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方法文章

神经元致密核心囊泡的超分辨率成像

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DOI：

10.3791/51394

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2014年7月2日

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Lewis & Clark College, 2Program in Biochemistry and Molecular Biology, Lewis & Clark College, 3Jungers Center for Neuroscience Research, Oregon Health & Science University, 4Department of Chemistry, Lewis & Clark College

本文内容

摘要

我们介绍了如何在固定的培养神经元中实施基于光激活定位显微镜（PALM）的囊泡研究。本方案的关键步骤包括：使用光转化嵌合蛋白标记囊泡，利用超分辨率显微成像系统采集稀疏采样的原始图像，以及对原始图像进行处理以获得超分辨率图像。

摘要

荧光检测为现代生物学和医学应用中广泛使用且快速发展的多种显微技术奠定了基础。荧光技术的优势包括高灵敏度、高特异性和适用于活体成像。然而，传统的荧光显微技术存在一个主要缺陷，即成像平面中受衍射极限限制的分辨率，这阻碍了对尺寸小于约250 nm的结构的研究。近年来，随着超分辨率荧光显微技术（如光激活定位显微技术，PALM）的出现，这一限制已被克服。与传统方法不同，PALM能够获得数十纳米级别的横向分辨率。因此，现在可以利用荧光技术及其众多优势，揭示细胞结构与组织中一系列以往无法观测的特性。

遗憾的是，光激活定位显微镜（PALM）的实施并非易事，成功的策略通常需要根据所研究系统的类型进行定制。在本文中，我们展示了如何在固定的培养神经元中开展针对囊泡结构的单色PALM研究。PALM非常适用于研究尺寸通常在~50-250 nm范围内的囊泡。我们方法的关键步骤包括：用可光转换（由绿色转为红色）的囊泡内容物融合蛋白标记神经元，利用超分辨率显微成像系统采集稀疏采样的原始图像，并对原始图像进行处理以生成高分辨率的PALM图像。我们还通过展示培养的海马神经元中致密核心囊泡（DCVs）的极高分辨率图像，验证了该方法的有效性，这些结果否定了“DCVs的突触外运输主要由DCV簇介导”的假说。

引言

许多细胞过程依赖于生物分子通过囊泡介导的运输，准确而高效地转运至特定的亚细胞区域。一个典型的例子是突触组装，该过程发生前，突触组分需通过囊泡从神经元胞体内的生物合成位点，长距离转运至可能位于远端的突触前和突触后位点1。

荧光显微镜是一种研究囊泡运输的强大且广泛使用的方法。该技术的优势包括高灵敏度、高特异性以及适用于活体成像2。然而，直到最近，该技术一直存在一个主要缺陷，即受衍射极限分辨率的限制2，这阻碍了对尺寸小于约250 nm的结构的研究。近年来，随着超分辨率荧光显微技术（如PALM3）的出现，荧光显微镜的横向分辨率已突破衍射极限。PALM的横向分辨率可达数十纳米，非常适合研究尺寸通常在~50–250 nm范围内的囊泡4。因此，现在可以利用荧光技术及其众多优势，揭示以往难以观测的囊泡多种特性，包括其向特定亚细胞位点运输的某些方面。

实现光激活定位显微镜（PALM）并非易事，成功的策略通常需要根据所研究系统的类型进行定制。本文介绍了如何对囊泡结构开展PALM研究，并以海马神经元中的致密核心囊泡（DCVs）为例，展示了我们方法的有效性。特别是，我们利用PALM来验证一个假设：在海马神经元中，DCVs向突触的运输是由DCV簇介导的5-8。

在发育中的神经元中，囊泡通过簇介导的方式运输至突触是一种引人关注的可能性，因为它可能促进突触的快速稳定与组装9,10。支持致密核心囊泡（DCV）成簇运输的研究者指出，含有外源性DCV cargo的细胞外突触荧光斑点在图像中表现出较大的表观尺寸，这被作为支持成簇现象的证据6。然而，这些荧光斑点出现在基于衍射极限荧光显微技术所获得的图像中，而此类技术无法有效区分由衍射效应引起的尺寸表观增大与真正由成簇导致的尺寸增大。

为了解决这一问题，我们采集了表达靶向DCVs的嵌合蛋白的海马神经元的常规宽场荧光图像和PALM图像。对这些图像的分析表明 >在常规图像中，92%的假定细胞外突触DCV簇被解析为80 nm（单个DCV尺寸）11 PALM 图像中的点状结构。因此，这些数据在很大程度上否定了发育中海马神经元内致密核心囊泡（DCVs）的聚类假说。

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方案

1. 样品制备

  1. 使用标准的分子生物学技术，制备编码靶向致密核心囊泡（DCVs）的光转化或光激活嵌合蛋白的DNA。
    注意：一种可行的选择是编码组织型纤溶酶原激活物-Dendra2嵌合蛋白（tPA-Dendra2）的DNA。Dendra2是一种光转化蛋白，在紫外光照射下可由绿色荧光转变为红色荧光12。
  2. 按照标准方案13，将海马神经元培养在高性能#1.5盖玻片上约5-10天。
  3. 使用阳离子脂质试剂转染发育中的海马神经元。
    注意：对于成熟神经元，病毒介导的感染效率更高。该替代方法已在其他文献中详细描述14。
    1. 准备一个1.5 ml离心管，加入约1 µg DNA和250 µl最低必需培养基（MEM），另准备一个1.5 ml离心管，加入4 µl阳离子脂质试剂和250 µl MEM。
    2. 将两种溶液分别孵育5分钟。
    3. 将两管溶液混合，并将混合液再孵育30分钟。
    4. 孵育期间，准备一个培养皿，加入数 ml 已预热至37 °C的培养基。
    5. 轻柔地将含有神经元的盖玻片转移至含温热培养基的培养皿中，并加入转染混合液。
    6. 轻轻倾斜培养皿，然后将其置于37 °C培养箱中孵育90分钟。
    7. 将神经元放回其"原培养皿"，静置约12-18小时。
  4. 在37 °C预热的含4%多聚甲醛和4%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中固定细胞45分钟。
    注意：在光激活定位显微镜（PALM）实验中，良好的超微结构保存至关重要，而通常用于免疫荧光染色的标准甲醛固定方案通常不足以满足此要求15。结构保存不佳的一个重要原因是固定时间不足，因为甲醛固定涉及加合物形成和蛋白质交联，而后一过程进行得较慢16。45分钟的固定可有效缓解这一问题，且未观察到过度固定导致的荧光明显损失。
  5. 用滤过的PBS洗涤盖玻片约10次。
    注意：此步骤可减少荧光污染物。固定后应尽快成像。在此期间，将细胞置于4 °C、避光容器中的滤过PBS中保存。
  6. 将含有神经元的盖玻片置于含滤过PBS的成像 chamber 中。
    注意：样品必须置于水性介质（如PBS）中进行成像，且该介质的折射率需低于玻璃，以便实现全内反射荧光（TIRF）照明。TIRF照明非常有用，因为它仅激发靠近盖玻片的荧光分子，从而显著降低背景荧光17。

2. 图像采集

  1. 打开超分辨率成像系统。
    1. 打开弧光灯。
    2. 翻转 "系统/个人电脑" 和 "组分" 电源遥控开关上的开关 "开启。"
    3. 打开计算机（在显微镜控制平板电脑/对接站启动之后）。
      注：该对接站可用于控制和监测光学系统及光路的多种属性，特别是物镜的选择和聚焦。
    4. 双击软件图标并选择 "启动系统" 登录对话框中的选项。
  2. 检查样品。
    1. 打开激光安全柜的前部和顶部防护面板。
    2. 倾斜透射光 轻臂以接触载物台和物镜。
    3. 在 alpha Plan-Apochromat 100X 数值孔径/NA = 1.46（TIRF）物镜上滴加镜油。
      注意：可使用63倍高数值孔径物镜替代100倍物镜。
    4. 将样品置于载物台上，并升高物镜靠近样品。
    5. 使用对接站的 XYZ 功能监测镜头位置。当镜头接近焦点位置时停止（例如，z ≈ 2.50 mm。
    6. 完全关闭检修面板。
      注意：为启用激光安全功能。
    7. 使用目镜和“定位”选项卡中的按钮微调焦距。
      注意：定位选项卡提供用于产生弧光灯照明的按钮，并支持通过目镜直接观察样本。同样，采集选项卡提供用于产生激光照明的工具，并支持相机进行图像采集。
      1. 转到定位选项卡，选择 "转染开启。"
      2. 单击目镜扩展符号。
        注意：这将显示光路示意图。可通过左键单击示意图中的相应图标，或使用对接站上的触摸屏来调整光路的属性。例如，可通过点击反射镜转轮图标选择适合观察 Dendra2 发射光的滤光片。
      3. 观察目镜，并以对接站为参考，调节焦距使细胞清晰。
        注意：由于海马神经元转染难度较大，样本中荧光细胞数量会非常稀少，因此使用反射照明对焦可能会有一定困难。若出现此情况，可改用透射照明，并参考对接站的 z 轴读数作为对焦引导。
      4. 切换光源 "关闭" 聚焦后。
  3. 选择一个荧光较亮、呈现点状荧光且具有典型形态、表明细胞状态良好的细胞。
    1. 选择反射光及适用于观察Dendra2绿色发射的滤光片。
    2. 使用低强度激发光扫描盖玻片，寻找表达 Dendra2 融合蛋白的细胞。
  4. 切换到采集选项卡。
    1. 使用 "实验管理员" 加载一个设计合理或易于修改的PALM采集配置。
      注意：若尚无此类实验，可参考以下设置设计初始实验配置：激光功率滑块：405 nm（约0.01%，适用于50 mW激光器）；488 nm（约3%，适用于100 mW激光器）；561 nm（约40%，适用于100 mW激光器）；曝光时间：约50毫秒；相机增益：约200；多维采集：时间序列（循环次数 = 30,000，时间间隔 = 0）；通道设置：488 nm采用落射照明，561 nm采用基于全内反射荧光（TIRF）的照明（见步骤2.5.1）；物镜：100倍（数值孔径NA = 1.46）；TIRF角度滑块：入射角约67–72°；像素尺寸：100 nm；视野范围：TIRF（其他选项会产生更高的激光强度，适用于更难漂白的荧光染料）。
    2. 点击 "是" 当弹出菜单出现并询问是否开启激光器时。
  5. 将细胞的图像在相机焦平面上调至清晰。
    1. 选择488 nm落射照明激光通道。
      注意：轨道（track）是指成像过程中使用的光束配置。此处，轨道名称由激发波长决定，该波长产生的发射光被传递至相机。例如，561 nm轨道同时使用405 nm和561 nm激光线，但滤光立方体仅允许由561 nm光激发的光转化Dendra2所发出的荧光传递至相机。
    2. 使用相机对细胞图像进行对焦 "连续的" 采集按钮
  6. 采集常规的宽场图像。
    1. 使用 "快照" 按钮
    2. 通过以下步骤保存图像： "文件" 菜单并选择 "保存/另存为"
  7. 建立基于全内反射荧光（TIRF）的照明系统。
    1. 选择488通道并切换至 "TIRF" 使用EPI/TIRF按钮。
    2. 选择 "连续的" 采集
    3. 调节基于全内反射荧光（TIRF）的照明滑块。
      注意：当背景突然变暗，且样本可在单一平面上聚焦时，即实现全内反射荧光（TIRF）18如果通过向样品内部调焦发现新的特征，则说明入射角过低，因为在全内反射荧光显微镜（TIRF）中只有一个焦平面。
    4. 使用405 nm激光通过561通道重新检查TIRF角度 "关闭。"
    5. 重新打开405 nm激光器 "开启" 在开始PALM实验之前。
  8. 采集PALM数据。
    1. 击中 "开始实验。"
      注意：如有需要，可打开 "在线处理选项" 标签并检查 "在线处理PALM" 和 "拟合高斯二维" （在开始实验前）监测原始数据采集过程中重建的PALM图像，以评估数据质量，从而判断是否值得继续进行这一相对耗时的数据采集过程。
    2. 视觉监测光转化过程。
    3. 当Dendra2光转化效果减弱时（通常在获取约10,000张原始图像后），增加405 nm（光转化）激光的强度。
    4. 如果光转换信号增强，则继续实验；否则，通过按下按钮终止实验（数据不会丢失）。 "停止" 当前步骤按钮。
    5. 数据采集完成后（约15分钟后）保存图像。

3. 图像处理、显示与分析

  1. 若未进行在线处理，则处理已保存至磁盘的原始图像。
    1. 点击处理选项卡，打开方法选项卡，然后选择 "光激活定位显微镜"
    2. 选择 "光激活定位显微镜" 再次从四个子选项中选择。
    3. 转到文件菜单，打开并查看目标文件，然后点击 "选择。"
    4. 命中 "应用。"
      注意：这将使用默认选项启动峰/荧光团识别及峰定位。如有必要，也可使用以下方法对峰进行分组 "PAL-Group" 分组功能会将连续若干帧中出现的、且峰坐标足够相近的峰分配给同一个分子。此外，可使用软件的基于模型的漂移校正选项对数据进行样本漂移校正。
  2. 在峰定位数据中滤除定位不佳和采样不足的组分。
    1. 弃去定位精度（σ）较差的荧光染料 >35 nm，使用 "PAL-滤光片" 工具。
    2. 弃去荧光峰之间平均距离 d 过大、无法分辨直径为 D 的囊泡的区域中的荧光染料。
      1. 提取平均定位精度， σ 从定位精度直方图中。
      2. 基于 σ 和香农-奈奎斯特准则计算 d 的最大可接受值19，如分辨率近似中所体现的20 R = D = [(2.35σ)2 +（2天）2]1/2.
      3. 设置阈值 "去除 PALM 异常值" 用于删除被少于 πD 个峰包围的峰的工具24天2) 半径为 D/2 的圆内的邻近点。
    3. 使用处理后的PALM数据生成PALM图像 "PAL-渲染" 工具；参见 图1.
    4. 通过选择来量化尺寸和间距 "简介" 功能。
      1. 检查相关的线条和表格选项，并在图像中沿所需方向绘制线条。
      2. 通过测定半最大强度处的全宽来量化直径。
      3. 通过测定强度分布曲线的峰间距离来量化分离程度。

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结果

图1展示了一种成像与处理的最终结果。在此PALM图像中，定位的荧光分子的横向坐标采用质心显示模式呈现，而相关DCV的超分辨率图像则采用高斯显示模式呈现。

图2A 显示八天大的神经元胞体及近端突起的宽场与PALM图像 体外 表达 tPA-Dendra2 的海马神经元。图像的重要特征包括（1在传统图像与PALM图像中，点状信号之间存在广泛的、一对一的对应关系和重叠，2) PALM 斑点的尺寸显著更小，以及（3偶尔可将一个宽场荧光点分辨为多个PALM荧光点。

图2B 显示了表达 tPA-Dendra2 的第二个海马神经元的部分突起中致密核心囊泡（DCVs）的 PALM 图像。该图像的重要特征包括：(1) 簧点直径较小且外观均一，以及 (2) 很少观察到紧密相邻的簧点/推测的 DCV 簇。

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讨论

光激活定位显微镜（PALM）及相关超分辨率荧光显微技术最近已成为传统光学显微镜和电子显微镜（EM）22-24 的有力补充。PALM 的优点包括样品制备相对简单，对样品的干扰较小。理论上，PALM 还可用于研究活细胞。PALM 最主要的缺点可能是数据采集耗时较长，这显著限制了其在活细胞中快速动态过程研究中的应用。此外，PALM 技术相对较新，因此适用于样品制备、数据采集与分析的高效、稳定的荧光探针及相应实验方案尚未完全建立和/或充分记录3。

本文描述了一种适用于固定培养细胞中囊泡的单色PALM研究的实验方案。该方案也为开发类似方向的双色PALM研究提供了良好的起点。我们的PALM数据的两个关键特征支持了该方案的有效性。首先，在重建的PALM图像以及互补的宽场图像中，斑点的分布非常相似。在分布上的一个显著差异是：PALM偶尔能将衍射极限下的斑点分辨为多个斑点，这反映了PALM分辨率的显著提高，进一步突显了该技术的有效性与实用性。

其次，我们的PALM结果与其他相关结果高度一致或相符。例如...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院基金 2 R15 GM061539-02（资助 B.A.S.）、2 R15 NS40425-03（资助 J.E.L.）、MH 66179（资助俄勒冈健康与科学大学 Gary Banker 博士）支持  & 科学 俄勒冈健康与科学大学）、P30 NS061800（授予俄勒冈健康与科学大学Sue Aicher博士）。我们感谢Barbara Smoody在海马神经元培养方面的大力支持，感谢Brian Long博士和James Abney博士对本手稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Zeiss PALMCarl Zeiss, Inc.Elyra PS.1配备 Zeiss Efficient Navigation (ZEN) 软件和荧光滤光片组 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 
Lipofectamine 2000 转染试剂Life Technologies11668-019
最低必需培养基Life Technologies11095-080
磷酸盐缓冲液Life Technologies10010049
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences19208
蔗糖Sigma-AldrichS-8501
生长用玻璃盖玻片 18 mm 1.5DFisher ScientificNC0059095

参考文献

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