可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

摘要

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。

摘要

满足基础研究和临床研究应用需求的抗体需求量很高，并且未来将急剧增加。然而，传统的单克隆抗体技术显然已无法单独胜任这一任务。这促使人们开发出替代方法，以满足针对整个可及蛋白质组元件的高质量、可再生亲和试剂的需求。为此，已设计出用于从噬菌体展示的合成抗体文库中进行高通量筛选的方法，适用于多种抗原，并针对快速通量和高成功率进行了优化。本文详细描述了一种实验方案，通过视频演示，展示了如何利用手动96通道液体处理仪或自动化机器人系统，从高多样性文库中平行筛选出针对数百个靶标的Fab-噬菌体克隆。采用该方案，单个研究人员可在6至8周内生成数百种抗原，平行筛选出相应抗体，并完成抗体结合能力的验证。本文重点强调了以下四个方面：i）一种可行的抗原形式；ii）筛选前的抗原表征；iii）影响特异性及高亲和力克隆筛选的关键步骤；以及iv）监测筛选效率和早期抗体克隆表征的方法。通过该方法，我们已获得针对多种靶标类别的合成抗体片段（Fab），包括单次跨膜受体、分泌型蛋白激素以及多结构域胞内蛋白。这些片段可轻松转化为全长抗体，并经验证具有高亲和力和高特异性。此外，这些抗体片段已在多种标准免疫检测中证实具有功能性，包括Western印迹、ELISA、细胞免疫荧光、免疫沉淀及相关检测。该方法将加速抗体的发现进程，并最终推动实现针对整个蛋白质组生成可再生、高质量抗体的目标。

引言

随着后基因组时代的到来，获得高质量的结合试剂以表征和调控蛋白质，对于开拓新的研究方向和治疗途径至关重要。抗体作为基础研究、诊断工具以及潜在治疗手段，对学术界和工业界的研究人员而言仍然具有关键作用。毫不奇怪，合同制抗体开发公司数量显著增长，其中大多数公司依赖传统的杂交瘤技术来制备定制抗体。然而 体外 利用噬菌体展示抗体文库进行筛选正成为一种强大的替代技术，在传统技术可能遇到局限的情况下，该技术可提供独特的优势并取得成功^{1, 2}.

鉴于科研工具对抗体质量的高要求，可再生抗体的制备面临两个主要挑战：1）筛选通量；2）抗原的可获得性。目前已有多个研究团队报道了旨在提高通量和抗体鉴定速度的体外筛选流程。这些研究详细描述了多种可行的方法，包括以全长靶标^3,4或结构相关的结构域^5,6,7为筛选对象，采用基于微珠^6,8或基于微孔板^3,4的抗原固定策略。此外，基因合成技术的广泛应用⁹使得系统性抗原制备（尤其是独立结构域）的成本显著降低，有望缓解获取足量纯化全长抗原的困难。通过将上述两种技术结合，研究人员设计出一个自成体系且可扩展的抗原制备与抗体筛选流程，能够并行分离大量表达抗原结构域的抗体，从而促进针对结构或功能相关蛋白家族的整类检测试剂的开发。

为实现这一目标，已开发出一种整合式流程，该流程结合了抗原可表达结构域的计算机预测、基因合成、高通量细菌表达抗原以及可放大的噬菌体展示抗体筛选。该流程仅需大多数生命科学实验室普遍具备的基础设备（包括可通过许可协议或材料转移协议获得的抗体文库），同时也适用于自动化操作，可用于工业化规模生产。利用本方案，可生成数百种带亲和标签的抗原结构域，并能常规性地分离出针对其中多种抗原的高特异性抗体片段。

噬菌体展示技术已展现出与多种重组亲和试剂格式的兼容性，包括 Fab、scFv 和自主 Fv 结构域，以及日益增多的小型“替代支架”（如设计的锚蛋白重复蛋白（DARPINS）、纤连蛋白（Fn）、载脂蛋白结构域等¹⁰）。本示例仅限于讨论 Fab 抗体片段的筛选，尽管这些方法可被调整用于其他类型的文库。  利用该技术，已成功筛选出对小分子标记蛋白结构域（包括转录因子结构域、SH2 结构域、RNA 结合蛋白等）具有低纳摩尔亲和力的 Fab 片段，其中许多片段可结合全长蛋白，并在免疫荧光、免疫沉淀和免疫组织化学等免疫检测中具有功能。重要的是，这些重组结合克隆具有完全可再生性，可通过细菌表达系统从表达载体中重新制备，从而提高一致性、可重复性和成本效益，因此证明了严格克隆验证所需投入的合理性。

在本实验方案及配套视频中，展示了利用固定化抗原结构域从噬菌体展示文库中筛选抗体的基本方法。该方法采用通过被动吸附固定于微孔板中的GST标签蛋白结构域，尽管其他标签^11,12,13和筛选形式^13,14,2也已成功应用。文中详细阐述了筛选实验设置与操作过程中的关键考虑因素，并对筛选参数进行平行监测，旨在识别和分离特异性富集的单克隆抗体以进行后续验证。

方案

1. 抗原制备

注意：  抗原结构域可由多家商业供应商合成并克隆至适当的IPTG诱导型表达载体中。

1. 将10 ng编码DNA溶于20 µl 1X KCM中，冰上混合，加入20 µl化学感受态BL21 E. coli T1噬菌体抗性细胞，转入96孔PCR板中进行转化。
2. 将细胞与DNA混合物冰上孵育20分钟，室温 孵育10分钟，再冰上孵育2分钟，随后加入100 µl预热的含葡萄糖的超级优化肉汤（SOC）培养基进行复苏，用透气板封膜封口，在2.5 cm轨道摇床中37 °C、200 rpm振荡培养1小时。
3. 取5 µl转化后的菌液涂布于添加羧苄青霉素（100 µg/ml）的Luria-Bertani（LB）/琼脂平板，过夜培养 以获得单菌落，用于制备甘油菌种。
4. 用5 µl甘油菌种接种1 ml 2YT/羧苄青霉素培养基，在2.5 cm轨道摇床中37 °C、200 rpm振荡培养12小时，使用96孔深孔板进行。
5. 将上述菌液按1:40比例稀释，接种于NZY培养基15（添加0.05%葡萄糖、2%乳糖和100 µg/ml羧苄青霉素），在2.5 cm轨道摇床中30 °C、200 rpm振荡培养6–8小时。
6. 收集菌体沉淀，使用96孔滤板进行高通量抗原蛋白纯化，每孔含100 µl Ni-NTA树脂，操作步骤参照已发表的文献方法16,17。 
7. 采用Bradford染料结合法18测定纯化蛋白浓度，并通过SDS-PAGE凝胶电泳分离10–50 µg蛋白，考马斯亮蓝染色后观察，评估蛋白分子量及纯度（见图2）。
   注意：在此阶段，可根据抗原性质及筛选流程需求，进一步采用评估蛋白聚集¹⁹或折叠状态²⁰的方法对蛋白进行表征。

2. 噬菌体文库的制备与滴定

1. 挑取单个T1噬菌体抗性E. coli菌落，接种于1 ml添加了50 μg/ml四环素的2YT培养基中。
2. 待细胞生长明显后，将菌液转接到更大体积的含50 μg/ml四环素的2YT培养基中，以确保获得足够体积的细胞用于后续感染（通常每种文库稀释液需45 µl，见下文）。
3. 通过向储存缓冲液中的噬菌体加入1/5体积的灭菌20% PEG-8000和2.5 M NaCl（PEG-NaCl），冰上孵育30分钟，使噬菌体沉淀，随后在12,000 × g条件下离心收集沉淀噬菌体，完成文库的制备。
4. 弃去上清液，将沉淀的噬菌体重悬于适量体积的1× PBS（pH 7.4）、0.2% BSA和0.05% Tween（PBT）溶液中，并根据需要调整至合适的噬菌体浓度，以确保筛选过程中具有充分的文库覆盖度。参见步骤2.9及讨论部分。
5. 在无菌多孔板中，将5 μl噬菌体等分试样加入45 μl的1× PBS（pH 7.4）中，混匀，并在相同缓冲液中进行一系列10倍梯度稀释。
6. 在另一块多孔板中，向处于对数生长期（OD₆₀₀ = 0.4–0.8）的45 μl T1噬菌体抗性E. coli细胞中分别加入5 μl各梯度稀释的噬菌体，用透气封膜封板，在37 °C、2.5 cm轨道摇床上以200 rpm振荡孵育30分钟。
7. 从每个孔中取5 μl感染后的细胞，点种于预先温育的添加了100 μg/ml羧苄青霉素的琼脂平板上，37 °C过夜培养至菌落可见。
8. 按下述方法计算总噬菌体数/ml：
   噬菌体数/ml = 羧苄青霉素平板上最稀释样品中菌落数 × 200 × 10ⁱ（其中i = 可见菌落的最大稀释级数）。
9. 为确定所需包被抗原的孔数以确保覆盖文库多样性，按以下公式计算：
   所需包被抗原孔数 =
   期望覆盖倍数 × 文库多样性
   每100 µl中的噬菌体数

3. 噬菌体展示文库中抗体的筛选

3.1）抗原固定

1. 为避免可能影响抗原质量的冻融循环并便于稀释，制备一份标准化为工作浓度100倍的储备抗原蛋白板例如， 500 g/ml）并分装至非吸附型96孔板中。  
2. 前一轮筛选前一天，用 PBS 将储备蛋白溶液从储备板中稀释，制备抗原包被板。
3. 用 PBS 将 GST 标签抗原蛋白或阴性对照蛋白（GST、BSA、中性亲和素等）稀释至 5 μg/ml，每孔加入 100 μl 包被 96 孔高吸附聚苯乙烯板。在 4 °C、250 rpm 条件下，于微量板摇床上振荡孵育过夜。
4. 从包被的微孔板中移除蛋白溶液，用200 μl封闭缓冲液（含0.2% BSA的1×PBS，pH 7.4）封闭抗原包被板和阴性筛选板，在室温下以250 rpm振荡孵育1–2小时。
5. 封闭后，使用200 µl含0.05% Tween的1x PBS缓冲液（pH 7.4，PT缓冲液），手动或借助自动酶标板洗涤仪，将已封闭的蛋白包被板洗涤四次。

3.2）文库预清除及抗原-噬菌体孵育

1. 通过将100 µl（10¹² 噬菌体）制备好的噬菌体文库转移至包被有阴性对照蛋白或游离亲和标签蛋白（例如， GST）的多个孔中，以去除非特异性（或标签特异性）结合的噬菌体展示抗体片段克隆，每种靶标对应相应数量的孔，并在室温下以250 rpm振荡孵育1–2小时。
   注意：作为另一种或附加的阴性筛选方法，也可在过量可溶性蛋白亲和标签（例如，GST，5–25 μM）存在下进行孵育，以进一步去除与标签结合的克隆，提高特异性靶标结合克隆的回收率。
2. 将阴性筛选后的噬菌体上清液转移至抗原包被的板孔中，在室温下以250 rpm振荡孵育1–2小时，以捕获特异性结合的克隆。
3. 去除未结合的噬菌体，并使用PT缓冲液对手动或使用酶标板洗板机对微孔板进行8–15次洗涤。在洗脱前彻底移除多余的洗涤缓冲液。

3.3）洗脱、感染与噬菌体扩增

1. 在筛选当天的早些时候，挑取单个对T1噬菌体具有抗性的E. coli菌落，接种至1 ml添加了50 μg/ml四环素的2YT培养基中，在2.5 cm轨道摇床或等效设备上，于37 °C、200 rpm条件下振荡培养。
2. 当菌体生长明显且肉眼可见时，加入添加了50 μg/ml四环素的2YT培养基以扩大培养体积，确保获得足够量的菌液用于后续感染（通常每孔筛选需100 µl）。
3. 继续培养菌体至OD₆₀₀达到0.4–0.8（约5–7小时），然后将100 μl菌液加入已洗涤的抗原包被板中，于37 °C振荡孵育30分钟，以洗脱结合的噬菌体。
4. 加入M13K07辅助噬菌体，使其终浓度达到1 × 10¹⁰ cfu/ml，并在37 °C、200 rpm条件下振荡孵育45分钟。
5. 将菌液转移至含有1.2 ml添加了150 μg/ml羧苄西林和75 μg/ml卡那霉素的2YT培养基的96孔深孔V型底培养块中，在2.5 cm轨道摇床上，于37 °C、200 rpm条件下过夜培养。

3.4）噬菌体的制备与多轮重复筛选

1. 在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 15 分钟，沉淀细菌。
2. 将来自重复平板的噬菌体上清液等体积混合于96孔无菌微量离心板的迷你管中，用1/10体积的中和剂中和^th 10X PBT 的体积并混匀。重复进行多轮筛选（从...开始）  步骤 3.1.1进行3-4轮，或直至观察到相较于阴性对照蛋白的富集（参见第4和第7节）。
   注意：在筛选的早期阶段，预期不会出现显著/可检测的富集（即， 第1轮和第2轮）、输入与输出噬菌体滴度的定量（详见第7节，代表性结果如图所示） 图3在确保成功筛选所需的最低噬菌体浓度方面（见讨论部分），可能更为有效，且比混合ELISA更合适。

4. 通过混合ELISA进行表征

1. 按照第 3.1 节所述，用 100 μl 浓度为 2 μg/ml 的 GST 标签抗原蛋白或阴性对照蛋白（如 GST、BSA、中性亲和素等）包被 96 孔高蛋白结合聚苯乙烯板，并在 4 °C 下振荡孵育过夜。
2. 去除多余抗原，加入 200 μl 封闭缓冲液，在室温下以 250 rpm 在微孔板振荡器上振荡封闭 1–2 小时，然后用手动或自动洗板机用 200 μl PT 缓冲液洗涤四次。
3. 加入 100 μl 噬菌体上清液（用 PBT 缓冲液稀释 1:10–1:20），在室温下以 250 rpm 振荡 15 分钟，然后用 200 μl PT 缓冲液洗涤八次。
4. 加入 100 μl 抗 M13-HRP 抗体（用 PBT 缓冲液按 1:5,000 稀释），在室温下以 200 rpm 振荡 30 分钟，随后用 200 μl PT 缓冲液洗涤六次，再用 200 μl PBS 洗涤两次。
5. 加入 100 μl 1:1 TMB 底物溶液，显色 5–15 分钟（或直至出现明显颜色），然后加入 100 μl 1 M H₃PO₄ 终止反应，并在 450 nm 处读取吸光值。
6. 通常在第 3–4 轮筛选中可观察到噬菌体文库的富集，表现为特异性结合与非特异性结合的比值>2（见图 4）。
   注意：若在亲和标签蛋白上检测到较高的绝对结合信号，表明富集了针对标签的结合物（而非靶标特异性结合物）；若在阴性对照蛋白上检测到较高的绝对结合信号，则表明富集了非特异性或“粘性”结合物。

5. 克隆筛选、测序与表征

5.1）单个Fab-噬菌体克隆的分离

1. 为分离单个克隆以进行测序和表征，感染十分之一^th 扩增的噬菌体库体积加入至T1噬菌体抗性菌株中 E. coli 对数生长期的细胞（OD₆₀₀ 在圆底微量培养板中，将 OD600 调至 0.4–0.8，用透气板密封膜封板，于 37 °C、200 rpm 振荡培养 30 分钟。  
2. 在含100 g/ml羧苄青霉素的2YT琼脂平板上进行10倍系列稀释并涂布。
3. 挑取单菌落接种于450 µl含氨苄青霉素的2YT培养基中⁹ M13K07 噬菌体/ml，于96孔无菌深孔板（蓝色盒装）中37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
4. 在4 °C下以4,000 × g离心10分钟，沉淀细菌。
5. 克隆噬菌体上清液可用于Fab-噬菌体克隆的测序（见第5.4节）或用于克隆直接结合ELISA，以测定其对固定化抗原的特异性（见第5.3节和 ²¹）代表性结果如图所示 图5.

5.2）表达Fab克隆以进行表征

1. 将表达载体构建物转化至适当的表达载体后（参见讨论部分），使用无菌牙签或移液器吸头，从平板上挑取单个 E. coli 菌落，接种于96孔深孔板中含1 ml 2YT/羧苄青霉素培养基的孔内，于37 °C、200 rpm振荡条件下培养12–16小时。该步骤可手动操作，也可使用自动化菌落挑选仪完成。
2. 将40 µl培养中的菌液转移至96孔深孔板中的1.5 ml NZY培养基中，根据Studier et al.¹⁵的方法，添加葡萄糖/乳糖/甘油进行补充培养。
   注意： alternatively，细胞可在未添加诱导物的培养基中培养3–4小时（OD 0.8–1.0），然后通过加入1 mM IPTG诱导蛋白表达。
3. 用透气密封膜覆盖培养板，于30 °C、200 rpm振荡条件下表达Fab克隆6–8小时。以4,000 × g离心15分钟收集菌体，弃去上清液，用铝箔密封板孔，并将菌体沉淀于-20 °C冷冻保存，直至进行裂解。
4. 每孔加入100 µl裂解缓冲液（50 mM Tris HCl、200 mM NaCl、1.25% Triton X-100，pH 8.0，含1 mg/ml溶菌酶、10 U benzonase/ml培养液及蛋白酶抑制剂），在4 °C下振荡裂解2小时，以释放表达的Fab片段。
5. 在4 °C下以4,000 × g离心15分钟去除细胞碎片，收集粗裂解液上清，用于后续通过ELISA板进行特异性初步表征（见第5.3节）。

5.3）通过直接结合克隆 Fab ELISA 进行克隆表征

1. 按照第3.1节所述方法固定抗原，但将30 µl浓度为2 µg/ml的抗原PBS溶液分配至384孔板的孔中。采用基于四重阵列的抗原布局可便于使用96通道分配头进行试剂转移。ELISA板的洗涤和封闭步骤参照第3.1节进行。
2. 从澄清的裂解物中收集 第5.2节可直接应用于固定化抗原以评估结合情况。  每孔加入30 µl裂解液，在室温下以200 rpm振荡孵育15分钟。
   注意：可将纯化的Fab克隆蛋白用PBT缓冲液稀释至10 µg/ml，取每种克隆30 µl加入已封闭的包被抗原或阴性对照蛋白（如GST、BSA等）的孔中，后续显色步骤同下文所述。或者，也可使用Fab噬菌体，取10 µl噬菌体上清液（见第5.1节）加入20 µl PBT缓冲液中（1:3稀释），然后用抗M13-HRP抗体进行检测（见步骤4.4–4.5）。
3. 去除多余的裂解液，手动或使用自动洗板机用 100 µl PT 缓冲液洗涤 8 次，然后移除多余的缓冲液。
4. 在室温下，将30 µl 1:5,000稀释的二抗anti-FLAG抗体溶于PBT缓冲液中，以200 rpm振荡孵育30分钟。
5. 按照第4.3–4.5节进行洗涤、显影和定量。
   注意：下图所示结果代表了特异性与非特异性结合克隆的示例 图5.

5.4）克隆测序

1. 按照表2中的说明配制PCR主混合液。
2. 将2 µl适当的PCR模板（噬菌体上清液或重悬的含单个噬粒的细菌菌落）加入含有适当引物的20 µl PCR主混合液中，置于PCR板的孔内。
   注意：重链和轻链基因测序需分别配制不同的主混合液。
3. 使用表2——PCR设置中列出的参数运行PCR反应。
4. 通过将5 µl完成的PCR反应产物与上样染料混合，在添加了DNA可视化染料的1%琼脂糖凝胶上电泳，并在300 nm透射仪上成像，以验证PCR反应的成功与否。
5. 将2 µl PCR产物加入含0.2 µl外切核酸酶和0.2 µl虾碱性磷酸酶的10 µl无菌水中，37 °C孵育20分钟，随后在80 °C灭活酶10分钟，以去除过量引物，为测序做准备。   

6. 自动化筛选的扩展

6.1）基于移液器的液体操作

1. 将溴酚蓝配制成1%（w/v）的水溶液，并使用0.45 ml滤器去除不溶性颗粒。
2. 为确定酶标仪上吸光度的线性范围，将1%溴酚蓝溶液用水稀释1:1,000，然后进行连续两倍梯度稀释（共16个稀释度）。
3. 将每个稀释度的100 µl转移至平底96孔板中，在590 nm处测定吸光度。以绝对吸光度值对稀释倍数作图，选择线性范围内中高段的稀释度用于后续实验。
4. 根据上一步选择的稀释比例，将溴酚蓝加入水中或即将移液的实际溶液中，总体积需足够用于向三个96孔板加样，并包含储液槽中的死体积。
5. 校准单通道移液器，通过将水移取至分析天平来输送测试体积（在室温下，100 µl 水的重量为 100 mg）。
6. 使用校准后的移液器，将染色溶液的测试体积转移至至少三个平底96孔板的孔中，并在590 nm波长下每孔重复读取三次吸光度。
7. 用分析天平称量三个空的平底96孔板，并记录其质量。
8. 从储液器中用移液器吸取测试体积分别加入三个96孔板中，每个孔板设置三个复孔，在590 nm波长下测定吸光度。
9. 称量每块平板并计算质量差。
10. 首先，评估每个孔中的吸光度在容差范围内是否均匀例如，±5%）以及它们是否与使用校准移液器手动移液所获得的吸光度一致。如果某些通道 consistently 过量或不足量移液（例如参见 图6），执行修复程序并重复评估步骤，直至所有通道输送的体积均一。
11. 其次，当确认所有通道均能输送均匀体积后，通过计算每孔的平均质量差来检查该体积的准确性。例如，一台精确校准并设定为100 µl的液体处理设备，每块板应输送9.60 g水，即每孔0.10 g水。如果实际输送体积持续高于或低于目标体积，则可应用校正因子进行调整。 即， 编程设定110 µl，以实际递送100 µl。
    注意：对于小体积样本， 例如， 10 µl，使用十倍浓度的溴酚蓝染色液，并手动预分配90 µl水至96孔板中，以确保吸光度可测且处于线性范围内。

6.2）自动洗板

1. 按照第3.1节所述方法，将阳性靶标蛋白和阴性对照蛋白分别固定在96孔微孔板的不同孔中（每种待测条件使用两块板）。
2. 在室温下用封闭液孵育一小时，以封闭非特异性结合位点。
3. 向所有板的各孔中加入等量的100 µl PBT缓冲液中的靶标结合型Fab-噬菌体溶液（浓度为10¹³ cfu/ml），并在室温下轻轻振荡孵育2小时。
4. 根据每种条件分别清洗两块板，其中一块用于感染与滴定，另一块用于ELISA检测。
5. 通过直接感染细菌并进行滴定（如第3.3节（不加M13K07）和7.2.1节所述）或使用抗M13 HRP抗体及比色底物显色（如第4节所述）来评估清洗效果。
6. 针对特异性结合的固定化蛋白，特定克隆产生的噬菌体滴度通常可达10⁵–10⁷ 噬菌体/ml。对阴性对照蛋白（例如，BSA）存在一定程度的非特异性结合是正常现象，通常可检测到10²–10⁵ 噬菌体/ml；然而，若滴度过低（即，<10¹），可能提示清洗条件过于严苛，从而影响筛选结果。
7. 对于通过ELISA测定的噬菌体结合情况，应比较阳性与阴性对照蛋白的绝对结合信号，以判断机器人清洗效果是否与传统手工清洗结果相当（图7）。

6.3）酶标仪清洗机的去污处理

1. 首先，运行待测试的去污染程序。
   注意：建议使用至少两倍于管路总体积的溶液，并用0.5%次氯酸钠（从市售漂白剂（通常含6%次氯酸钠）新鲜稀释）对洗板头进行预冲洗并浸泡5分钟。
2. 用无菌（高压灭菌）水对洗板头进行预冲洗并浸泡5分钟，最后用空气充满系统管路。
3. 用无菌水或洗涤缓冲液对管路进行预冲洗。
4. 对一块无菌96孔微孔板洗涤一次，然后从洗板机中取出，并用无菌板封膜密封。此为污染前对照板。
5. 将过夜（O/N）扩增的噬菌体培养上清液各100 µl分装至96孔板的所有孔中。
6. 对含有噬菌体的微孔板洗涤一次，然后从洗板机中取出，并用塑料或铝箔封板膜密封。此为污染对照板。
7. 执行待测试的去污染程序。在本示例中，重复步骤6.3.1和6.3.2。
8. 对无菌微孔板洗涤一次，然后从洗板机中取出并密封。此为去污染测试板。
9. 将50 µl对数生长期的E. coli接种至滴定板中；此为感染前对照板。
10. 打开污染前对照、污染对照和去污染测试用的96孔板的封膜，使用每孔更换的新枪头，向所有孔中各加入100 µl处于对数生长期的E. coli。
11. 密封后于37 °C、200 rpm条件下孵育30分钟。
12. 从每块96孔板中随机选取三个孔，取50 µl感染后的细胞接种至10 cm的2YT/羧苄青霉素平板中，37 °C过夜（O/N）培养。
13. 将每块板中所有孔的感染细胞各50 µl转移至深孔板中，深孔板每孔含有1 ml 2YT培养基加100 µg/ml羧苄青霉素，并于37 °C过夜（O/N）培养。
14. 重复去污染程序，并使洗板机管路保持干燥。
    注意：在感染前对照板、污染前对照板或去污染测试板上，均不应观察到过夜（O/N）生长或液体培养基中的生长。污染对照板应观察到大量菌落和生长；若未观察到，则无法对去污染程序的有效性得出结论。理想情况下，去污染测试板在过夜（O/N）平板的所有孔中均不应产生菌落或过夜生长。可通过提高漂白剂浓度、延长浸泡时间或增加循环次数来增强去污染程序的严格性。

7. 输入/输出滴定

7.1）输入噬菌体滴定

1. 用无菌过滤的 PBS 将 5 µl 噬菌体等分试样稀释至 50 µl，并混匀。
2. 使用多通道移液器或 96 通道移液器，用无菌过滤的 PBS 对样品进行连续 10 倍梯度稀释，直至 10¹⁰。
3. 将 5 µl 稀释后的噬菌体接种到 45 µl 处于对数生长期（OD 0.6–0.8）的 T1 噬菌体抗性 E. coli 细胞中，用透气封膜密封后于 37 °C 孵育 30 分钟。
4. 取 5 µl 感染后的细胞涂布于添加了 100 µg/ml 羧苄青霉素的 LB/琼脂平板上，于 37 °C 过夜孵育。
5. 根据第 2.8 节所述计算方法，可通过出现菌落的最高稀释度样品估算噬菌体浓度。

7.2）噬菌体滴度的测定

1. 加入洗脱液后，对结合在平板上的噬菌体进行洗脱 E. coli 细胞，取5 µl噬菌体感染的细胞，用50 µl高压灭菌的2YT培养基稀释
2. 在灭菌的2YT培养基中制备10倍系列稀释液至10⁶ 使用多通道移液器或96通道移液器。
3. 将5 µl感染的细胞接种到添加了100 µg/ml羧苄青霉素的琼脂平板上，37 °C过夜培养。
4. 可根据第2.8节中详述的计算方法，从出现菌落的最稀释样品中估算噬菌体浓度。
   注意：在两种情况下（即， 输入和输出噬菌体滴度，与在四环素平板（总菌数）和卡那霉素平板（辅助噬菌体滴度）上形成的菌落数量进行比较，也可提供有价值的信息。

结果

本文所述方案已用于从组合式噬菌体展示Fab文库中并行分离针对多种结构相关和功能相关抗原结构域的抗体片段。在许多情况下，可通过计算机识别适合抗体筛选的可表达抗原结构域，从而规避抗原可获得性相关问题²³。通过在同一实验室中将抗原表达与抗体筛选相结合（图1），可建立一体化的流程，在该流程中更易于控制对抗原筛选至关重要的参数。在大多数情况下，通过仔细确定结构域边界，可在96孔或24孔深孔板中实现高通量表达，并从中表达和纯化出足够纯度和数量的抗原，用于后续成功的抗体筛选（图2）。在筛选过程的连续几轮中，可通过噬菌体滴定法（图3）或ELISA检测噬菌体库（图4）来监测洗脱噬菌体的浓度以及特异性结合抗原的噬菌体的富集情况。结合比值（>2）通常表明存在特异性结合克隆；相反，较低的比值（<2）有助于判断筛选失败的原因。例如，当非特异性OD值较高且比值<2时，可能提示非特异性克隆（或非特异结合物）去除不充分，可能需要进一步优化筛选方案。一旦检测到富集现象，即可分离单个高亲和力克隆进行...

讨论

当进行 体外 抗体筛选中，决定筛选成功与否的两个主要因素是：1）分离出正确折叠的抗原靶标用于筛选；2）具备功能多样性高的抗体文库。  在许多情况下，获得足量正确折叠的全长蛋白质可能受限。  克服这一局限性的一种方法是利用生物信息学分析鉴定出的结构域²² 并合成用于插入带有适当亲和标签的细菌表达载体中。

在生物技术应用中，有多种标签可用于提高溶解度、促进纯化以及稳定不稳定的结构域。¹¹ 几乎能够合成任何所需插入序列的能力，使得抗原生成平台具有高度的多功能性。尽管谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签形式较为常见，但此前已成功使用六组氨酸（hexahistidine）、Fc、Halo、麦芽糖结合蛋白以及位点特异性生物素化标签，并且认为还有大量其他亲和标签可被优化后用于类似的平台。然而，亲和标签在后续应用中可能带来有益效果，也可能产生非预期的负面影响，¹¹ 因此在基于特定形式建立实验流程之前，应对其进行全面研究。

新用户常会提出如何评估...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
New Brunswick Innova44 可堆叠培养摇床	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 通道手动台式移液系统	Anachem Ltd	LIQ-96-200
微孔板摇床	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 台式离心机	Thermo Product	75004525
ELx405 Select 深孔微孔板洗板机	Biotek	ELX405USD
定制高通量自动化噬菌体筛选机器人	S&P Robotics
塑料锥形 Falcon 管：50 ml	VWR	21008-178
塑料锥形 Falcon 管：15 ml	VWR	89039-668
Axygen 1.7 ml 微量离心管	Corning	MCT-175-L-C
96 孔/384 孔 Maxisorp 板	Sigma	M9410-1CS
Corning 96 孔 V 型底深孔板	Corning	3960
Axygen Mini-tube 96 孔无菌微孔板蓝色盒装	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
透气性粘性微孔板封膜	VWR	60941-084
试剂
名称	公司	货号
聚乙二醇	Bioshop	PEG800.1
酵母提取物	Bioshop	YEX401.1
生物蛋白胨	Bioshop	TRP402.1
N-Z 胺	Sigma	C7290
葡萄糖	Sigma	G8270-1KG
乳糖	Bioshop	LAC234
甘油	Bioshop	GLY001.500
羧苄青霉素	Bioshop	CAR544.10
卡那霉素	Bioshop	KAN201.25
四环素	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
磷酸二氢钾	Bioshop	PPM302.1
磷酸氢二钠	Anachemia	84486-440
氯化钠	Bioshop	SOD001.10
氯化钾	Bioshop	POC308.1
氯化钙	Bioshop	CCL302.500
硫酸镁	EMD	MX0070-1
氯化镁	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
琼脂	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA 凝胶染料	Invitrogen	S33102
磷酸	Acros Organics	201140010
溶菌酶	Bioshop	LYS702.25
苯并核酸酶	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	11 836 170 001
Ni-NTA 树脂	Qiagen	1018240
1,000 倍辅助噬菌体（M13K07）储备液（每毫升含 1013 噬菌体）	NEB	N0315S
HRP 标记的 M13 特异性抗体（抗-M13-HRP）	GE Healthcare	27-9241-01
TMB 底物：等体积混合 TMB 与 H2O2 过氧化物酶底物	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq DNA 聚合酶	Genscript	E00007
外切核酸酶	GE Healthcare	EZ0073X-EZ
虾碱性磷酸酶	GE Healthcare	E70092Z-EZ