费）清洗两周前的GFP表达Mtb H37Rv培养物，并丢弃洗涤。重复此步骤 3 倍（对于GFP-Mtb H37Rv 文化条件，请参阅协议 3）。
  11. 将细菌颗粒悬浮在 10 毫升 RPMI 1640 中等，并辅以 10% FBS，在室温下减速 1 小时，使细菌聚集物沉积物。
  12. 收集细菌超自然物，并使用微板读卡器测量 OD600（OD 600应在 0.6-0.8 之间）和 GFP 荧光 （RFU 值），以确定细菌浓度。使用显示 RFU 值 = f （CFU 值） 的参考回归线计算悬架的滴定器，该线是在对在相同条件下准备的另一种文化进行实验之前生成的。准备含有2.4 x 106细菌/毫升的细菌悬浮，这相当于5的多种感染（MOI）。
  13. 取出 384 井检测板中的介质，并加入 25 μl 的新鲜制备细菌悬浮剂。
  14. 在含有5%CO2的大气中，在37°C的384井检测板中孵化5小时。

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结果

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高通量全基因组硅纳筛查

Mtb 能够 在体外 和其他几个肺上皮细胞中殖民免疫细胞。例如 ，Mtb能够感染和破坏通常用作人类 II 型肺细胞5-7模型的 A549 上皮细胞。Dectin-1被报告为主机细胞受体，参与 Mtb 吸收，增生反应和抗菌作用细胞内分枝杆菌生长在A549细胞8。第 1 号协议中描述的 siRNA 条件导致 85% 的沉默效率（未显示数据）。用siRNA沉默十进制-1表达导致A549细胞细胞细胞内分枝杆菌量减少。事实上，经过3天的沉默和5天的感染后，受感染细胞的百分比在Dectin-1沉默的A549细胞中两次减少，相比之下，与非目标争夺siRNA（图2A 和 2B）传播的细胞相比。我们应用了基于样本的siRNA靶向德汀-1的规范化，相比之下，争先恐后地定义Z-分数。如 图2C所示，我们获得了锡RNA靶向德汀-1的Z-分数平均值-15左右。Dectin-1...

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讨论

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我们在这里描述使用 GFP 表达 Mtb H37Rv 菌株感染荧光标记主机单元所需的表型检测方法，使其适合高含量/高通量屏幕。该协议可应用于广泛的化合物、荧光探头和 Mtb 突变体。对于上述每个协议，可以在图像采集之前执行固定和免疫标记步骤。我们使用配备 20X （NA 0.70） 或 60X （NA 1.2） 水透镜的自动荧光同焦显微镜来获取图像。共焦显微镜配备了405、488、561和640纳米激发激光器。发射的荧光是使用3个摄像头捕获的，这些摄像机与一组覆盖450-690 nm的检测波长的过滤器相关。需要注意的是，显微镜激发和发射设置的调整取决于每个实验中使用的染料或荧光素的类型。对于表型检测，DAPI 或 Hoechst 通常以 5 μg/ml 的速度使用，持续 10 分钟以弄脏核。然而，细胞也可以染色不同的荧光染料，专门用于检测细胞质，膜或细胞细胞细胞。图像采集后，应使用基于图像的分析软件对图片进行分析。应使用基于每个像素强度的细胞分割算法，分别确定细胞数量或细胞内细菌区域（见 图 4）。生成的数据应与基于统计的接受标准进行权衡，以验证分析的稳健性和准确性。...

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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这项工作的财政支助由欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB赠款n°260901，MM4TB赠款n°260872）、国家复兴银行、联邦（12001407（D-AL）Equipex想象生物医学）和加莱地区提供。我们感谢加斯帕德·德洛伊森、伊丽莎白·韦克迈斯特、安东尼诺·邦焦瓦尼和弗兰克·拉方特从BICEL平台获得的技术援助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
&微;透明板黑色，384 孔Greiner Bio-One781091127.8/86/15 MM，带盖，TC 处理
CellCarrier 384 孔板PerkinElmer6007550黑色，透明底，带盖，TC 处理
的 V 形底白色，384 孔板Greiner Bio-One781280 
密封胶带，透气，无菌康宁3345 
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150转染试剂
二甲基亚砜Sigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010细胞培养基
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco'磷酸盐盐缓冲液
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco'磷酸盐盐缓冲
剂胎牛血清Life Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03用于外周血单核细胞纯化的 Ficoll
CD14 微珠，人Miltenyi130-050-201CD14+ 单核细胞的纯化
人 M-CSF，优质 gr. （1000 μg）Miltenyi130-096-493巨噬细胞集落刺激因子
LS 色谱柱Miltenyi130-042-401CD14+ 单核细胞分离柱
Tween 80Euromedex2002-A分枝杆菌培养
物 甘油 高纯度 Euromedex50405-EX分枝杆菌培养
物 Middlebrook OADC 富集Becton-Dickinson211886分枝杆菌培养
7H9Becton-DickinsonW1701P分枝杆菌培养
物 Versene 1xLife Technologies15040033非酶细胞解离溶液
DAPILife TechnologiesD1306细胞核染料
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570细胞核染料
Syto60Life TechnologiesS11342细胞核/细胞质染料福
尔马林Sigma-AldrichHT5014
靶向 Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* 非靶向 siRNA 池 法D-001206-14 
利福平Sigma-AldrichR3501抗生素
异烟肼 （INH）Sigma-AldrichI3377-50G抗生素
潮霉素 BLife Technologies10687-010抗生素
阿米卡星Sigma-AldrichA1774抗生素
自动共聚焦显微镜 OPERAPerkinElmer图像采集
Columbus 2.3.1 服务器数据库PerkinElmer数据传输、存储和分析
Acapella 2.6 软件PerkinElmer基于图像的分析
GraphPad Prism5 软件GraphPad统计分析
Excel 2010Microsoft统计分析
的 物 的细胞固定液 siRNA

参考文献

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  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
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