本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。
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本文内容
摘要
摘要
满足基础研究和临床研究应用需求的抗体需求量很高，并且未来将急剧增加。然而，传统的单克隆抗体技术显然已无法单独胜任这一任务。这促使人们开发出替代方法，以满足针对整个可及蛋白质组元件的高质量、可再生亲和试剂的需求。为此，已设计出用于从噬菌体展示的合成抗体文库中进行高通量筛选的方法，适用于多种抗原，并针对快速通量和高成功率进行了优化。本文详细描述了一种实验方案，通过视频演示，展示了如何利用手动96通道液体处理仪或自动化机器人系统，从高多样性文库中平行筛选出针对数百个靶标的Fab-噬菌体克隆。采用该方案，单个研究人员可在6至8周内生成数百种抗原，平行筛选出相应抗体，并完成抗体结合能力的验证。本文重点强调了以下四个方面：i）一种可行的抗原形式；ii）筛选前的抗原表征；iii）影响特异性及高亲和力克隆筛选的关键步骤；以及iv）监测筛选效率和早期抗体克隆表征的方法。通过该方法，我们已获得针对多种靶标类别的合成抗体片段（Fab），包括单次跨膜受体、分泌型蛋白激素以及多结构域胞内蛋白。这些片段可轻松转化为全长抗体，并经验证具有高亲和力和高特异性。此外，这些抗体片段已在多种标准免疫检测中证实具有功能性，包括Western印迹、ELISA、细胞免疫荧光、免疫沉淀及相关检测。该方法将加速抗体的发现进程，并最终推动实现针对整个蛋白质组生成可再生、高质量抗体的目标。
引言
随着后基因组时代的到来，获得高质量的结合试剂以表征和调控蛋白质，对于开拓新的研究方向和治疗途径至关重要。抗体作为基础研究、诊断工具以及潜在治疗手段，对学术界和工业界的研究人员而言仍然具有关键作用。毫不奇怪，合同制抗体开发公司数量显著增长，其中大多数公司依赖传统的杂交瘤技术来制备定制抗体。然而 体外 利用噬菌体展示抗体文库进行筛选正成为一种强大的替代技术，在传统技术可能遇到局限的情况下，该技术可提供独特的优势并取得成功1, 2.
鉴于科研工具对抗体质量的高要求，可再生抗体的制备面临两个主要挑战：1）筛选通量；2）抗原的可获得性。目前已有多个研究团队报道了旨在提高通量和抗体鉴定速度的体外筛选流程。这些研究详细描述了多种可行的方法，包括以全长靶标3,4或结构相关的结构域5,6,7为筛选对象，采用基于微珠6,8或基于微孔板3,4的抗原固定策略。此外，基因合成技术的广泛应用9使得系统性抗原制备（尤其是独立结构域）的成本显著降低，有望缓解获取足量纯化全长抗原的困难。通过将上述两种技术结合，研究人员设计出一个自成体系且可扩展的抗原制备与抗体筛选流程，能够并行分离大量表达抗原结构域的抗体，从而促进针对结构或功能相关蛋白家族的整类检测试剂的开发。
为实现这一目标，已开发出一种整合式流程，该流....
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方案
1. 抗原制备
注意： 抗原结构域可由多家商业供应商合成并克隆至适当的IPTG诱导型表达载体中。
- 将10 ng编码DNA溶于20 µl 1X KCM中，冰上混合，加入20 µl化学感受态BL21 E. coli T1噬菌体抗性细胞，转入96孔PCR板中进行转化。
- 将细胞与DNA混合物冰上孵育20分钟，室温 孵育10分钟，再冰上孵育2分钟，随后加入100 µl预热的含葡萄糖的超级优化肉汤（SOC）培养基进行复苏，用透气板封膜封口，在2.5 cm轨道摇床中37 °C、200 rpm振荡培养1小时。
- 取5 µl转化后的菌液涂布于添加羧苄青霉素（100 µg/ml）的Luria-Bertani（LB）/琼脂平板，过夜培养 以获得单菌落，用于制备甘油菌种。
- 用5 µl甘油菌种接种1 ml 2YT/羧苄青霉素培养基，在2.5 cm轨道摇床中37 °C、200 rpm振荡培养12小时，使用96孔深孔板进行。
- 将上述菌液按1:40比例稀释，接种于NZY培养基15（添加0.05%葡萄糖、2%乳糖和100 µg/ml羧苄青霉素），在2.5 cm轨道摇床中30 °C、200 rpm振荡培养6–8小时。
- 收集菌体沉淀，使用96孔滤板进行高通量抗原蛋白纯化，每孔含100 µl Ni-NTA树脂，操作步骤参照已发表的文献方法16,1....
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结果
本方案已用于并行地从组合型噬菌体展示Fab文库中分离出针对多种结构相关和功能相关抗原结构域的抗体片段。在许多情况下，可通过计算机模拟识别出适合抗体筛选的可表达抗原结构域，从而规避与抗原可获得性相关的问题23。通过在同一实验室中将抗原表达与抗体筛选相结合（图1），可建立一体化的筛选流程，从而更易于控制对抗原筛选至关重要的抗原参数。在大多数情况下，通过仔细确定结构域边界，可在96孔或24孔深孔板中实现高通量表达，并获得足够纯度和数量的抗原，用于后续成功的抗体筛选（图2）。在筛选过程的连续多轮中，可通过噬菌体滴定法（图3）或ELISA检测噬菌体库，监测洗脱噬菌体的浓度以及特异性结合抗原的噬菌体的富集情况（图4）。结合比值（>2）通常表明存在特异性结合的克隆；相反，较低的比值（<2）有助于判断筛选失败的原因。例如，若比值<2且非特异性光密度值较高，则提示非特异性克隆（或粘性结合物）去除不充分，可能需要进一步优化筛选方案。一旦检测到富集现象，即可分离单个高亲和力克隆，进行测序和表征。克隆的结.......
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讨论
当进行 体外 抗体筛选中，决定筛选成功与否的两个主要因素是：1）分离出正确折叠的抗原靶标用于筛选；2）具备功能多样性高的抗体文库。 在许多情况下，获得足量正确折叠的全长蛋白质可能受限。 克服这一局限性的一种方法是利用生物信息学分析鉴定出的结构域22 并合成用于插入带有适当亲和标签的细菌表达载体中。
在生物技术应用中，有多种标签可用于提高溶解度、促进纯化以及稳定不稳定的结构域。11 几乎能够合成任何所需插入序列的能力，使得抗原生成平台具有高度的多功能性。尽管谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签形式较为常见，但此前已成功使用六组氨酸（hexahistidine）、Fc、Halo、麦芽糖结合蛋白以及位点特异性生物素化标签，并且认为还有大量其他亲和标签可被优化后用于类似的平台。然而，亲和标签在后续应用中可能带来有益效果，也可能产生非预期的负面影响，11 因此在基于特定形式建立实验流程之前，应对其进行全面研究。
新用户常会提出如何评估.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院共同基金——蛋白质捕获试剂项目对重组抗体网络抗体筛选与表征流程开发提供的资助，以及加拿大创新基金会对机器人筛选平台采购的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| New Brunswick Innova44 可堆叠培养摇床 | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 通道手动台式移液系统 | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| 微孔板摇床 | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 台式离心机 | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select 深孔微孔板洗板机 | Biotek | ELX405USD | |
| 定制高通量自动化噬菌体筛选机器人 | S&P Robotics | ||
| 塑料锥形 Falcon 管：50 ml | VWR | 21008-178 | |
| 塑料锥形 Falcon 管：15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml 微量离心管 | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96 孔/384 孔 Maxisorp 板 | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96 孔 V 型底深孔板 | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96 孔无菌微孔板蓝色盒装 | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| 透气性粘性微孔板封膜 | VWR | 60941-084 | |
| 试剂 | |||
| 名称 | 公司 | 货号 | |
| 聚乙二醇 | Bioshop | PEG800.1 | |
| 酵母提取物 | Bioshop | YEX401.1 | |
| 生物蛋白胨 | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z 胺 | Sigma | C7290 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270-1KG | |
| 乳糖 | Bioshop | LAC234 | |
| 甘油 | Bioshop | GLY001.500 | |
| 羧苄青霉素 | Bioshop | CAR544.10 | |
| 卡那霉素 | Bioshop | KAN201.25 | |
| 四环素 | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| 磷酸二氢钾 | Bioshop | PPM302.1 | |
| 磷酸氢二钠 | Anachemia | 84486-440 | |
| 氯化钠 | Bioshop | SOD001.10 | |
| 氯化钾 | Bioshop | POC308.1 | |
| 氯化钙 | Bioshop | CCL302.500 | |
| 硫酸镁 | EMD | MX0070-1 | |
| 氯化镁 | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| 琼脂 | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA 凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 磷酸 | Acros Organics | 201140010 | |
| 溶菌酶 | Bioshop | LYS702.25 | |
| 苯并核酸酶 | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA 树脂 | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000 倍辅助噬菌体（M13K07）储备液（每毫升含 1013 噬菌体） | NEB | N0315S | |
| HRP 标记的 M13 特异性抗体（抗-M13-HRP） | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB 底物：等体积混合 TMB 与 H2O2 过氧化物酶底物 | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq DNA 聚合酶 | Genscript | E00007 | |
| 外切核酸酶 | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| 虾碱性磷酸酶 | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
参考文献
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al.
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