本视频展示了小鼠动脉内膜斑块形成的两种模型，并重点强调了肌性内膜增生与动脉粥样硬化之间的差异。
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方法文章
在小鼠中诱导血管内膜增生与动脉粥样硬化：两种有效模型的介绍
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
已建立多种用于诱导动脉狭窄的体内实验啮齿类动物模型，以模拟诸如缺血性心脏病中所观察到的动脉斑块形成和狭窄等疾病。本文介绍了两种高度可重复的小鼠模型——两者均导致动脉狭窄，但分别基于不同的发病机制。这些模型代表了动脉狭窄的两种最常见病因，即分别展示用于研究内膜下平滑肌细胞增生（肌性内膜增生）和动脉粥样硬化的各一种小鼠模型。为诱导肌性内膜增生，采用球囊导管损伤腹主动脉的方法；为诱导动脉粥样硬化斑块形成，则采用载脂蛋白E基因敲除（ApoE -/-）小鼠联合西方高脂饮食的方法。本文还列出并描述了针对不同模型结果的多种适应性测量与评估方法。通过介绍并比较这两种模型，为科研人员根据具体科学问题选择合适的动脉狭窄模型提供了参考依据。
引言
在工业化国家，缺血性心脏病仍然是导致死亡的主要原因1。冠状动脉狭窄的原因多种多样，包括血管内膜增生和动脉粥样硬化，其中血管重建仍是目前最常用的治疗策略2。为了研究动脉斑块形成过程中的病理生物学和病理生理学机制，迫切需要能够明确区分内膜增生与动脉粥样硬化各自作用通路的研究模型。本视频介绍了两种不同的小鼠模型，分别用于研究血管内膜增生或动脉粥样硬化的发生发展过程。
人们推测，中膜-内膜增生通过最初为动脉粥样硬化提出的“损伤反应”范式形成3。内皮层的机械性破坏导致强烈的组织重塑，这一过程受到旁分泌效应的增强。目前有多种常用的动物模型用于研究中膜-内膜增生。一些研究团队在大鼠的升主动脉中使用金属装置4。利用球囊导管进行主动脉去内皮化的模型也在实验室大鼠中被广泛使用5,6。在实验小鼠中建立的内膜增生模型7则通过结扎颈动脉来诱导中膜-内膜病变8。在我们的实验室中，常采用腹主动脉去内皮化模型——用于研究中膜-内膜增生的发展过程——以及人源化支架再狭窄模型9。本视频强调，选择合适的实验动物模型对于动脉狭窄的机制性或病理生理学研究至关重要。
内膜增生模型必须与动脉粥样硬化模型相区分。后者通常采用载脂蛋白E缺陷（ApoE -/-）小鼠联合西方饮食诱导动脉粥样硬化病变10,11,12,13。本文展示了在小鼠中诱导这两种类型内膜病变的示例，并介绍了针对不同模型优化的血管狭窄分析方法14。
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方案
所有动物实验均应遵循相关的动物护理指南。在开始实验方案之前，须获得机构对动物实验的批准。
1. 血管中膜增生模型（A）
对于内膜增生模型，购买8周龄、体重约25 g的C57BL/6J（货号000664，C57BL/6J）小鼠。将用于实验的小鼠饲养在常规条件下，给予标准小鼠饲料并提供饮水 随意摄取.
- 小鼠准备： 使用异氟烷（2%）通过诱导室将小鼠引入麻醉状态。
- 使用毛发修剪器去除腹部毛发，将小鼠仰卧放置，并用面罩覆盖其鼻部和口部以维持麻醉。
- 用聚维酮碘对腹部区域进行广泛消毒，随后使用80%乙醇，重复两个循环。
- 通过夹捏后肢检查反射消失，以确认麻醉深度足够。
- 沿腹白线分两步分离皮肤和肌肉，以暴露 腹腔器官。
- 将肠管置于用生理盐水润湿的手套中，并用手套包裹肠管以保持其湿润。
- 仔细清除覆盖在腹主动脉表面的脂肪组织，暴露肾下主动脉至其分叉处，注意避免损伤任何分支血管。
- 首先，在近端肾下主动脉处放置一个显微外科夹，以阻断血流；随后，在主动脉分叉附近放置第二个远端血管夹。
- 当血流完全阻断后，在靠近近端血管夹处的主动脉上做一个小切口。
- 插入已用0.9%生理盐水润湿的球囊导管，并将其向前推进至主动脉远端血管夹处。
- 为造成内皮损伤，缓慢充盈球囊并小心地将导管向近端血管夹方向回拉，以剥离内膜。
- 重复该去内皮操作两次。
- 移除导管，并使用10-0聚丙烯连续缝合关闭主动脉切口。
- 小心打开远端血管夹。若主动脉切口处出现出血，应重新夹闭，找到出血点并根据需要加缝间断缝线止血。
- 若未见出血，缓慢打开近端血管夹。
- 切口远端应可观察到主动脉搏动。此时可将肠管复位至原位（in situ）。
- 使用预温的无菌生理盐水冲洗腹腔。
- 从肌层开始，使用6-0聚丙烯连续缝合关闭腹壁。
- 随后使用5-0聚丙烯连续缝合缝合皮肤。
- 在小鼠仍处于麻醉状态下，通过皮下注射给予4–5 mg/kg 卡洛芬（Carprofen）。
- 将安乃近（Metamizol）加入饮水中（每100 ml水中含50 mg Metamizol），用于术后镇痛，并持续使用3天。密切监测动物恢复情况。
注意：本模型的观察周期为28天。
2. 动脉粥样硬化模型（B）
对于动脉粥样硬化模型，购买载脂蛋白E缺陷型（ApoE -/-）小鼠（货号 002052，B6.129P2-Apoetm1Unc/J) 在年龄为 4 周，随后喂养 4–6 个月。实验所用小鼠在常规条件下饲养；小鼠到达后即开始喂食高脂西方饮食（Harlan Laboratories TD.88137），并自由饮水 随意摄取 持续4到6个月。
- 小鼠准备：
- 从4周龄开始，用西方饮食喂养ApoE -/- 小鼠 。饮食干预应在小鼠到达后立即开始。
- 在整个实验期间持续维持西方饮食。
3. 分析
- 内膜增生模型（A）
该模型中的感兴趣区域为“病变区域”。可选的分析指标包括管腔闭塞程度、内膜/中膜比值（I/M比值）、最大内膜厚度、内膜面积、采用三色染色法评估纤维化，以及采用苏木精-伊红（H&E）染色法评估单核细胞浸润情况（如图1A-1C所示）。根据具体科学问题，还可应用多种其他染色方法，例如苦味酸天狼星红染色（Picrosirius red）检测胶原、免疫组织化学染色以及共聚焦显微技术。 - 动脉粥样硬化模型（B）
该模型中的感兴趣区域包括主动脉瓣、主动脉弓以及降主动脉。可选的分析方法包括苏丹红染色检测脂质沉积，以及对主动脉瓣、主动脉弓和降主动脉进行三色染色（如图1D所示）。
该模型同样适用于多种其他染色方法，例如油红O染色检测中性脂质、苦味酸天狼星红染色、免疫组织化学染色以及共聚焦显微技术。- 苏丹红染色：对新鲜获取的主动脉组织进行苏丹红染色。
- 在取材前6小时停止喂食高脂饮食。
- 使用异氟烷（2%）通过诱导室将小鼠麻醉。通过夹捏后肢检查反射是否消失，以确认麻醉深度足够。
- 打开胸腔；剪除心脏心尖部，并经左心室灌注，先用生理盐水（3 ml），随后用4%多聚甲醛（PFA，3 ml）经主动脉根部灌注以固定主动脉。
- 从主动脉根部至其分叉处游离主动脉，尽可能去除周围脂肪组织。
- 剪下心脏和主动脉根部，置于4% PFA中保存，用于组织学分析。
- 进行组织学处理时，需将主动脉根部小心地以直立位置包埋于石蜡块中，以便切片时能获得包含全部三个瓣叶的切片。
- 将主动脉树的一端剪开，并用细针将其固定在硅胶层上。沿纵轴切开主动脉并展平固定组织。
- 用50%乙醇冲洗组织，然后将组织浸入苏丹III染色液中约15分钟。
- 用50%乙醇轻轻冲洗，以去除多余的苏丹III染料（注意：50%乙醇可能洗脱染料）。再用dH2O冲洗，并拍摄照片用于后续分析。
- 苏丹红染色：对新鲜获取的主动脉组织进行苏丹红染色。
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结果
图1展示了两种模型的不同分析选项及其诱导的疾病状态。对于内膜增生模型，显示了三色染色代表性横切面的分析结果。通过这些横切面可测量并计算内膜/中膜比值（I/M比值）、斑块最大厚度、管腔内最大内膜厚度、管腔闭塞百分比以及斑块面积等指标。
为了评估动脉粥样硬化模型的结果，可使用上述所有方法。此外，还可通过三色染色法测量腹主动脉中的斑块面积定量值，以及主动脉瓣、主动脉弓和降主动脉处斑块形成的范围。
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讨论
尽管这两种疾病在患者中引起的症状相似，但其斑块形成的潜在机制以及相应的治疗方法却大不相同2。在不同类型的动脉狭窄中，患者的临床表现以及斑块形成的时间进程均取决于其潜在的发病机制。
根据患者的临床表现，必须采用不同的样本分析方法5,15。需要根据所选模型模拟的疾病特征性表现来调整分析方法14。反之，根据所研究的疾病，应选择最可行且合适的动物模型。此外，新药的作用机制必须与模型相匹配。
本文介绍的两种模型均操作简便、快速，且具有高度可重复性。这两种模型之间存在一些主要差异。例如，肌性内膜增生模型的观察时间为28天16，而动脉粥样硬化斑块的形成则需要四到六个月17。
另一个主要区别在于对不同小鼠品系的适用性。动脉粥样硬化模型依赖于小鼠中的 ApoE -/- 或 LDL -/- 基因型，因此只能在携带这种特定基因敲除的小鼠中进行。构建同时携带 ApoE -/- 和其他目标...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Christiane Pahrmann提供的技术支持。S.S.获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）（项目编号：SCHR992/3-2 和 SCHR992/4-2）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3% 硫乙醇酸盐肉汤 | Fluka | 70157 | 粉末 |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| 苏丹III染色液 | Sigma Aldrich | S4131 | 粉末 |
| 小鼠 C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| 小鼠 ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| 西方饮食 | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| 毛发剪 | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | 异氟烷 | |
| 显微外科钳 | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| 钳夹施加器 | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| 导管 | |||
| 10-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 788G | |
| 6-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 Prolene 缝线 | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 卡洛芬 | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | 安乃近 |
参考文献
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重印与许可
