我们描述了一种多角度旋转光学成像（MAROI）系统 体内 利用鞘氨醇蛋白C（SapC）-二油酰基磷脂酰丝氨酸（DOPS）纳米囊泡递送的荧光标记物进行定量分析。通过癌症和关节炎的小鼠模型，我们展示了如何利用MAROI信号曲线分析对疾病过程进行精确定位和生物学表征。
本文内容
摘要
摘要
我们介绍一种多角度旋转光学成像（MAROI）系统，用于对携带荧光标记的生理病理过程进行体内监测。采用小鼠模型（脑肿瘤和关节炎）评估该方法的实用性。将标记有CellVue Maroon（CVM）荧光染料的鞘氨醇激活蛋白C（SapC）-二油酰基磷脂酰丝氨酸（DOPS）纳米囊泡经静脉注射给予小鼠。随后将动物置于体内成像系统的旋转支架（MARS）中。图像以10°为步长，在380°范围内采集。在模型疾病部位，于整幅图像宽度上设置一个矩形 感兴趣区域（ROI）。在每个ROI内，对每幅图像在扣除背景后计算平均荧光强度。在所研究的小鼠模型中，标记的纳米囊泡被原位和转基因脑肿瘤以及关节炎病灶（脚趾和踝关节）摄取。通过对多角度图像的ROI进行曲线分析，确定信号最强的角度，从而表征了每个疾病部位成像的最佳角度。将MAROI方法应用于荧光化合物的成像，是一种对所述小鼠模型中疾病状态进行体内定量分析的无创、经济且精确的工具。
引言
整体动物成像已成为研究动物生理病理学的有力工具。在现有的成像系统中，MS FX PRO 可使研究人员精确可视化活体小鼠中荧光标记（或发光）化合物和/或组织，同时获取X射线图像。借助最新推出的多模态动物旋转系统（MARS），可实现小鼠的完整自动旋转，从而在特定角度下采集荧光/发光图像和X射线图像1图像采集可进行编程，以在特定的、最小为1°的递增角度下连续获取图像序列。这有助于确定动物的最佳取向， 即其中内部产生的荧光/生物发光信号与系统检测装置之间的距离最短。这有助于在纵向研究期间对动物进行精确定位，以便后续成像操作。
在本报告中，我们描述了一种多角度旋转光学成像（MAROI）系统的实现方法 体内 荧光标记强度的定量分析。MAROI信号曲线分析可用于纵向研究，通过荧光信号分布的直接关联，精确定位疾病部位或感兴趣的生物过程。
该系统用于监测荧光标记的SapC-DOPS纳米囊泡在活体小鼠中原位瘤、自发性肿瘤以及关节炎病灶中的吸收情况；通过动物全身完整的旋转扫描，获取多光谱、多模态的数据集。在目前可用的多种荧光探针中 体内 成像时，近红外和远红光谱区域发射的荧光染料对皮肤和组织的干扰最小，可实现最高的穿透深度和图像分辨率。我们使用了 CellVue Maroon (CVM)2,3，一种远红荧光细胞连接剂（Ex 647/Em 667），用于标记 SapC-DOPS（SapC-DOPS-CVM）4-12.
方案
动物使用伦理声明。所有动物实验均经辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC 协议编号：11-05-05-02）和辛辛那提儿童医院研究基金会（动物福利保证编号 A3108-01）批准。所有涉及小鼠的实验均遵循辛辛那提大学和辛辛那提儿童医院研究基金会的动物照护指南。
1. 准备动物模型
注意： 我们之前的研究中使用了以下三种不同的动物模型：
- 原位脑肿瘤小鼠模型：使用经颅内注射人源U87-ΔEGFR-Luc细胞的Nu/Nu裸雌性小鼠。这些小鼠会发展出具有人类胶质母细胞瘤典型特征的侵袭性肿瘤。
- 基因工程脑肿瘤小鼠模型13：将Mut3型（GFAP-cre; Nf1loxP/+; Trp53-/+）雄性小鼠与Trp53loxP/loxP; PtenloxP/loxP雌性小鼠交配，以获得Mut6型小鼠（GFAP-cre; Nf1loxP/+; Trp53-/loxP; PtenloxP/+）。通过将Mut3雄性小鼠与B6CBAF1/J品系雌性小鼠交配，在B6CBAF1/J背景中维持Mut3小鼠品系。在出生后第9至第12天对小鼠进行基因型鉴定，并在组织收获后再次确认基因型。
- K/BxN关节炎模型：使用经腹腔注射150 µl KRN x NOD F1小鼠血清的C57Bl/6J小鼠。这些小鼠在血清注射后24至48小时 出现关节炎。关节炎小鼠的成像在血清注射后第7天进行，此时小鼠表现出明显的肉眼可见关节炎。应根据下一步所述标准对小鼠进行评估。
- 采用关节炎指数宏观评分系统对小鼠的肉眼可见关节炎进行评估，标准如下：0分 = 无可见关节炎，1分 = 足垫或一个脚趾出现肿胀和/或发红，2分 = 累及两个关节，3分 = 累及三个关节， 4分 = 整个足部及脚趾出现重度关节炎。 该关节炎评分系统用于确定小鼠足部受累关节数量及关节炎严重程度。 即使评分最高的小鼠也极少表现出活动障碍迹象。 然而，需每周监测三次关节炎情况，对于处于剧烈疼痛状态（如因足部严重肿胀导致无法进食饮水）的小鼠应予以安乐死。
- 注意： 经尾静脉注射小鼠的液体在整个实验过程中需保持无菌。实验所用溶液的配制与给药均应使用清洁、无菌的一次性注射器和小瓶。
2. 荧光标记SapC-DOPS纳米囊泡的制备
- SapC 蛋白的制备：在表达系统中生产具有精确人源 SapC 序列的重组 SapC 蛋白 E. coli 细胞，如先前所述方法经修改后进行4SapC 通过乙醇沉淀，随后经高效液相色谱纯化。冻干后，使用干燥的 SapC，并通过称重法测定其浓度。
- 按照先前所述方法混合SapC蛋白7,10,11将DOPS（0.18 mg）和CVM（0.03 mg）混合于玻璃试管中，用氮气吹干以去除脂质溶剂。
- 加入SapC蛋白粉末（0.32 mg）至混合物中，用1 ml PBS缓冲液悬浮干燥混合物，并置于水浴中超声处理约15分钟 如先前所述7,10,11然后将悬液通过Sephadex G25柱（PD-10）以去除游离的CVM染料。最终产物的激发和发射最大值， 即 SapC-DOPS-CVM 纳米囊泡的粒径分别为 653 nm 和 677 nm。
3. 成像
- 使用上述步骤1中描述的脑肿瘤和关节炎小鼠模型来测试MAROI系统。用2%异氟烷对小鼠实施麻醉，并在成像过程中维持1-2%异氟烷。在成像期间，持续且轻柔地向成像腔内输送暖空气。 将少量无菌人工泪液软膏涂抹于小鼠双眼，以覆盖并润滑眼球。将小鼠置于MARS系统中，使其呈仰卧位，脊柱初始朝向摄像头图1校准MARS 380°支撑膜，并使用Bruker MI协议选项卡中的旋转软件对小鼠进行定位。在给予SapC-DOPS-CVM之前，按照下述方法获取小鼠的基线图像。
- 静脉注射 200 µl SapC-DOPS-CVM 通过尾静脉注射至小鼠体内。分别给予对照小鼠、关节炎小鼠或脑瘤荷瘤小鼠。
- 注射后24小时以及7-9天，以10°为增量，在380°范围内采集荧光图像（曝光时间25秒）和X射线图像（曝光时间10秒），形成轻微重叠，以确保旋转数据集无间隙。使用Bruker MI软件将荧光信号叠加至X射线图像，实现解剖定位。
4. 图像分析
- 绘制一个矩形感兴趣区域（ROI），使其覆盖疾病部位（肿瘤和关节炎）视野（FOV）的整个宽度。该ROI必须足够大，以确保在动物进行380°旋转过程中，病灶始终保留在视野内。对于脑肿瘤小鼠（原位和转基因模型），在每个肿瘤模型及其三只对照小鼠的所有时间点（基线、24小时和9天）均使用相同的矩形ROI。通过利用每只动物对应X射线图像上的解剖标志，保持各时间点间矩形ROI位置的一致性。在肿瘤模型上确定的解剖标志也必须用于在其相应的对照小鼠上放置相同的矩形ROI。 在X射线图像上可用于实现ROI准确定位的解剖标志包括颅底和颧弓的后部，这些结构在前后位（PA）图像的颅骨左右侧位上均可清晰识别。
- 在完成自动背景扣除后，计算每幅图像的平均荧光强度。使用Bruker MI成像软件将荧光图像转换为光子数/(s·mm2)。以成像角度为横坐标绘制荧光值曲线，并利用Excel或其他绘图软件，将对照小鼠平均荧光值的标准差作为误差棒标注在图中。
结果
本文展示了用远红染料（CVM）标记的SapC-DOPS纳米囊泡可特异性地在原位和自发性小鼠脑肿瘤中以及K/BxN小鼠的关节炎关节处富集。通过对小鼠完整旋转过程中在每个疾病部位上方设定的感兴趣区域（ROI）连续采集荧光/X射线图像，并进行MAROI曲线分析，确定了荧光强度最高的最佳成像角度。
使用MARS系统的主要目的是确定荧光的最佳角度，以便获得最准确的测量结果。文中展示了利用脑肿瘤或关节炎小鼠模型进行的三项实验的代表性结果。通过使用SapC-DOPS-CVM和MARS系统（图1），确定了观察肿瘤或由关节炎引起的炎症的最佳成像角度。在小鼠旋转380°的过程中，每隔10°采集一次荧光图像，随后进行X射线成像。荧光图像被叠加到相应的X射线图像上，用于图像显示及生成旋转视频。
原位脑肿瘤模型的结果如图2所示。代表性原位荷瘤小鼠（Ortho1）的荧光图像见图2A。该动物的最佳成像角度为10°，在此位置荧光光子强度最高（图2B）。测量分别在注射SapC-DOPS-CVM前（基线）和注射后24小时进行。对照小鼠（无肿瘤）接受类似处理。
图3展示了来自基因工程脑肿瘤小鼠模型的可比数据。荧光图像和光子计数在注射 SapC-DOPS-CVM 前（基线）、注射后24小时（图3A 和 图3B）以及注射后9天（图3C）采集。这些图表显示，在荷瘤动物（Tumor Mut49）中，注射后24小时的最佳成像角度为20°，但在注射后9天变为10°。这表明荧光信号的变化与形态学改变相关，可能反映了肿瘤的生长过程。
如表1所示，MAROI方法明确表明，当投影角度相对于最佳成像角度逐渐旋转偏离时，荧光信号随之减弱。在脑肿瘤中，若动物体位相对于最佳成像角度偏移±10°，荧光信号平均降低7%；在±20°偏移时，荧光信号平均降低21%。因此，即使相对于最佳角度仅有较小的偏移，也可能导致显著的信号衰减。采用MAROI技术进行图像定位，将有助于研究人员获得更一致且可靠的数据。
最终采用 MAROI 方法评估注射 SapC-DOPS-CVM 后 24 小时内 SapC-DOPS-CVM 对关节炎关节的靶向性。该动物评分为 3 分，具有三个关节炎关节。关节炎小鼠脚趾和踝关节的荧光图像分别如图 4A和图 4B所示。相应在 10° 旋转间隔下的光子计数结果分别绘于图 4C和图 4D。脚趾和踝关节的最佳成像角度分别为 140° 和 120°。
综上所述，MAROI系统与荧光标记的SapC-DOPS纳米囊泡相结合，代表了一种用于活体成像的非侵入性、准确且高灵敏度的策略，可实现对小型动物肿瘤和关节炎进展的定量研究。与单角度成像技术相比，获取360°多模态成像数据集的可能性显著提高了数据分析与解释的准确性。
表 1. 各小鼠模型的最佳成像角度。 可观察到最大光子荧光角度（FLR 最佳角度）与标准解剖学角度（X 射线）之间的差异。当这两个角度差异增大时，测得的信号会发生显著变化。点击此处查看高清图像。
图1. 多角度旋转光学成像（MAROI）装置。 点击此处查看大图。
图 2. 荧光信号与正位脑肿瘤小鼠模型成像角度的关系。(A). 在最佳成像角度 10° 时峰值荧光信号的图像。蓝色框表示用于量化发射光子的感兴趣区域（ROI）。(B). 成像角度与光子发射量的关系图。代表性正位荷瘤小鼠（Ortho1）的数据与三只无肿瘤小鼠相同感兴趣区域的平均荧光值进行对比。测量在基线（注射前）和注射后 24 小时进行。误差线表示标准差。点击此处查看大图。
图3. 在转基因小鼠模型的自发性脑肿瘤中，荧光信号随成像角度的变化。（A） �感兴区1（顶部蓝色框，ROI 1）在最佳成像角度20°时的峰值荧光信号图像。（B） 和 （C）。ROI 1的成像角度与光子发射量的关系图。数据来自一只代表性自发性脑肿瘤小鼠（Tumor-Mut 49），并与三只无肿瘤小鼠的平均值进行对比。测量时间点分别为基线期（注射前）、注射后24小时（B）和9天（C）。误差线表示标准差。点击此处查看高清图像。
图4. 趾关节和踝关节关节炎小鼠中荧光信号与成像角度的关系。（A） 和 （B）。图像显示趾部（A）和踝关节（B）在红色框所示感兴趣区域（ROI）内的最强荧光信号。（C）。趾部平均光子发射量随角度变化的曲线图。在140°时可见光子发射峰值。（D）。踝关节平均光子发射量随角度变化的曲线图；最大强度出现在120°。 点击此处查看高清图像。
讨论
准确确定风湿性疾病中实体瘤和炎性病灶的位置与大小，对于实施恰当治疗以及监测疾病进展或缓解至关重要。尽管现有的影像学策略（X射线、磁共振成像、超声、X射线计算机断层扫描）具有一定价值，但对疾病状态的评估仍不全面。例如，关节炎性关节损伤通常通过X射线进行评估，该方法可提供骨结构信息，但无法反映疾病早期阶段典型的软组织炎症与破坏情况。本文介绍的MAROI方法结合了X射线与先进软组织成像技术的优势例如 在小动物（如小鼠）中，通过一种集成化、非侵入性且更简便的平台，实现对病变组织或器官的完整三维成像与重建，该平台可结合 MRI 或超声等成像方式。
该方法利用 SapC-DOPS 纳米囊泡对暴露的磷脂酰丝氨酸残基的选择性亲和力，这类残基在癌细胞和炎性细胞的细胞膜中含量丰富。介导这一结合的关键成分为 SapC，它是一种具有强亲和力的融合性溶酶体蛋白，可特异性结合磷脂酰丝氨酸等阴离子型磷脂7,10,11。当 SapC-DOPS 与荧光探针（CVM）偶联后，通过系统注射，可利用荧光成像技术追踪其在肿瘤和关节炎病灶部位的分布。
我们方法的局限性主要与其灵敏度有关，目前限制了其仅可用于小动物（如小鼠）的成像。与其他成像方法类似，荧光信号与噪声的最优比值受限于肿瘤的大小或关节炎的范围，在对具有高背景自体荧光的组织或器官进行成像时（如耳朵（脑部成像）、肠道/粪便（腹部成像）和足爪（后肢成像）），信号可能受到影响。在这方面，我们发现使用近红外染料（如CVM）可在光谱分离和分辨率方面提供更佳效果 体内 与其他可见光范围内的荧光探针相比，具有更优的成像环境。
其他陷阱包括动物在成像过程中可能出现的移动，无论是在麻醉状态下还是 死后 (尸僵）。尤其是后肢的定位，通常难以稳定，容易在旋转过程中发生移动。目前该技术还较为耗时，完成一次完整的旋转并获取高质量图像所需的扫描时间可长达60分钟。
与其它成像方式相比，MAROI 方法具有多项优势。能够从 38 个（或更多）不同角度对病变组织进行成像，有助于观察在单一平面成像时可能被遮蔽的荧光信号；这一点在动物研究中尤为重要，有助于减少因成像角度不当而导致的假阴性结果。通过叠加 X 射线图像与荧光图像，可精确定位病变部位的解剖位置。最后，活体（in vivo）成像的可能性使得纵向研究得以实施。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助，资助编号为1R01CA158372-01（资助对象：Qi）以及新药国家科技重大专项资助编号009ZX09102-205（资助对象：Qi）。写作协助由朱迪·拉卡迪奥博士（Dr. Judy Racadio）提供，并由辛辛那提大学血液学与肿瘤学系资助。影像学实验由辛辛那提大学医学院Vontz核心影像实验室（Vontz Core Imaging Lab, VCIL）完成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco (Grand Island, NY) | 11965 | |
| 胎牛血清 | Gibco (Grand Island, NY) | 16000077 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone (Logan, Utah) | SV30010 | |
| 二油酰基磷脂酰丝氨酸 | Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) | 840035C | |
| CellVue Maroon | Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA) | C-1001 | |
| Sephadex G25 PD-10 柱 | Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ) | 17-0851-01 | |
| 大鼠和小鼠新型标准脑立体定位仪 | Harvard Apparatus (Holliston, MA) | 726335 | |
| Bransonic 超声波清洗机 1510 型 | Branson Ultrasonics (Danbury, CT) | CPN-952-118 | |
| 多光谱 FX 系统 | Bruker Corporation (Billerica, MA) | ||
| 多角度旋转光学成像装置 | Bruker Corporation (Billerica, MA) |
参考文献
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