方法文章

FIBS功能的无创性代谢轮廓

DOI：

10.3791/51200

⸱

2014年2月3日

 ,  ,  , 
1Centre for Process Systems Engineering, Department of Chemical Engineering and Chemical Technology, Imperial College London, 2Centre for Synthetic Biology and Innovation, Division of Molecular Biosciences, Imperial College London

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如何在原位代谢轮廓校正共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于描述呈现。该FIBS可用于测量非侵入性代谢物辅助的代谢模式和生物过程条件的高通量筛选的发展的细胞内水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在计算生物学的时代，新的高通量实验系统是必要的，以便填充和完善的模型，使他们能够进行预测进行验证。理想的情况是这样的系统将是低量，这就排除了采样和破坏性的分析时，时间过程的数据将被获取。所需要的是一种在原位监测工具，它可以在实时和非侵入性地报告必要的信息。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为细胞内浓度的记者。已经发现应用中代谢物的定量一个特定类的体内生物传感器是基于共振能量转移（FRET）的配体结合结构域连接的两个荧光蛋白之间。 FRET集成生物传感器（FIBS）细胞系中都产生组成，他们有快速的响应时间和他们的茶谱根据代谢物在细胞内的浓度特性的研究改变。在本文中，该方法用于构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为葡萄糖和谷氨酰胺和校准体内批次细胞培养物中FIBS以使胞内代谢物浓度的将来量化进行说明。从进料 - 分批的CHO细胞培养数据表明，FIBS能够在每种情况下，检测在细胞内的浓度所产生的变化。使用从FIBS和先前构建的校准曲线的荧光信号，细胞内浓度，精确地确定所确认的独立酶法测定。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代谢物监测在生物加工各种应用，包括工艺开发，媒体和饲料的设计，以及代谢工程。各种方法可用于浓度测量通过使用酶1，化学2，或结合试验3。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为关键代谢产物的细胞内浓度的记者。在超低量测定法，荧光是一种方便的工具，如小型化实际上是改善了信号-噪声比4,5和蛋白为基础的传感器可遗传编码的意义，没有外源试剂是必需的代谢物的分析。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器包括一个配体结合域连接的两个荧光蛋白。 FRET是能量从光激发捐助者的一个非辐射转移到受体荧光分子要价较高，编接近（<100）。配体的裂解或结合引起的构象变化的传感器，其中，反过来，诱导的荧光基团的接近而变化，导致通过在发光光谱的变化测定FRET效率的变化。 FRET集成生物传感器（FIBS）的细胞系中是组成型产生的和它们的光谱特性改变的基础上代谢物在细胞内的浓度。 FIBS具有快速响应时间使它们非常适合进行测量的动态模型6。以前的应用包括监测单7-9和10多个代谢物，以及提供有关时空分布11个数据。载脂蛋白最大，其中配体结合打乱降低能量传递和载脂蛋白民，其中配体结合所带来的两个荧光基团成更紧密的接触（ 图1）的荧光团的接近:FIBS可以在两种配置中创建。

_content">在这项工作中，一个协议，提出构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为代谢物，葡萄糖或谷氨酰胺，一种方法是建立在传感器体 ​​内的校准，以使将来的定量胞内代谢物浓度的测量，如示于图2。基于此，葡萄糖或谷氨酰胺的细胞内浓度可在补料分批的CHO细胞培养物测定中，向其中两种养分中加入高浓度的过程，其结果证明由FIBS和先前构建的校准曲线使用的荧光信号，准确预测细胞内浓度是可能的，并经一个独立的酶法测定，该方法提供了超过当前的分析技术显着的优点，因为它是无创的，低成本的快，给，可在星期一FIBS的实时信号itored整个文化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。细胞系的复兴和维护

  1. 恢复在补充有8 2mM L-谷氨酰胺和10ml / L的100倍的次黄嘌呤/胸苷补充物（完全培养基）9毫升的CD-CHO培养基中的CHO细胞。
  2. 离心机在100×g离心5分钟。
  3. 重悬在10毫升新鲜的完全生长培养基中的细胞。
  4. 取出1ml样品，用光学显微镜测定的活菌浓度使用台盼蓝染料排除法用血细胞计数。
  5. 启动培养以3×10 5细胞/在125毫升毫升的接种密度摇瓶。
  6. 维持培养在培养箱中在37℃，5％CO 2的潮湿气氛中，在轨道摇动平台旋转在120rpm上。
  7. 继代培养，每3-4天在完全生长培养基中以2×10 5细胞/ ml的接种密度。

2。该细胞株与质粒的C转染ontaining的基因生物传感器

  1. 使用大规模的质粒纯化试剂盒制备的质粒DNA。
  2. 维持细胞在适当的条件下（37℃，5％CO 2）的12-24小时转染前，以确保细胞活跃分裂在转染时。
  3. 使用台盼蓝染料排除方法计数细胞，然后制备20 ml的细胞培养物中加入125ml工作体积摇瓶中以1×10 6个细胞/ ml的浓度。
  4. 使用合适的转染试剂盒中使用的细胞系。质粒DNA转染试剂的比例将依赖于细胞系和载体。值得推荐，这是通过测试的范围由制造商进行的最终转染前规定的范围内的比率的最优化。还维持含有细胞，但没有DNA的至少一个阴性对照的文化。
  5. 孵育在静态模式下4天，然后转移到一个夏奇纳克平台转速为125转每分钟。
  6. 添加适当的抗生素进行质粒选择到合适的浓度为通过杀灭曲线来确定。在这项研究中，硫酸博来霉素加至400微克/毫升供选择转染的细胞的终浓度。
  7. 在该细胞系的适当时间间隔改变介质，抗生素每次添加，直到细胞中控制以及已经死亡。
  8. 用最汇合井进步到颤抖的文化。
  9. 冻结的细胞中含有10 7活菌1毫升冷冻混合冻存管建立细胞库。在这项工作中，这是由92.5％的生长培养基和7.5％二甲亚砜。

3。批次和补料分批细胞生长曲线

  1. 遵循用于细胞维持上述说明，建立转染的CHO细胞在250毫升的一式三份细胞培养摇瓶中的50毫升的工作容积。
  2. 保持丘尔清晰度，在湿润的细胞培养箱中，在37℃，5％的CO 2，在轨道摇动平台旋转125转，并从每个生长培养除去4.1毫升样品在24小时的时间间隔。
  3. 用100微升的样品，以确定与台盼蓝染料排斥法的活细胞浓度和细胞活力。
  4. 重复，直到活细胞的浓度降低至零。
  5. 重复分批补料细胞培养与补充葡萄糖或谷氨酰胺在第6天的适量恢复其浓度为36毫米和4毫米它们的初始值，分别为。建议额外的控制培养物也保持，这是与纯水的相同体积（12毫升这种情况下）被输送。

4。 FRET比率测量

  1. 取2毫升每日样品除去在上面的步骤3.2和离心机在100×g离心5分钟，在4℃下
  2. Resusp在2ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的止细胞沉淀。转移到这一个6孔板和不含细胞的空白样品加至一个阱。
  3. 紧接在四百三十五分之四百三十nm，发射四百三十五分之四百六十五纳米（蓝色）和五百十分之五百二十零纳米（黄色）的波长的激发波长测量的蓝色和黄色的荧光水平。
  4. 计算FRET比率（检测过检测蓝色荧光黄色荧光的比值）。

5。代谢产物的测定

  1. 取2毫升每日样品除去在上面的步骤3.2和离心机在100×g离心5分钟，在4℃下除去上清液。
  2. 再次重悬细胞沉淀在3毫升冰冷的PBS和离心机在100×g离心5分钟。
  3. 去除上清，重悬细胞沉淀在3毫升冰冷的PBS如上。超声处理的样品5倍的每个3分钟，在15秒的脉冲和15秒关闭。在这一点上，所述细胞额外如果需要的话仙可能会被冻结。
  4. 使用适当的葡萄糖测定试剂盒按照制造商的关于细胞提取物的样品的指示，以确定细胞内的葡萄糖的浓度（见表材料）。
    注意:使用适当的标准来建立标准曲线。在这项工作中，标准的浓度0-100毫米之间不等。
  5. 使用读数为标准，构建标准曲线，并找到最佳拟合的线性方程（在这种情况为:y = 1310.51x - 723.43其中y为吸光度读数和x是葡萄糖浓度）。
  6. 利用标准曲线，并采取稀释考虑在内计算的葡萄糖浓度。细胞内的葡萄糖浓度然后可以使用这个公式计算:
    figure-protocol-1
    对于CHO细胞，单细胞的体积，用12μM12上的泡孔直径计算
  7. 使用适当的谷氨酰胺测定试剂盒按照制造商的关于细胞提取物的样品的指示，以确定细胞内的谷氨酰胺浓度（见表材料）。
    注意:使用适当的标准来建立标准曲线。在这项工作中，标准的浓度为0-2毫米之间。
  8. 如在5.5以上，构建校准曲线（在这种情况下，y = 203.1x + 17.1其中y是吸光度读数和x是葡萄糖浓度）
  9. 利用标准曲线，计算出样品的谷氨酰胺浓度，取稀释考虑在内。细胞内谷氨酰胺浓度可以使用公式1以上计算。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法的概述示于图2。在这里提出的工作，CHO细胞用的FIBS载体和稳定细胞系，在400微克/毫升硫酸博来霉素的抗生素压力被选定。两个独立的稳定细胞系组成性表达的葡萄糖和谷氨酰胺的传感器因此被创建。 图1描述了在本研究中使用的生物传感器2的配置。葡萄糖传感器是基于载脂蛋白 - 最大原理和相应的质粒是PRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite。这是一种融合增强型青色荧光蛋白（ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的阿芙罗狄蒂变到E的F16A突变大肠杆菌葡萄糖/半乳糖周质结合蛋白。从接头区域中除去11个氨基酸残基，以提高荧光共振能量转移效率13。使用uniq这个载体被克隆到载体pCDNA4/TOUE 的EcoRⅠ和Pst I限制性位点，其中用到了巨细胞病毒启动子和SV40增强子。

谷氨酰胺传感器是基于载脂蛋白敏原理（ 图1）和相应的质粒来自黄色荧光蛋白柠檬色的插入到...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该FIBS使在体内和关键分子原位定量，在这种情况下生长限制性营养物质，除去从淬火和提取方法所产生的不确定性。调查结果表明，有在FIBS信号和细胞内浓度在1-5毫米的范围内葡萄糖和0.3-2mm的谷氨酰胺之间的良好关系。在批量的CHO细胞培养中，这些浓度中的指数，固定的，并且早下降阶段遇到的问题。该指数相和固定相是最关键的适宜喂养策略的设计方面，因此使用这些生物传感器来估计细胞的代谢要求，是工业相关。补料分批实验的结果证实了FIBS是否适合提供细胞内的葡萄糖和谷氨酰胺浓度的估计。展出的偏差在较早的时间点可能已经出现，因为较低的活菌数的BER因为通过其他代谢物， 例如 ，通过半乳糖中的葡萄糖FIBS的情况下，并通过在谷氨酰胺FIBS的情况下，其他氨基酸的干扰和/或。具体地，它已经表明，高达20％的FRET比率的降低可能发生在天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，苏氨酸，缬氨酸和酪氨酸15的存在。总体而言，这些结果表明在FIBS信号误差是相当低的。

虽然这种方法只能监视分子的数目有限的时间，它可以提供有用的信息，供细胞系和工...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者什么都没有透露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢狼Frommer教授（卡内基科学研究所，斯坦福大学）的好心为我们提供的葡萄糖FRET质粒和乌韦Ludewig博士（霍恩海姆大学）的亲切供应谷氨酰胺FRET构建在pUTKan植物表达载体。 AB公司是由BBSRC针对性的优先级奖学金计划提供资金。既CK和KP是由英国研究理事会奖学金的生物制药工艺的支持。 CK还要感谢龙沙生物提供财政支持。该中心为合成生物学与创新是慷慨由EPSRC支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CHO-S 细胞生命技术11619-012细胞系将根据研究的目标而有所不同
pCDNA4/TO 载体 Life Tecnologies
TransIT-PRO 转染试剂Mirus Bio MIR5700转染可以使用任何适合研究细胞系的方法完成
ZeocinInvivogen
CD-CHO 培养基Life Technologies10743-011细胞生长培养基依赖于研究中的细胞
100x HT 补充剂Life技术11067-030
L-谷氨酰胺 200 mM （100x），LiquidLife Technologies25030032
InfinitePRO 200 酶标仪TecanFLx800TBI任何可以访问所需波长的 96 孔荧光酶标仪都可以替代
酶标仪Tecan30000463
大提质粒纯化试剂盒Qiagen12163任何合适的试剂盒都可以替代
Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒InvitrogenA22189任何合适的试剂盒都可以替代
EnzyChrom 谷氨酰胺检测试剂盒BioAssay SystemsEOAC-100任何合适的试剂盒都可以替代改进的
Neubauer 血球计数器Fisher ScientificMNK-420-010N
培养箱 NuaireNU-5510E
过滤器

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
  2. Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
  3. Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
  4. Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
  5. Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
  6. Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
  7. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
  8. Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
  9. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  10. Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
  11. Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
  12. Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
  13. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  14. Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
  15. Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
  16. Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

FRET Integrated Biological SensorsIntracellular Metabolite ProfilingChinese Hamster Ovary CellsFluorescence Resonance Energy TransferNoninvasive Biosensor MonitoringFed Batch Cell CultureGlutamine Glucose DetectionPlasmid Transfection SelectionFluorescence Ratio MeasurementEnzymatic Assay Validation

相关文章