需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

FIBS 实现的无创代谢谱分析

9.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51200

⸱

2014年2月3日

 ,  ,  , 
1Centre for Process Systems Engineering, Department of Chemical Engineering and Chemical Technology, Imperial College London, 2Centre for Synthetic Biology and Innovation, Division of Molecular Biosciences, Imperial College London

本文内容

摘要

Förster共振能量转移整合生物传感器（FIBS）的校准方法描述 原位 代谢谱分析被介绍。 FIBS 可用于无创测量细胞内代谢物水平，有助于代谢模型的构建以及生物工艺条件的高通量筛选。

摘要

在计算生物学时代，为了填充和优化可用于预测性验证的模型，有必要开发新的高通量实验系统。理想的系统应具备低反应体积的特点，从而在需要获取时间序列数据时避免取样和破坏性分析。目前亟需一种 原位 一种可实时、无创报告必要信息的监测工具。一种有趣的选择是使用基于荧光蛋白的 体内 生物传感器作为细胞内浓度的报告分子。其中一类特别的 体内 基于荧光蛋白间 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器已应用于代谢物定量，该传感器由两个荧光蛋白通过一个配体结合域连接而成。FRET 集成生物传感器（FIBS）可在细胞系中持续表达，具有快速响应特性，且其光谱特征会随细胞内代谢物浓度变化而改变。本文介绍了构建稳定表达葡萄糖和谷氨酰胺 FIBS 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的方法，以及对 FIBS 进行校准的流程。 体内 在批次细胞培养中，为实现未来对细胞内代谢物浓度进行定量而描述的方法。补料分批CHO细胞培养的数据表明，FIBS在每种情况下均能检测到细胞内浓度的相应变化。通过FIBS的荧光信号及先前构建的校准曲线，可准确测定细胞内浓度，并经独立的酶法测定验证。

引言

代谢物监测在生物加工过程中具有多种应用，包括工艺开发、培养基与补料设计以及代谢工程。通过使用酶法等多种方法可进行浓度测定1化学2或结合实验3一种有趣的选择是使用基于荧光蛋白的 体内 生物传感器作为报告细胞内关键代谢物浓度的工具。在超低体积检测中，荧光是一种便捷的技术手段，因为微型化实际上能够提高信噪比4,5 基于蛋白质的传感器可实现基因编码，这意味着代谢物分析无需外源试剂。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器由两个荧光蛋白通过一个配体结合域连接而成。FRET 是一种非辐射能量转移过程，能量从光激发的供体分子传递至邻近的受体荧光分子。<100）。配体的切割或结合会引起传感器的构象变化，进而改变荧光团之间的相对位置，导致荧光共振能量转移（FRET）效率发生变化，这种变化可通过发射光谱的改变来检测。FRET整合型生物传感器（FIBS）在细胞系中持续表达，其光谱特性随细胞内代谢物浓度的变化而改变。FIBS具有快速响应的特性，非常适合用于动态模型的实时测量。6. 此前的应用包括监测单个7-9 以及多个10 代谢物 并提供时空分布数据11FIBS 可以构建为两种构型：Apo-Max，其中配体结合会破坏荧光团之间的接近性，从而降低能量转移；以及 Apo-Min，其中配体结合使两个荧光团更紧密接触。图1).

本研究提出了一种构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的方案，该细胞系可组成型表达针对代谢物葡萄糖或谷氨酰胺的FIBS。同时建立了一种传感器校准方法。 体内 以实现对细胞内代谢物浓度的未来定量测量，如文中所示 图2根据这一原理，可测定在补料分批式CHO细胞培养过程中添加了高浓度葡萄糖或谷氨酰胺时细胞内的营养物浓度。结果表明，利用FIBS的荧光信号及先前构建的校准曲线，能够准确预测细胞内浓度，并经独立的酶法测定验证。该方法相较于现有的分析技术具有显著优势，因其具有非侵入性、低成本和快速的特点，可实时监测FIBS信号并贯穿整个培养过程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 细胞系复苏与维持

  1. 在9 ml添加了8 mM L-谷氨酰胺和10 ml/L 100倍浓度次黄嘌呤/胸腺嘧啶补充剂的CD-CHO培养基（完全生长培养基）中复苏CHO细胞。
  2. 以100 × g离心5分钟。
  3. 将细胞重悬于10 ml新鲜完全生长培养基中。
  4. 取1 ml样品，使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板在光学显微镜下测定活细胞浓度。
  5. 以3 × 105 个细胞/ml的接种密度，在125 ml摇瓶中启动培养。
  6. 将培养物置于37 °C、含5% CO2的加湿环境中，在转速为120 rpm的轨道摇床上培养。
  7. 每3–4天在完全生长培养基中传代一次，接种密度为2 × 105 个细胞/ml。

2. 用含有生物传感器基因的质粒转染细胞系

  1. 使用大规模质粒纯化试剂盒制备质粒DNA。
  2. 转染前12-24小时，在适宜条件下（37 °C，5% CO2）培养细胞，以确保转染时细胞处于活跃分裂状态。
  3. 采用台盼蓝染色排除法计数细胞，随后在125 ml摇瓶中制备20 ml细胞培养液，细胞浓度为1 × 106 个细胞/ml。
  4. 根据所用细胞系选择合适的转染试剂盒。质粒DNA与转染试剂的比例取决于细胞系和载体类型。建议在进行最终转染前，按照试剂生产商推荐的范围测试多个比例以优化条件。同时至少设置一个不含DNA的阴性对照组。
  5. 静置培养4天后，转移至以125 rpm旋转的摇床中继续培养。
  6. 根据杀灭曲线确定的合适浓度，加入适用于质粒筛选的抗生素。本研究中，使用zeocin进行筛选，终浓度为400 μg/ml。
  7. 按照细胞系所需的时间间隔更换培养基，每次更换时均加入抗生素，直至对照孔中的细胞完全死亡。
  8. 选择融合度最高的孔中的细胞进行摇瓶培养扩增。
  9. 通过将1 ml冻存液（含107 个活细胞）分装至冻存管中建立细胞库。本实验中冻存液组成为92.5%生长培养基和7.5%二甲基亚砜。

3. 分批与补料分批细胞生长曲线

  1. 按照上述细胞培养维护说明，在250 ml 摇瓶中建立转染CHO细胞的三组平行培养，工作体积为50 ml。
  2. 将培养物置于37 °C、含5% CO2的加湿细胞培养箱中，在转速为125 rpm的轨道摇床上培养，并每隔24小时从每瓶培养物中取出4.1 ml 样品。
  3. 取100 μl 样品，采用台盼蓝染色排除法测定活细胞浓度和细胞活力。
  4. 重复操作，直至活细胞浓度降至零。
  5. 对补料分批培养的细胞，在第6天补充适量葡萄糖或谷氨酰胺，使其浓度分别恢复至初始值36 mM和4 mM。建议同时维持额外的对照培养组，该组在相同时间点加入相同体积（本例中为12 ml）的纯水。

4. FRET 比值测量

  1. 取上述3.2步骤中每天采集的2 ml样品，在4 °C条件下以100 × g离心5分钟。
  2. 将细胞沉淀重悬于2 ml预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，转移至6孔板，并在其中一个孔中加入不含细胞的空白样品。
  3. 立即在激发波长430/435 nm、发射波长465/435 nm（蓝色）和520/510 nm（黄色）条件下测定蓝色和黄色荧光水平。
  4. 计算FRET比值（检测到的黄色荧光与蓝色荧光的比值）。

5. 代谢物检测

  1. 取上述步骤3.2中每天采集的2 ml样品，在4 °C条件下以100 × g离心5分钟，弃去上清液。
  2. 将细胞沉淀重悬于3 ml预冷的PBS中，并在相同条件下再次以100 × g离心5分钟。
  3. 弃去上清液，将细胞沉淀如上所述重悬于3 ml预冷的PBS中。对样品进行超声处理，每次3分钟，共5次，超声程序设置为每15秒开启后暂停15秒。此时，若需要，可将细胞提取物冷冻保存。
  4. 按照制造商说明书，使用合适的葡萄糖检测试剂盒对细胞提取物样品进行检测，以测定细胞内葡萄糖浓度（参见材料表）。
    注意：使用适当的标准品绘制标准曲线。本研究中，标准品浓度范围为0–100 mM。
  5. 根据标准品的测定值绘制标准曲线，并求出最佳拟合直线方程（本例中：y = 1310.51x - 723.43，其中y为吸光度读数，x为葡萄糖浓度）。
  6. 利用标准曲线计算葡萄糖浓度，并考虑稀释倍数。然后可通过以下公式计算细胞内葡萄糖浓度：
    细胞内浓度计算公式；浓度计算方法；生化分析流程
    对于CHO细胞，单个细胞体积是基于12 μm的细胞直径计算得出的12。
  7. 按照制造商说明书，使用合适的谷氨酰胺检测试剂盒对细胞提取物样品进行检测，以测定细胞内谷氨酰胺浓度（参见材料表）。
    注意：使用适当的标准品绘制标准曲线。本研究中，标准品浓度范围为0–2 mM。
  8. 同5.5步骤，绘制校准曲线（本例中y = 203.1x + 17.1，其中y为吸光度读数，x为谷氨酰胺浓度）。
  9. 利用标准曲线计算样品的谷氨酰胺浓度，并考虑稀释倍数。细胞内谷氨酰胺浓度可通过上述公式1进行计算。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

方法学概述见图2。本研究中，使用FIBS载体转染CHO细胞，并在400 μg/ml杀稻瘟菌素（zeocin）的抗生素压力下筛选获得稳定细胞系。由此建立了两个分别稳定表达葡萄糖和谷氨酰胺传感器的细胞系。图1展示了本研究中所用两种生物传感器的结构。葡萄糖传感器基于Apo-Max原理，对应的质粒为pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite。该质粒将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的Aphrodite变体融合至大肠杆菌（E. coli）葡萄糖/半乳糖周质结合蛋白的F16A突变体上。为提高FRET效率，从连接区删除了11个氨基酸残基13。该载体通过独特的EcoRI和PstI限制性酶切位点克隆至pCDNA4/TO载体中，后者含有巨细胞病毒（Cytomegalovirus）启动子和SV40增强子。

谷氨酰胺传感器基于Apo-Min原理（图1），其相应的质粒是通过将黄色荧光蛋白...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

FIBS 能够实现 体内 和 原位 关键分子（在此为限制生长的营养物质）的定量，消除了由淬灭和提取方法引起的不确定性。研究结果表明，FIBS信号与细胞内葡萄糖浓度在1-5 mM范围以及谷氨酰胺浓度在0.3-2 mM范围内具有良好的相关性。在批次CHO细胞培养中，这些浓度出现在对数生长期、平台期和早期衰退期。其中，对数生长期和平台期在制定适当补料策略方面最为关键；因此，利用这些生物传感器估算细胞代谢需求在工业上具有重要意义。流加批次实验的结果证实了FIBS适用于估计细胞内葡萄糖和谷氨酰胺浓度。早期时间点出现的偏差可能源于活细胞数量较低和/或其它代谢物的干扰。 例如 在葡萄糖FIBS的情况下由半乳糖引起，而在谷氨酰胺FIBS的情况下由其他氨基酸引起。具体而言，已有研究表明，在天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸存在时，FRET比率最多可降低20%。15总体而言，这些结果表明FIBS信号的误差相当低。

尽管该方法一次只能监测有限数量的分子，但它可为细胞系和工艺开发提供有用信息，甚至可用于数学模型验证所...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Wolf Frommer教授（斯坦福大学卡内基科学研究所）慷慨提供葡萄糖FRET质粒，感谢Uwe Ludewig博士（霍恩海姆大学）慷慨提供克隆于pUTKan植物表达载体中的谷氨酰胺FRET构建体。AB由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）定向优先奖学金项目资助。 CK和KP均获得英国研究与创新署（RCUK）生物制药加工领域研究员职位的支持。 CK还感谢Lonza Biologics提供的资金支持。 合成生物学与创新中心获得了英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）的大力支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CHO-S 细胞Life Tecnologies11619-012细胞系将根据研究目标的不同而有所变化
pCDNA4/TO 载体 Life Tecnologies
TransIT-PRO 转染试剂Mirus BioMIR 5700可使用任何适用于所研究细胞系的转染方法完成转染
ZeocinInvivogen
CD-CHO 培养基Life Technologies10743-011细胞生长培养基取决于所研究的细胞类型
100x HT 补充剂Life Technologies11067-030
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)，液体Life Technologies25030032
InfinitePRO 200 酶标仪TecanFLx800TBI任何能够检测所需波长的 96 孔荧光酶标仪均可替代
酶标仪滤光片Tecan30000463
质粒大提纯化试剂盒Qiagen12163可使用任何合适的试剂盒替代
Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒InvitrogenA22189可使用任何合适的试剂盒替代
EnzyChrom  谷氨酰胺检测试剂盒BioAssay SystemsEOAC-100可使用任何合适的试剂盒替代
改进型纽鲍尔血细胞计数板Fisher ScientificMNK-420-010N
培养箱 NuaireNU-5510E

参考文献

  1. Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
  2. Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
  3. Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
  4. Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
  5. Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
  6. Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
  7. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
  8. Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
  9. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  10. Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
  11. Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
  12. Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
  13. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  14. Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
  15. Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
  16. Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

FRET整合生物传感器细胞内代谢物分析中国仓鼠卵巢细胞荧光共振能量转移无创生物传感器监测补料分批细胞培养谷氨酰胺葡萄糖检测质粒转染筛选荧光比率测量酶学检测验证
FIBS 实现的无创代谢谱分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。