通过在70%乙醇中用Azure B染色小鼠脊髓切片后，利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中提取了高质量的总RNA。 从3,000至4,000个运动神经元中可回收足量RNA（约40-60 ng），可用于后续的RNA-seq和qRT-PCR分析。
本文内容
摘要
摘要
从目标细胞中制备高质量RNA，对于精确且有意义地分析不同细胞类型之间，或同一种细胞类型在健康与疾病状态下以及药物处理后的转录差异至关重要。 在脊髓中，由于运动神经元——许多神经系统和神经退行性疾病的研究目标——仅占总细胞群体的<10%，因此从中获取RNA尤为困难。 激光显微切割技术（LMD）的开发正是为了解决这一难题。 本文描述了一种快速回收、冷冻并切片小鼠脊髓的实验方案，以避免内源性和外源性RNase对RNA造成降解；随后使用70%乙醇中的Azure B染色法识别运动神经元，同时抑制内源性RNase活性。 接着利用LMD将染色后的神经元直接捕获至硫氰酸胍裂解缓冲液中，以保持RNA完整性。 随后采用标准方法回收总RNA并检测其完整性。 所得RNA可用于后续RNA-seq和qRT-PCR等转录本分析。
引言
在由多种不同类型细胞构成的哺乳动物组织中，激光捕获显微切割（LMD）仪器的出现使得研究人员能够选择特定的细胞类型，进而开展RNA或蛋白质水平的分析。 目前，扩增和下一代测序技术使得研究人员能够利用数千个细胞的总RNA样本，相对全面地分析转录组，包括评估RNA的相对丰度以及鉴定多种剪接形式。 迄今为止，对数千个细胞进行的蛋白质组学分析仅能检测到丰度较高的蛋白质种类。 例如，我们已经鉴定出 <从3,000-4,000个运动神经元胞体（未显示）中鉴定出丰度最高的1,000种蛋白质，而Zhu及其同事最近报道从约15,000个肿瘤细胞中鉴定了2,665种蛋白质1. 然而，随着质谱技术的进一步发展，此类分析有望达到更深层次。
本文介绍了一种从小鼠脊髓中分离运动神经元胞体并进行RNA制备的特定实验方案。 该方案曾用于对症状前期转基因突变超氧化物歧化酶（SOD）1型肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠的运动神经元RNA与野生型SOD1转基因小鼠株的RNA进行比较分析，所用技术包括RNA-seq及qRT-PCR验证2。 值得注意的是，运动神经元位于脊髓灰质前角，占总细胞群体的比例不足<10%，周围被大量星形胶质细胞包围，因此其转录谱难以通过全脊髓组织研究直接解析。 因此，激光显微切割技术是分析这些细胞RNA表达的理想方法，通过短暂的心内灌注生理盐水后迅速取出并冷冻脊髓，可有效保持组织生理状态。 运动神经元的胞体较大，易于识别，本方案中使用一种对神经元具有强亲和力的染料进行标记3。 此外，由于细胞体积较大，每捕获一个细胞可获得相对较多的RNA。 下文详述的实验流程可便捷地调整用于获取其他类型的神经元，以及其他可通过染料染色或抗体标记特异性识别的细胞类型。
方案
本文所述的小鼠麻醉、安乐死及心脏灌注操作均在耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。
1. 无RNase仪器和溶液的准备
- RNase 是所有实验台面、微量移液器以及实验人员等实验室表面常见的污染物。
- 经常更换手套，或定期用RNA酶去污染溶液擦拭。
- 不锈钢解剖工具和玻璃器皿可通过在高温下加热去除RNase >200 °C 下灭菌 1 小时或更长时间。注意：蒸汽灭菌不能去除 RNase。也可先用 RNase 去除剂擦拭，再用无 RNase 的 70% 乙醇擦拭，然后空气干燥。
- 用RNase去污染溶液擦拭实验台面、其他实验室表面和微量移液器，随后用无RNase的70%乙醇擦拭。指定专门用于RNA提取与分析的实验台或工作区域。注意：擦拭移液器杆部前应取下吸头弹出器，并尽可能保持其拆卸状态。
- 使用经制造商认证为无RNase的试管、微量离心管、移液器及移液器吸头。建议使用超低吸附吸头和微量管。如有可能，应使用新开封的上述耗材包装，并将其与普通实验室用品分开存放。
- 从商业来源获取无RNase的溶液 [Dulbecco's无钙无镁PBS（PBS）、乙醇、无RNase的70%乙醇]。每次实验均使用新开封的瓶装试剂。
- Azure B 染料的来源对于完整 RNA 的成功回收至关重要。在将珍贵样品用于染色和收集之前，需对每一批次的染料进行测试。从非实验动物中收集数千个神经元，提取 RNA，并按以下方法测定 RNA 完整性，筛选出能够 consistently 产生 RIN 值高于 8.5 的染料批次。
- 将Azure B染料（1% w/v）溶解于无RNase的70%乙醇中，通常在50 ml离心管中加入0.3 g染料至30 ml乙醇。室温下于摇床上充分混匀过夜，或直至所有颗粒完全溶解。此溶液一管可多次用于染色多个载玻片，且不影响染色强度。
- 作为预防措施，每个生物学重复应使用不同的染色管。
- 使用冷冻切片模具和O.C.T.包埋组织块，无需进一步处理。
- 将冷冻切片机温度维持在 -20 至 -24 °C。切片完成后，将载玻片置于 -80 °C 超低温冰箱中保存，直至获得足够数量的切片。载玻片制备完成后应尽快开始 RNA 提取。对于长期保存，应储存未切或部分切过的 OCT 包埋组织块，而非载玻片，并置于 -80 °C 保存。
- 根据RNA提取试剂盒生产商提供的试剂及其说明书，配制用于从显微解剖获得的运动神经元中提取RNA的硫氰酸胍缓冲液。
2. 小鼠脊髓切片的制备（图1A）
- 使用烘烤或RNase去污染溶液擦拭解剖工具、载玻片、剃刀刀片和解剖平台，并随后用无RNase的70%乙醇处理。静置干燥2分钟。用实验室擦拭纸覆盖所有物品，防止灰尘污染。
- 动物操作程序，包括麻醉、心脏灌注和安乐死，应根据当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）的要求进行，目标是快速完成动物处理以便开展脊髓解剖。
- 通过腹腔（ip）注射致死剂量的氯胺酮（450 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
- 当达到深度麻醉状态，并通过脚趾夹捏无反应确认后，将小鼠仰卧固定于解剖平台（例如泡沫板），打开胸腔暴露心脏，将输液装置的27 G蝴蝶针插入左心室（位于操作者右侧）。用尖头镊子剪开右心房，使用蠕动泵以5–7 ml/min的速度灌注PBS约2分钟。此时从心房流出的液体应基本无血液残留。
- 移除灌注针头，将小鼠断头后翻转置于解剖板上。剪开皮肤暴露脊柱，使用小型剪刀和镊子去除椎骨，同时用尖头镊子切断神经根，完整取出脊髓。从开始灌注到取出脊髓的过程需迅速并熟练操作，总时间不应超过7分钟。
- 用无RNase的水冲洗脊髓10秒，以去除任何残留血液。用弯头镊子非常轻柔但迅速地将脊髓放置于无RNase的载玻片上。使用洁净的剃刀刀片将脊髓横向切成9–10段。
- 用同一把镊子将脊髓段转移至装有O.C.T.包埋剂的冷冻模具中，并用洁净的针头将其垂直排列整齐。将模具放入盛有液氮预冷的2-甲基丁烷的浅盘中，随后将浅盘浸入液氮浴中，快速冷冻脊髓组织，以避免RNA降解。
- 将O.C.T.包埋的组织块储存于-80 °C，最长可保存6个月后再进行切片。从脊髓取出到完成冷冻的全过程应在5分钟内完成，以保持RNA完整性。
- 在-20 °C条件下使用冷冻切片机对O.C.T.包埋的组织块进行切片，获得厚度为20 µm的切片，每张切片包含9–10个脊髓横截面，切片应贴附于初始置于室温的无RNase PEN膜2 μm载玻片上，以确保组织牢固粘附。切片完成后立即在冷冻切片机内-20 °C表面上重新冷冻。切片保存于-80 °C直至使用。
3. 脊髓切片染色（图1A）
- 在干净的支架上放置六个 50 ml 的锥形管，每个管中加入 25–30 ml 无 RNase 的 70% 乙醇，确保液面深度足以完全浸没载玻片上的所有组织切片。按照前述方法配制 30–35 ml 的 1% 亚甲蓝B溶液，并将其置于同一支架上，以减少染色或洗涤过程中更换溶液的时间。在支架前方放置三到四张实验室擦纸，用于快速吸除多余液体。
- 将载玻片从 –80 °C 冰箱中取出并置于干冰上。将其中一张载玻片放在戴手套的手掌上使其解冻。用擦纸轻轻擦拭载玻片表面，去除大部分水分和冷凝水，注意不要触碰组织切片。将载玻片置于培养皿中的新鲜硅胶干燥剂上，干燥 30–40 秒 ，直至完全干燥。若实验室湿度较高，可短暂使用真空干燥器以加快干燥速度。
- 洗涤与染色。
- 将干燥后的载玻片浸入第一个装有无 RNase 70% 乙醇的试管中，浸泡 30 秒，随后通过上下浸提 45–60 秒以洗去包埋剂（OCT）。将载玻片从溶液中取出，在擦纸上吸除多余液体。重复上述操作，将载玻片浸入第二个装有 70% 乙醇的试管中。若脊髓切片周围的 OCT 未完全去除，需在第三个试管中重复洗涤步骤。
- 吸除多余液体后，将载玻片浸入含 1% 亚甲蓝B的无 RNase 70% 乙醇溶液中，染色 30–45 秒。用擦纸吸除多余亚甲蓝B染液，此时整个载玻片将呈现蓝色。
- 将载玻片浸入下一个装有 70% 乙醇的试管中，快速上下浸提 3–4 次，以去除多余染料，使运动神经元的特异性染色清晰可见。若切片染色过深，可在新的 70% 乙醇试管中重复脱色步骤；若染色过浅，则将载玻片重新放入亚甲蓝B溶液中染色 30 秒，并再次脱色。用擦纸擦去多余乙醇，室温晾干约 40 秒，直至液体完全挥发。此时灰质呈浅蓝色，而运动神经元则呈深蓝色，清晰可辨。立即开始显微解剖操作。
4. 激光显微切割（LMD）（图1B）
- 打开显微镜，并卸下载物管架，安装一个0.6 ml微量离心管的管盖用于样本收集。向0.6 ml微量离心管的管盖中加入30 µl硫氰酸胍裂解缓冲液。使用移液器吸头将溶液铺开，使液体覆盖整个管盖表面。这样，在解剖过程中收集的所有神经元将立即溶解于裂解液中。将管盖与显微镜载物台上的孔位对齐，并通过显微镜软件将物镜对准目标位置。在开始激光显微切割前，保持管盖处于覆盖状态。
- 将空气干燥的载玻片倒置于激光显微切割（LMD）显微镜的载物台上，使PEN膜载玻片的膜面朝下。带有组织切片的一面应朝向孔位，其下方即为收集管。
- 在开始制片前10分钟打开激光器。使用5X物镜对脊髓切片进行聚焦，然后切换至20X物镜进行解剖操作。
- 使用光笔标记一个“虚拟”区域，并启动激光将其切割但不收集。此操作可松弛PEN膜，从而实现连续标记和切割多个区域。
- 重新对焦，识别腹角区域的运动神经元。这些神经元可通过其位置、锥形形态、较大体积以及Azure B染色后呈现的深蓝色进行辨认（图2）。
- 使用光笔选择绘图工具，沿运动神经元边缘完整勾勒轮廓。应尽量使轮廓贴近运动神经元，以避免非目标细胞的污染。（可预先测试若干切片，观察激光切割线的宽度，并据此调整安全间距。）可在切割前连续标记多个细胞，软件将自动记忆各标记位置。
- 通过点击管盖位置，将其移至切割区域正下方。点击启动按钮，开始激光切割并收集运动神经元。将同一载玻片上所有切片中的运动神经元全部收集至同一个微量离心管的管盖中。
- 收集完成后，卸下载物托盘并轻轻取出微量离心管。通过上下吹打使运动神经元在缓冲液中充分溶解。在4 °C条件下以14,000 × g离心2分钟，将溶液转移至管体中。立即用干冰冷冻样本，并于-80 °C保存。从载玻片染色到运动神经元收集的整个过程，每张载玻片应在30分钟内完成，以最大限度减少RNA降解。
5. 运动神经元的RNA制备
解冻来自一只动物的所有收集到的神经元，并合并在一起以提取RNA。根据样品中运动神经元（用Azure B染色）的数量，样品可能呈现淡蓝色。按照适用于激光显微切割（LMD）组织的试剂盒说明书提取RNA，洗脱时使用尽可能小的体积。取1 µl用于检测样品的浓度和完整性。将剩余RNA在干冰上快速冷冻，然后于-80 °C保存。
6. RNA 质量与数量的测定
根据制造商的说明书，使用毛细管电泳微流控芯片对1 µl样品进行RNA质量检测。RNA完整性数值（RIN）高于8.5的总RNA样品可用于RNA-seq和qRT-PCR。检测结果输出通常还包括样品的大致浓度。
结果
上述及以下所述的方案 图 1 应产生50 ng或更多的总RNA，且RIN值达到 >8.5 来自从第9-10节段分离的3,000-4,000个脊髓运动神经元胞体 20 µm 将切片置于约20张PEN载玻片上。由于此数量的载玻片仅占小鼠脊髓O.C.T.包埋块不到10%的体积，因此可重新取回并继续使用此前已储存在-80℃的包埋块。80 °C，并切取更多切片以进行下一轮RNA制备。如果分析需要较大量的RNA，则最好仅制备所需数量的切片（例如 20) 可一次性处理大量样本，通过解剖和RNA制备在数日内完成，随后可制作更多切片进行第二轮实验并将产物合并。务必首先检测每份样本的RIN值，避免将高质量样本与低质量样本混合。RNA-seq技术正变得越来越灵敏，新型PCR技术也有望比现有技术具备更高的灵敏度。因此，将需要更少的神经元胞体提取更少量的RNA，从而实现更深的测序深度，并对有意义的候选结果进行更全面的验证。另一方面，应严格遵循MIQE指南进行qRT-PCR分析与验证4 可能需要更大的用量，以便为低丰度RNA提供必要的对照反应。
图2展示了脊髓腹角切片经Azure B染色并进行显微切割后典型的一系列图像。在图A中，体积较大、染色较深的细胞体为运动神经元，经抗ChAT抗体染色确认2，可明显区别于周围较小的邻近细胞。图B显示的是同一区域，其中各个细胞体由手写笔勾勒轮廓，并由显微镜软件进行编号。轮廓线紧密贴合细胞体边缘，同时预留了激光切割宽度的微小余量。该间距需根据每种激光功率设置进行优化，以在尽量减少非目标组织掺入的同时，避免运动神经元胞质的丢失。图C和图D显示激光完成切割后，单个细胞体已落入收集管帽中的切片情况。请注意，图C中激光切割边缘并未完全沿手写笔轮廓线进行，而总体上保持在其外侧。这种不规则性在图D中也可见，同时可见每个切割区域周围出现的深色晕圈，反映了激光对组织造成的热损伤。因此，当两个细胞体彼此非常接近时，最好将其共同圈定为一次切割，而不是尝试分别切割，以免在两者邻近区域因热损伤导致部分RNA降解。
图3展示了从约4,000个通过激光显微切割（LMD）收集的小鼠运动神经元胞体中提取的RNA样本进行电泳分析以评估RNA完整性的典型结果。上方面板为1 µl总RNA产生的电泳图谱；右侧插图为凝胶图像。在两者中均可观察到明显的核糖体RNA峰。下方面板为含有RNA大小标准物的泳道的电泳图谱。分析软件计算出该样本的RNA完整性数（RIN）为9.8，浓度为4.9 ng/µl。分析后共获得13 µl该溶液，可提供64 ng RNA用于后续的qRT-PCR对转录本含量的验证。对于中等丰度转录本的典型qRT-PCR分析，0.15–0.20 ng总RNA已足以实现准确的定量2，因此本制备所获得的RNA量足以使用多对引物对多个转录本进行验证，符合推荐做法4。当然，也可使用更多的起始RNA量以实现对低丰度转录本的验证。该RNA量亦完全足以进行文库构建及下一代RNA测序（RNA-seq）。
图1. 脊髓切片制备及脊髓运动神经元胞体激光捕获显微切割的总体流程。A） 切片制备与染色的主要步骤。B） 脊髓切片及激光切割的示意图。 点击此处查看高清图像。
图 2. 激光显微切割Azure B染色的运动神经元胞体前后的图像。A） 染色切片腹角的一部分。注意四个大而深染的细胞。还有一些浅染且略小的细胞，它们不是运动神经元（经抗ChAT抗体染色确认；未显示，但参见Bandyopadhyay2），不会被选中进行切割。许多小而深色的斑点可能是神经突起（树突和轴突），但尚未得到证实。B） 使用光笔勾勒出的四个细胞胞体轮廓。注意轮廓紧贴细胞边缘，彼此之间保持最小距离。这种间距应针对每台显微镜和激光器通过实验确定。软件会对各个神经元进行编号，便于记录已收集的细胞数量。C 和D） 激光切割后，含有细胞胞体的组织片段落入收集帽中。注意留下的空洞比原始轮廓稍大且形状不规则。这反映了激光束的宽度以及其切割效率随局部组织成分的微小变化。每个空洞周围还可观察到一圈因激光局部加热损伤导致的深染组织边缘。
点击此处查看高分辨率图像。
图3. 通过LMD样本制备的RNA完整性电泳分析。A) 采用上述方案从约4,000个运动神经元胞体中提取的RNA，取1 µl进行微流控芯片上的微毛细管电泳分析。图中显示电泳图谱，可见明显的核糖体RNA峰。右侧为凝胶图像。 B) 显示大小标准品的电泳图谱，右侧为其对应的凝胶泳道。仪器软件计算得出该样品的RNA完整性数值（RIN）为9.8，浓度为4.9 ng/µl。 点击此处查看高清大图。
讨论
通过激光显微切割脊髓切片制备总RNA的本实验方案，其最重要的成功指标是RIN值5。对于来自高等真核生物的RNA样品，RIN值高于8.5通常可获得高质量的测序和qRT-PCR数据。如果产量较低但质量较高，可重复制备过程。然而，若RNA完整性较低（即使为7.5–8），则更应查找问题来源并重新尝试。实验中有多个步骤可能出现问题，但问题来源实际上仅有两类—— 内源性RNase污染或外源性RNase污染。前者可通过熟练操作加以解决，即尽量缩短小鼠处死后至将其包埋于O.C.T.中的脊髓组织冷冻的时间。实验流程中另一个可能导致内源性RNase影响结果的步骤是切片制备过程。每个切片应迅速贴附于室温的PEN载玻片上，但切片会融化（O.C.T.变得透明）。切片越快重新冷冻越好。我们使用的冷冻切片机在腔内设有处于-20 °C的平坦表面，可用于快速重冻切片。请在所用冷冻切片机中找到类似位置，并确保切片迅速恢复不透明状态。
追踪外源性RNase的来源可能十分困难，因为潜在来源众多。所使用的试剂中，未明确标注为无RNase的仅有O.C.T.和Azure B。如果Azure B此前表现正常，可尝试更换一瓶新的O.C.T.，尽管该试剂此前从未引起问题。即使是无RNase试剂，也可考虑更换，甚至可选用不同供应商的产品。更可能的污染源是实验操作者本身。除了彻底清洁工作区域外，通常还建议让另一位实验室成员全程观察并记录操作中的每一步骤。即使该人员并不经常执行此实验，但新的观察视角可能发现此前被忽视的污染来源。
将本方案扩展至从其他物种的脊髓细胞或其他器官的特定细胞类型中回收RNA时，需在多个方面进行修改，以实现对目标细胞的清晰鉴定，同时消除或至少最小化内源性RNase的影响。在本方案中，通过快速取出并冷冻脊髓组织，结合在70%乙醇中使用亚甲蓝B（Azure B）染色，既最大限度地减少了RNA降解，又便于运动神经元胞体的识别。亚甲蓝B是一种成熟的神经元组织化学染色剂，据知可与RNA3结合，曾被用于评估神经退行性疾病患者脑组织尸检样本中神经元的RNA含量6。值得注意的是，亚甲蓝B染色对纯化后RNA的完整性及其逆转录和分析能力均无影响。其他染料如焦油紫（cresyl violet）7和甲苯胺蓝（toluidine blue）8也已在类似的激光显微切割（LMD）方案中使用。在解剖过程中将细胞胞体直接收集至硫氰酸胍溶液中，是实现常规性回收完整RNA的最后关键步骤。
可以设想将类似方法应用于其他细胞和器官，关键在于在识别目标细胞的同时，最大限度地减少或最好完全防止内源性RNase引起的RNA降解，这是成功分析的必要条件。 在胰腺等 RNase 含量较高的组织中，通过快速操作和低温处理相结合的方法，可从 β 细胞中回收 RNA，并利用其天然的自发荧光进行可视化观察9. 也有报道称采用抗体染色方法进行鉴定10，但在我们的实验条件下尚未完全成功。 最后，已有多种表达荧光融合蛋白的小鼠模型可供使用（即 GFP、YFP、RFP）标记目标细胞，可用于在LMD显微镜的组织切片中识别这些细胞。 事实上，我们采用本方案分析的小鼠品系表达一种SOD1与YFP的融合蛋白11，且其脊髓运动神经元具有高度荧光性。 然而，我们未能找到一组乙醇洗涤和/或脱水条件，能够同时去除O.C.T.、抑制RNase活性，并持续保持足够的YFP荧光，以实现运动神经元的可视化及其通过LMD的回收。 或许可以找到一种新的荧光蛋白，或现有荧光蛋白的某种变体，其能在有机溶剂中保持荧光，从而克服这一局限性。
披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者感谢 George Farr 和 Horwich 实验室成员的有益讨论。本工作由霍华德·休斯医学研究所提供资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Webster Veterinary | 26637041101 | 机构兽医服务批准的任何来源 |
| 解剖工具（剪刀、镊子， 等） | 任何可获得的高质量解剖器械来源 | ||
| 冷冻切片机 | Leica Microsystem | CM3050S | 其他型号的冷冻切片机也应适用 |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | 其他激光显微切割系统尚未经过测试 | |
| 无RNase的PEN膜2 μm载玻片 | Leica Microsystem | 11505189 | 已测试过其他类型的载玻片，但性能不佳 |
| RNeasy Micro试剂盒（50） | Qiagen | 74004 | 任何使用硫氰酸胍裂解缓冲液并已验证可用于回收少量RNA的试剂盒均可使用 |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B认证 | MP Biomedicals | 190520 | 关键！来自任何来源的产品在使用前必须测试其维持RNA完整性的能力 |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | 任何可靠的无RNase PBS来源 |
| 70% RNA乙醇（用DEPC处理水配制） | American Bioanalytical | AB04010-00500 | 任何可靠来源，可实验室自制 |
| 无RNase、无内毒素水（经DEPC处理以消除RNase） | American Bioanalytical | AB02128-00500 | 任何可靠来源，可实验室自制 |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | 其他类似的RNase去除试剂，如RNaseZAP（亦来自Invitrogen）也可使用 |
| 2-甲基丁烷 | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | 任何来源 |
| 最大回收率微量离心管（0.6 和 1.5 ml）及移液器吸头 | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | 超低吸附、无RNase的离心管和吸头；使用前需测试其他厂商的产品 |
| O.C.T. 包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 中号冷冻模具 | Tissue-Tek | 4566 | |
| 实验室擦拭纸（Kimwipes） | KIMTECH | 34155 |
参考文献
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