本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo 研究。
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摘要
摘要
啮齿类动物的视觉系统包括视网膜神经节细胞及其轴突，这些轴突组成视神经并投射至丘脑和中脑中枢，再通过突触后投射到达视觉皮层。由于其独特的解剖结构和易于操作的特点，该系统已成为研究神经元存活、轴突再生和突触可塑性的首选结构。近年来，磁共振成像技术的进步使得 体内 利用锰增强磁共振成像（MEMRI）对这一投射中的视网膜-顶盖通路进行可视化。本文介绍了一种用于小鼠视觉投射成像的MEMRI实验方案，该方法可实现（200 µm）的分辨率3 可使用常见的3特斯拉扫描仪实现。我们演示了玻璃体内注射单次剂量15 nmol MnCl2 在24小时内导致完整投射区域的信号增强达到饱和。除视网膜外，信号强度的变化与同步的视觉刺激或生理老化无关。我们进一步应用该技术纵向监测急性视神经损伤后轴突的变性过程，该模型通过Mn2+ 运输在损伤部位完全停止。相反，活性Mn2+ 运输与轴突纤维的存活力、数量及电活动呈定量正比关系。对于此类分析，我们以 Mn2+ 转基因小鼠模型中视觉通路的运输动力学（NF-κB） p50基因敲除) 表现出感觉投射（包括视觉投射）的自发性萎缩。在这些小鼠中，MEMRI 显示 Mn²⁺ 信号降低，但未延迟2+ 与野生型小鼠相比，其运输功能出现异常，从而揭示了NF-κB突变导致的结构和/或功能损伤迹象。
总之，MEMRI 便捷地弥合了 体内 检测和 死后 组织学方法用于表征神经纤维的完整性和活性，对轴突变性与再生的纵向研究以及对突变小鼠真实或可诱导表型的研究具有重要价值。
引言
由于啮齿类动物视觉系统具有理想的神经解剖学结构，因此为评估药理学化合物及其介导神经保护1或促再生效应的能力提供了独特的可能性2,3。此外，该系统可用于研究小鼠突变体的功能和神经解剖学特征，例如近期对缺乏突触前支架蛋白Bassoon的小鼠所开展的研究4。同时，一系列丰富的辅助工具可用于进一步表征视网膜神经节细胞（RGC）及其轴突的数量，以及RGC的活性，例如通过视网膜电图和行为学测试，并通过内在信号光学成像来确定皮层的重组情况。激光显微成像技术的最新进展使得能够在视神经（ON）和脑组织的整体标本中，通过深层组织荧光成像实现RGC再生的原位可视化。在这种组织学方法中，基于四氢呋喃的组织透明化技术结合光片荧光显微镜，可分辨重新进入去传入性视神经及视束的单根纤维5。尽管这些技术在分辨率和生长模式判定方面可能更具优势，但无法实现对个体生长事件的重复性和纵向分析，而后者对于评估长期再生过程尤为重要。
增强对比 MRI 已被用于小鼠和大鼠视网膜-顶盖投射的微创可视化6,7。这可以通过将顺磁性离子直接递送至眼内来实现（例如，Mn2+) 对视网膜细胞。作为一种钙类似物，Mn2+ 通过电压门控钙通道进入RGC胞体，并沿完整的视神经和视束的轴突细胞骨架主动运输。当其在视觉投射的脑核团中积累时， 即 外侧膝状体（LGN）和上丘（SC）向初级视皮层的跨突触传播似乎可以忽略不计8,9，尽管可能发生10,11在磁共振成像序列中，顺磁性锰2+ 主要通过缩短T来增强MR对比度1 自旋-晶格弛豫时间12. 这类 Mn2+ 增强型磁共振成像（MEMRI）已成功应用于大鼠多种神经解剖学和功能研究，包括视神经损伤后轴突再生与变性的评估13,14视网膜-顶盖投射的精确解剖定位15以及药物处理后轴突运输特性的测定16神经元锰剂量、毒性和动力学的最新优化2+ 摄取与转运，以及改进的MRI方案已将其应用扩展到转基因小鼠的研究中9 使用临床实践中常用的3 Tesla扫描仪17.
本文介绍了一种适用于小鼠视网膜-顶盖投射的纵向活体成像的锰增强磁共振成像（MEMRI）方案，并通过在正常状态及多种神经退行性条件下评估Mn2+依赖性信号增强，展示了该方法的适用性。本方案特别强调在普通可及的3 T中等磁场条件下进行磁共振数据采集，相较于专用动物成像设备更具可及性。在正常小鼠中，我们展示了玻璃体内（ivit）注射Mn2+后，特定神经通路的信号强度可显著且可重复地增强。定量分析表明，Mn2+沿视觉通路的传播与正常衰老过程无关（在3至26月龄小鼠中测定），且该增强效应不受视觉刺激或暗适应的影响。相反，在急性视神经（ON） crush损伤18模型以及因自发性视网膜神经节细胞（RGC）凋亡和视神经退变而致病的nfkb1基因敲除小鼠（p50KO）中，丘脑和中脑区域的Mn2+富集程度均显著降低19。因此，相较于传统的组织学分析，对个体动物进行纵向MEMRI分析能够描绘出神经退行性过程的独特动力学特征。该方法将有助于研究与药理学或遗传干预相关的神经保护及轴突再生过程。
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方案
所有动物实验均按照 欧洲实验动物护理和使用公约 以及 眼科与视觉研究中动物使用的ARVO声明所有实验均经当地伦理委员会批准。小鼠视神经损伤的操作步骤已在其他文献中描述。9.
1. 玻璃体内锰注射
- 在助手协助下，于磁共振扫描前24小时进行Mn2+注射。通过腹腔注射5%水合氯醛溶液（420–450 mg/kg体重，溶于无菌PBS）对动物进行麻醉。在眼球穿刺前，为加强局部麻醉，可在角膜表面滴加一滴表面麻醉剂（0.4%盐酸奥布卡因）。为实现每眼注射15 nmol Mn2+，配制7.5 mM MnCl2溶液，例如，将1 L 1 M MnCl2储备液加入132 L H2O中稀释。将5 µl终溶液吸入一支连接34 G 小柄可拆卸针头（RN针头）的5 µl Hamilton注射器中。
- 从右眼开始操作时，将小鼠左侧卧置于双目显微镜下，用左手拇指与食指轻轻撑开并固定右眼。右手持注射器，手握针头靠近其尖端部位。为减少对眼球的损伤，将针头小心刺入眼球的颞下部玻璃体腔，穿刺点位于角膜缘远端约1 mm处，注意避开巩膜血管。
- 随后，助手缓慢推注Hamilton注射器刻度上显示的全部2 μl 液体。操作过程中需在显微镜下持续观察针头位置是否正确，避免刺穿晶状体或液体外溢。注射完成后保持针头静止插入状态30秒，然后缓慢拔出，以尽量减少注射部位的液体渗漏。
- 整个操作过程中应特别注意避免对眼球施加压力，同时避免反复或粗暴穿刺眼球。由于视网膜神经节细胞（RGCs）对Mn2+的摄取及其沿视神经（ON）的运输在MnCl2剂量为15 nmol时已达到饱和，因此该操作可最大限度减少因注射体积轻微不准确导致的信号差异。若需双侧视觉通路信号增强，应重复上述操作对左眼进行注射。
- 操作结束后，单次使用含氧氟沙星（3 mg/ml）的眼药水及含泛醇的眼膏，以预防眼部感染和角膜干燥。将小鼠放回饲养笼，维持常规饲养条件，直至开始磁共振扫描。
2. 磁共振成像的动物准备
- 通过给予2%/98%异氟烷/氧气混合气体麻醉小鼠。将小鼠固定在小鼠固定装置上，保持近乎水平且无扭曲的体位。将其插入MR线圈中，然后将线圈调整至MR扫描仪内。通过适当的系统监测呼吸和心率。技术细节参见Herrmann et al20。
- MRI扫描期间，通过连接至小鼠头部固定装置的集成管路，经蒸发器持续输送初始浓度为1.5%/98.5%的异氟烷/氧气混合气体以维持麻醉。扫描过程中，根据记录的生命体征参数（即目标为维持约每分钟40次的稳定呼吸频率）调节麻醉深度。使用加热装置，通过置于小鼠腹部的温度传感器监测，使体表温度稳定维持在35至37 °C之间。技术细节参见Herrmann et al17。
- 扫描结束后，将小鼠从固定装置中取出，并供给纯氧以加速从麻醉状态恢复。此外，使用红色光源加热装置维持体温稳定。
3. MRI 方案
- 本方案适用于配备专用高信噪比小动物线圈（线性偏振利兹线圈）的3特斯拉扫描仪，该线圈有效视野为直径35 mm × 38 mm。将线圈设置为发射-接收模式运行。
- 将动物置于最终位置后，借助频率分析仪调节线圈的调谐与匹配。手动调节发射参考电压和匀场电流，以优化图像均匀性与质量。
- 获取矢状面和横断面的T1加权二维TSE图像用于扫描规划，分辨率为0.5 mm × 0.5 mm × 2 mm。根据规划用MR扫描图像，在冠状面测量方向上采集MEMR图像，并旋转至与动物头部平行，相位编码方向沿左右方向。为缩短采集时间，使用根据实际头部尺寸调整的矩形视野。采用扰相3D FLASH序列（VIBE 3D），参数如下：基础矩阵256，视野54 mm × 50.65 mm × 14.08 mm，在相位编码方向使用93.8%矩形视野，共128层，层厚0.11 mm，层分辨率设为61%。
- 启用平面内插值，生成最终图像尺寸为512 × 480 × 128，有效分辨率为0.21 mm × 0.21 mm × 0.18 mm（插值后为0.1 mm × 0.1 mm × 0.09 mm），回波时间TE = 6.51 msec，重复时间TR = 16 msec，带宽 = 160 Hz/px，翻转角 = 22°。采用两次信号平均和三次重复，使总采集时间（TA）约为30分钟。
4. MRI 数据分析
- 使用软件 syngo fastView 分析数据。为进行信号增强的定量分析，在二维平面 MRI 记录图像中选择定义的感兴趣区域，测定增强结构的信号强度（SIMEMRI）、组织背景信号强度（SIbackgr）以及噪声的标准差（SDN）。必要时，可参考小鼠脑图谱以辅助定位外侧膝状体（LGN）和上丘（SC）的神经解剖结构。使用以下公式计算对比度-噪声比（CNR）：
- CNR = (SIMEMRI– SIbackgr) / SDN
- 对每个样本的连续三幅图像进行定量分析，计算平均 CNR。对于双侧注射的动物，应分别独立分析两侧半球。
- 为展示横断面、冠状面和矢状面图像，需基于原始三维 MRI 数据集进行多平面重建。这些处理后的图像不建议用于定量分析。为生成视网膜-顶盖投射的三维动态重建图像（最大强度投影，MIPs），请使用血管造影后处理软件模块。
5. Mn2+ 自动金属染色法（TIMM 染色）
- 为在MEMRI后对Mn2+示踪的脑结构进行TIMM染色，成像前24小时经静脉注射15–150 nmol的Mn2+ ivit。
- MRI扫描后，用30 ml冰冻的含0.325% Na2S的PBS（pH 7.4）灌注动物，解剖视网膜并将其样本在冰冻切片机中冷冻。
- 在冰冻切片机上连续切取厚度为15 µm的等距赤道切面。
- 根据Angenstein et al22的方法，在无固定剂和冷冻保护剂的条件下进行TIMM染色21。
6. 统计学分析
单次比较采用 Student's t 检验进行统计分析，随后进行事后 ANOVA 检验。数据以均值 ± 标准误表示。每个实验的独立样本量（N）分别注明。结果中 P ≤ 0.05 视为具有统计学显著性（P ≤ 0.05，*；P ≤ 0.01，**；P ≤ 0.001，***）。
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结果
该成像技术准确评估视觉投射通路活力与功能的能力，依赖于向玻璃体腔精确施用无毒剂量的 Mn2+ 并由视网膜神经节细胞（RGCs）摄取。这一关键假设在图1中通过自显影金属染色法（TIMM 染色）21验证了 Mn2+ 的层特异性摄取。在玻璃体内（ivit）注射 15 nmol 或 150 nmol Mn2+ 或作为对照的 PBS 后 24 小时，对视网膜切片进行分析。在此时间点，注射 Mn2+ 的视网膜在 T1 加权 MRI 中显示出最大信号增强（N = 3；虚线），而注射 PBS 的视网膜无信号增强（N = 3；虚线）（图1，左图）。注意 150 nmol 注射眼出现的高信号增强。相比之下，非增强的脑区（星号标记）在所有条件下均显示相似的背景信号强度（绿色）。ivit 注射 Mn2+ 显著增强了整体 TIMM 染色，尤其在 RGC 层和神经纤维层（NFL）中更为明显（图1...
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讨论
视觉系统MEMRI技术拓展了传统神经生物学方法，可用于评估正常及病理条件下的功能状态。除了能够提供关于孤立中枢神经系统纤维束完整性的独特信息外，MEMRI还可便捷地与行为学测试相结合， 例如，验光及基于视觉的水迷宫任务，以研究特定范式对视觉感知的即时影响。同时，将电生理学与组织学研究与视觉功能表征相结合 体内该技术具有高度的可靠性和可重复性，在相同组别内个体间差异较小（见误差棒） 图3、图4）。有趣的是，在15 nmol剂量下，Mn2+ 摄取和轴突运输是饱和过程，因此信号增强会达到一个平台期，无法通过额外添加 Mn 进一步提高2+ 供应9从实际应用的角度来看，这种剂量-反应特性在一定程度上最小化了与注射相关的信号增强变异。值得注意的是，本文提供的关于Mn剂量及其动力学的数据2+ 信号增强在小鼠中具有特异性，且不同于大鼠，后者需要大约10-20倍的增强 较高的 Mn2+ 剂量和延长潜伏期（36 小时）以达到最佳对比度增强13,23...
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。
致谢
A.K. 获得奥本海姆基金会资助，R.H. 获得韦卢克斯基金会资助。我们感谢 I. Krumbein 提供的技术支持和 K. Buder 提供的组织学支持，以及 J. Goldschmidt（德国马格德堡莱布尼茨神经生物学研究所）在TIMM染色技术方面的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M 氯化锰（II）溶液 | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI 对比剂 |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% 盐酸奥布卡因 |
| Floxal 滴眼液 | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml 氧氟沙星 |
| 泛醇软膏 | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| 水合氯醛 | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420–450 mg/kg 体重 |
| Hamilton 注射器 | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, 无 NDL |
| 34 G 针头（34/35/pst4/tapN） | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | 可拆卸针头 RN，34 G，长度 38.1 mm，尖端类型 4 |
| 双目解剖镜 Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3 T 磁共振成像仪 Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| 大鼠头部线圈 | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| 小鼠固定装置 | 定制 | ||
| 红光灯 | |||
| 冷冻切片包埋剂 NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | 用于冷冻切片的组织包埋 |
| 一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O） | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | 用于硫化物灌注 |
| 九水合硫化钠（Na2S·9H2O） | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| 阿拉伯树胶 | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | 用于 TIMM 染色 |
| 对苯二酚（C6H6O2） | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| 柠檬酸（C6H8O7） | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| 二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O） | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| 硝酸银（AgNO3） | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 |
参考文献
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