体内小鼠视神经纤维完整性的对比增强MRI成像

摘要

本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50^KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo 研究。

摘要

啮齿类动物的视觉系统包括视网膜神经节细胞及其轴突，这些轴突组成视神经并投射至丘脑和中脑中枢，再通过突触后投射到达视觉皮层。由于其独特的解剖结构和易于操作的特点，该系统已成为研究神经元存活、轴突再生和突触可塑性的首选结构。近年来，磁共振成像技术的进步使得 体内 利用锰增强磁共振成像（MEMRI）对这一投射中的视网膜-顶盖通路进行可视化。本文介绍了一种用于小鼠视觉投射成像的MEMRI实验方案，该方法可实现（200 µm）的分辨率³ 可使用常见的3特斯拉扫描仪实现。我们演示了玻璃体内注射单次剂量15 nmol MnCl₂ 在24小时内导致完整投射区域的信号增强达到饱和。除视网膜外，信号强度的变化与同步的视觉刺激或生理老化无关。我们进一步应用该技术纵向监测急性视神经损伤后轴突的变性过程，该模型通过Mn²⁺ 运输在损伤部位完全停止。相反，活性Mn²⁺ 运输与轴突纤维的存活力、数量及电活动呈定量正比关系。对于此类分析，我们以 Mn²⁺ 转基因小鼠模型中视觉通路的运输动力学（NF-κB） p50^基因敲除) 表现出感觉投射（包括视觉投射）的自发性萎缩。在这些小鼠中，MEMRI 显示 Mn²⁺ 信号降低，但未延迟²⁺ 与野生型小鼠相比，其运输功能出现异常，从而揭示了NF-κB突变导致的结构和/或功能损伤迹象。

总之，MEMRI 便捷地弥合了 体内 检测和 死后 组织学方法用于表征神经纤维的完整性和活性，对轴突变性与再生的纵向研究以及对突变小鼠真实或可诱导表型的研究具有重要价值。

引言

由于啮齿类动物视觉系统具有理想的神经解剖学结构，因此为评估药理学化合物及其介导神经保护¹或促再生效应的能力提供了独特的可能性^2,3。此外，该系统可用于研究小鼠突变体的功能和神经解剖学特征，例如近期对缺乏突触前支架蛋白Bassoon的小鼠所开展的研究⁴。同时，一系列丰富的辅助工具可用于进一步表征视网膜神经节细胞（RGC）及其轴突的数量，以及RGC的活性，例如通过视网膜电图和行为学测试，并通过内在信号光学成像来确定皮层的重组情况。激光显微成像技术的最新进展使得能够在视神经（ON）和脑组织的整体标本中，通过深层组织荧光成像实现RGC再生的原位可视化。在这种组织学方法中，基于四氢呋喃的组织透明化技术结合光片荧光显微镜，可分辨重新进入去传入性视神经及视束的单根纤维⁵。尽管这些技术在分辨率和生长模式判定方面可能更具优势，但无法实现对个体生长事件的重复性和纵向分析，而后者对于评估长期再生过程尤为重要。

增强对比 MRI 已被用于小鼠和大鼠视网膜-顶盖投射的微创可视化^6,7。这可以通过将顺磁性离子直接递送至眼内来实现（例如，Mn²⁺) 对视网膜细胞。作为一种钙类似物，Mn²⁺ 通过电压门控钙通道进入RGC胞体，并沿完整的视神经和视束的轴突细胞骨架主动运输。当其在视觉投射的脑核团中积累时，....

方案

所有动物实验均按照 欧洲实验动物护理和使用公约 以及 眼科与视觉研究中动物使用的ARVO声明所有实验均经当地伦理委员会批准。小鼠视神经损伤的操作步骤已在其他文献中描述。⁹.

1. 玻璃体内锰注射

1. 在助手协助下，于磁共振扫描前24小时进行Mn²⁺注射。通过腹腔注射5%水合氯醛溶液（420–450 mg/kg体重，溶于无菌PBS）对动物进行麻醉。在眼球穿刺前，为加强局部麻醉，可在角膜表面滴加一滴表面麻醉剂（0.4%盐酸奥布卡因）。为实现每眼注射15 nmol Mn²⁺，配制7.5 mM MnCl₂溶液，例如，将1 L 1 M MnCl₂储备液加入132 L H₂O中稀释。将5 µl终溶液吸入一支连接34 G 小柄可拆卸针头（RN针头）的5 µl Hamilton注射器中。
2. 从右眼开始操作时，将小鼠左侧卧置于双目显微镜下，用左手拇指与食指轻轻撑开并固定右眼。右手持注射器，手握针头靠近其尖端部位。为减少对眼球的损伤，将针头小心刺入眼球的颞下部玻璃体腔，穿刺点位于角膜缘远端约1 mm处，注意避开巩膜血管。
3. 随后，助手缓慢推注Hamilton注射器刻度上显示的全部2 μl 液体。操作过程中需在显微镜下持续观察针头位置是否正....

结果

该成像技术准确评估视觉投射通路活力与功能的能力，依赖于向玻璃体腔精确施用无毒剂量的 Mn²⁺ 并由视网膜神经节细胞（RGCs）摄取。这一关键假设在图1中通过自显影金属染色法（TIMM 染色）²¹验证了 Mn²⁺ 的层特异性摄取。在玻璃体内（ivit）注射 15 nmol 或 150 nmol Mn²⁺ 或作为对照的 PBS 后 24 小时，对视网膜切片进行分析。在此时间点，注射 Mn²⁺ 的视网膜在 T₁ 加权 MRI 中显示出最大信号增强（N = 3；虚线），而注射 PBS 的视网膜无信号增强（N = 3；虚线）（图1，左图）。注意 150 nmol 注射眼出现的高信号增强。相比之下，非增强的脑区（星号标记）在所有条件下均显示相似的背景信号强度（绿色）。ivit 注射 Mn²⁺ 显著增强了整体 TIMM 染色，尤其在 RGC 层和神经纤维层（NFL）中更为明显（图1.......

讨论

视觉系统MEMRI技术拓展了传统神经生物学方法，可用于评估正常及病理条件下的功能状态。除了能够提供关于孤立中枢神经系统纤维束完整性的独特信息外，MEMRI还可便捷地与行为学测试相结合， 例如，验光及基于视觉的水迷宫任务，以研究特定范式对视觉感知的即时影响。同时，将电生理学与组织学研究与视觉功能表征相结合 体内该技术具有高度的可靠性和可重复性，在相同组别内个体间差异较小（见误差棒） 图3、图4）。有趣的是，在15 nmol剂量下，Mn²⁺ 摄取和轴突运输是饱和过程，因此信号增强会达到一个平台期，无法通过额外添加 Mn 进一步提高²⁺ 供应⁹从实际应用的角度来看，这种剂量-反应特性在一定程度上最小化了与注射相关的信号增强变异。值得注意的是，本文提供的关于Mn剂量及其动力学的数据²⁺ 信号增强在小鼠中具有特异性，且不同于大鼠，后者需要大约10-20倍的增强 较高的 Mn²⁺ 剂量和延长潜伏期（36 小时）以达到最佳对比度增强^13,23.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M 氯化锰（II）溶液	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI 对比剂
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% 盐酸奥布卡因
Floxal 滴眼液	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml 氧氟沙星
泛醇软膏	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
水合氯醛	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420–450 mg/kg 体重
Hamilton 注射器	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, 无 NDL
34 G 针头（34/35/pst4/tapN）	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	可拆卸针头 RN，34 G，长度 38.1 mm，尖端类型 4
双目解剖镜 Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T 磁共振成像仪 Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
大鼠头部线圈	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
小鼠固定装置			定制
红光灯
冷冻切片包埋剂 NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	用于冷冻切片的组织包埋
一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）	Merck, Darmstadt, Germany	106346	用于硫化物灌注
九水合硫化钠（Na2S·9H2O）	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
阿拉伯树胶	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	用于 TIMM 染色
对苯二酚（C6H6O2）	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
柠檬酸（C6H8O7）	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）	Merck, Darmstadt, Germany	106448
硝酸银（AgNO3）	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908