方法文章

FIBS功能的无创性代谢轮廓

DOI：

10.3791/51200

⸱

2014年2月3日

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1Centre for Process Systems Engineering, Department of Chemical Engineering and Chemical Technology, Imperial College London, 2Centre for Synthetic Biology and Innovation, Division of Molecular Biosciences, Imperial College London

本文内容

摘要

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如何在原位代谢轮廓校正共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于描述呈现。该FIBS可用于测量非侵入性代谢物辅助的代谢模式和生物过程条件的高通量筛选的发展的细胞内水平。

摘要

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在计算生物学的时代，新的高通量实验系统是必要的，以便填充和完善的模型，使他们能够进行预测进行验证。理想的情况是这样的系统将是低量，这就排除了采样和破坏性的分析时，时间过程的数据将被获取。所需要的是一种在原位监测工具，它可以在实时和非侵入性地报告必要的信息。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为细胞内浓度的记者。已经发现应用中代谢物的定量一个特定类的体内生物传感器是基于共振能量转移（FRET）的配体结合结构域连接的两个荧光蛋白之间。 FRET集成生物传感器（FIBS）细胞系中都产生组成，他们有快速的响应时间和他们的茶谱根据代谢物在细胞内的浓度特性的研究改变。在本文中，该方法用于构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为葡萄糖和谷氨酰胺和校准体内批次细胞培养物中FIBS以使胞内代谢物浓度的将来量化进行说明。从进料 - 分批的CHO细胞培养数据表明，FIBS能够在每种情况下，检测在细胞内的浓度所产生的变化。使用从FIBS和先前构建的校准曲线的荧光信号，细胞内浓度，精确地确定所确认的独立酶法测定。

引言

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代谢物监测在生物加工各种应用，包括工艺开发，媒体和饲料的设计，以及代谢工程。各种方法可用于浓度测量通过使用酶1，化学2，或结合试验3。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为关键代谢产物的细胞内浓度的记者。在超低量测定法，荧光是一种方便的工具，如小型化实际上是改善了信号-噪声比4,5和蛋白为基础的传感器可遗传编码的意义，没有外源试剂是必需的代谢物的分析。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器包括一个配体结合域连接的两个荧光蛋白。 FRET是能量从光激发捐助者的一个非辐射转移到受体荧光分子要价较高，编接近（<100）。配体的裂解或结合引起的构象变化的传感器，其中，反过来，诱导的荧光基团的接近而变化，导致通过在发光光谱的变化测定FRET效率的变化。 FRET集成生物传感器（FIBS）的细胞系中是组成型产生的和它们的光谱特性改变的基础上代谢物在细胞内的浓度。 FIBS具有快速响应时间使它们非常适合进行测量的动态模型6。以前的应用包括监测单7-9和10多个代谢物，以及提供有关时空分布11个数据。载脂蛋白最大，其中配体结合打乱降低能量传递和载脂蛋白民，其中配体结合所带来的两个荧光基团成更紧密的接触（ 图1）的荧光团的接近:FIBS可以在两种配置中创建。

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方案

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1。细胞系的复兴和维护

  1. 恢复在补充有8 2mM L-谷氨酰胺和10ml / L的100倍的次黄嘌呤/胸苷补充物（完全培养基）9毫升的CD-CHO培养基中的CHO细胞。
  2. 离心机在100×g离心5分钟。
  3. 重悬在10毫升新鲜的完全生长培养基中的细胞。
  4. 取出1ml样品，用光学显微镜测定的活菌浓度使用台盼蓝染料排除法用血细胞计数。
  5. 启动培养以3×10 5细胞/在125毫升毫升的接种密度摇瓶。
  6. 维持培养在培养箱中在37℃，5％CO 2的潮湿气氛中，在轨道摇动平台旋转在120rpm上。
  7. 继代培养，每3-4天在完全生长培养基中以2×10 5细胞/ ml的接种密度。

2。该细胞株与质粒的C转染ontaining的基因生物传感器

  1. 使用大规模的质粒纯化试剂盒制备的质粒DNA。
  2. 维持细胞在适当的条件下（37℃，5％CO 2）的12-24小时转染前，以确保细胞活跃分裂在转染时。
  3. 使用台盼蓝染料排除方法计数细胞，然后制备20 ml的细胞培养物中加入125ml工作体积摇瓶中以1×10 6个细胞/ ml的浓度。
  4. 使用合适的转染试剂盒中使用的细胞系。质粒DNA转染试剂的比例将依赖于细胞系和载....

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结果

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该方法的概述示于图2。在这里提出的工作，CHO细胞用的FIBS载体和稳定细胞系，在400微克/毫升硫酸博来霉素的抗生素压力被选定。两个独立的稳定细胞系组成性表达的葡萄糖和谷氨酰胺的传感器因此被创建。 图1描述了在本研究中使用的生物传感器2的配置。葡萄糖传感器是基于载脂蛋白 - 最大原理和相应的质粒是PRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite。这是一种融合增强型青色荧光蛋白（ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的阿芙罗狄蒂变到E的F16A突变大肠杆菌葡萄糖/半乳糖周质结合蛋白。从接头区域中除去11个氨基酸残基，以提高荧光共振能量转移效率13。使用uniq这个载体被克隆到载体pCDNA4/TOUE 的EcoRⅠ和Pst I限制性位点，其中用到了巨细胞病毒启动子和SV40增强子。

谷氨酰胺传感器是基于载脂蛋白敏原理（ 图1）和相应的质粒来自黄色荧光蛋白柠檬色的插入到.......

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讨论

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该FIBS使在体内和关键分子原位定量，在这种情况下生长限制性营养物质，除去从淬火和提取方法所产生的不确定性。调查结果表明，有在FIBS信号和细胞内浓度在1-5毫米的范围内葡萄糖和0.3-2mm的谷氨酰胺之间的良好关系。在批量的CHO细胞培养中，这些浓度中的指数，固定的，并且早下降阶段遇到的问题。该指数相和固定相是最关键的适宜喂养策略的设计方面，因此使用这些生物传感器来估计细胞的代谢要求，是工业相关。补料分批实验的结果证实了FIBS是否适合提供细胞内的葡萄糖和谷氨酰胺浓度的估计。展出的偏差在较早的时间点可能已经出现，因为较低的活菌数的BER因为通过其他代谢物， 例如 ，通过半乳糖中的葡萄糖FIBS的情况下，并通过在谷氨酰胺FIBS的情况下，其他氨基酸的干扰和/或。具体地，它已经表明，高达20％的FRET比率的降低可能发生在天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，苏氨酸，缬氨酸和酪氨酸15的存在。总体而言，这些结果表明在FIBS信号误差是相当低的。

虽然这种方法只能监视分子的数目有限的时间，它可以提供有用的信息，供细胞系和工.......

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

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我们感谢狼Frommer教授（卡内基科学研究所，斯坦福大学）的好心为我们提供的葡萄糖FRET质粒和乌韦Ludewig博士（霍恩海姆大学）的亲切供应谷氨酰胺FRET构建在pUTKan植物表达载体。 AB公司是由BBSRC针对性的优先级奖学金计划提供资金。既CK和KP是由英国研究理事会奖学金的生物制药工艺的支持。 CK还要感谢龙沙生物提供财政支持。该中心为合成生物学与创新是慷慨由EPSRC支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CHO-S 细胞生命技术11619-012细胞系将根据研究的目标而有所不同
pCDNA4/TO 载体 Life Tecnologies
TransIT-PRO 转染试剂Mirus Bio MIR5700转染可以使用任何适合研究细胞系的方法完成
ZeocinInvivogen
CD-CHO 培养基Life Technologies10743-011细胞生长培养基依赖于研究中的细胞
100x HT 补充剂Life技术11067-030
L-谷氨酰胺 200 mM （100x），LiquidLife Technologies25030032
InfinitePRO 200 酶标仪TecanFLx800TBI任何可以访问所需波长的 96 孔荧光酶标仪都可以替代
酶标仪Tecan30000463
大提质粒纯化试剂盒Qiagen12163任何合适的试剂盒都可以替代
Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒InvitrogenA22189任何合适的试剂盒都可以替代
EnzyChrom 谷氨酰胺检测试剂盒BioAssay SystemsEOAC-100任何合适的试剂盒都可以替代改进的
Neubauer 血球计数器Fisher ScientificMNK-420-010N
培养箱 NuaireNU-5510E
过滤器

参考文献

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  1. Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
  2. Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal.....

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重印与许可

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