方法文章

单工程的RNA转录物的活细胞实时成像采用比例式双分子信标

DOI：

10.3791/51544

⸱

2014年8月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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比例式双分子信标（RBMBs）可用于将图像的单个设计RNA转录活细胞中。在这里，我们描述RBMBs，交货RBMBs到细胞通过微穿孔和的单个RNA转录物中的实时荧光成像的制备和纯化。

摘要

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人们越来越认识到这两个基因表达的时空调控可能对细胞功能的重要后果，导致了不同的技术的发展，以可视个体的RNA转录物在单个活细胞。最近已经描述的一个有前途的技术利用的寡核苷酸为基础的光学探头，比率双分子信标（RBMB），以检测该被工程化以包含在3'-端非翻译区的RBMB靶序列的至少四个串联重复序列的RNA转录物。 RBMBs是专门设计成发射后，杂交到互补RNA明亮的荧光信号，但在其他方面仍骤冷。在这种方法中，使用合成探针允许耐光的，红移，并且将用于成像高度发光有机染料。多RBMBs的宽视场荧光显微镜下观察时，结合改造的RNA转录产生离散的荧光斑点。因此，个体的RNA转录物的运动可以容易地通过取一个时间序列的荧光图像的可视化中的实时性。在这里，我们描述RBMBs的制备和纯化，递送到细胞微穿孔和活细胞的单个RNA转录物成像。

引言

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RNA转录物的表达调控是一个复杂的动态过程，主要是负责控制细胞的行为和命运。虽然RNA的口述细胞功能的重要性已经知道了一段时间，它往往是很难得出两个因为大多数RNA分析工具缺乏捕捉重要的调节事件，如转录爆破所需的空间和时间分辨率，RNA之间明确的连接贩卖人口和本地化RNA加工。这导致了一些技术，使个体的RNA转录物，以在实时1活细胞可视化的出现。也许，最突出的，这些技术利用了GFP-MS2融合蛋白靶向已被工程化以包含在3'-UTR 2,3 MS2的结合位点的串联重复序列的RNA。通过将多个绿色荧光蛋白分子紧密接近，个别RNA转录出现明亮的荧光斑点通过荧光显微术。将GFP-MS2系统提供了前所未有的洞察RNA的行为，包括直接的可视化和转录的测量耐破4,5，检测独特的亚细胞定位和处理6-9，和RNA运输10的实时成像。然而，尽管GFP-MS2系统的巨大潜力，未结合的GFP-MS2融合蛋白可以创建限制了这种技术的通用性和动态范围的高背景荧光信号。几种方法已经被开发，以限制该背景信号，包括未结合的GFP-MS2 10的亚细胞区室化，蛋白片段互补11，并选择性RNA结合蛋白和目标12。然而，所有这些方法仍与RNA靶和GFP-MS2融合蛋白的相对和总表达敏感。

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方案

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在这个协议中，一个寡核苷酸（RBMB1）被标记在它的5'末端与CF640R报告染料和具有序列:5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC亩mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC木木-3'。自身互补结构域，其驱动所述发夹结构的形成中，用粗体表示。第二个寡核苷酸（RBMB2）被标记在3'端有一个爱荷华黑色RQ-SP猝灭剂和具有序列:5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'。

1，准备RBMBs的

  1. 执行包含RBMB1和RBMB2寡管的快速旋转，以确保在干燥的寡核苷酸是在管的底部，并重新悬浮在DNA酶和RNA酶的水至100μM的最终浓度。例如，寡核苷酸的10纳摩尔样品应重新悬浮于100微升的水。
  2. 测量尤尔RBMB1和RBMB2股票样本的紫外 - 可见光谱的准确浓度。
    1. 混合3微升117微升DPBS的RBMB样品（无钙和镁）在微量离心管中。
    2. 空白的分光光度计用DPBS和从200-800纳米测量吸光度。注:峰值吸光度在260 nm和650 nm的应该是可见的。
    3. 计算出的库存浓度基于260nm处的吸光度（或650....

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结果

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不久下列HT1080细胞中RBMBs的存在下的微穿孔，被改造的那个人的RNA转录物，以含有多个RBMB结合位点在其3'-UTR时通过宽视场荧光显微镜（ 图2）拍摄显示为明亮的荧光斑点。而个体的RNA转录物与少至4 RBMB结合位点可以在活细胞进行成像，越RBMB结合在3'-UTR部位，越强的荧光信号。而且，越是RBMBs绑定到每个成绩单的时间越长的RNA可以可视化前的信号丢失，由于漂白。在这个协议中，RNA被工程化以包含在3'-UTR的RBMB靶序列的96个串联重复。此次收购流媒体的图像，可以对各个RNA转录到实时（ 电影1）进行成像。单个RNA转录容易看出细胞质和细胞核Ø中移动F表示细胞。虽然大部分的斑点出现接受布朗和子的扩散运动，在罕见的情况下进行定向运输的RNA会被观察到（ 电影2）。载文RNA转录通常沿直线路径（ 图3）快速移动;然而，一些RNA不遵循弯曲的路径，或者使在方向上的突然变化。这些动作都形成鲜明对比的布朗运动，这是随机的，并在这里获得的短的时间帧（ 即 <1分.......

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讨论

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使用传统的宽视场显微镜的能力，形象单一的工程RNA转录物在活细胞中，需要与每个RNA转录和低荧光背景与未结合的荧光探针发出的相关明亮，耐光荧光信号。在该方法中，明亮的荧光信号是由杂交多个（最多96个）基于寡核苷酸的荧光探针， 即 RBMBs，在每个RNA转录物来实现的。然而，仅仅四个绑定位点是足够16。集体信号产生，可以在实时的跟踪明亮的荧光斑点。多个探针的存在还允许较长的成像时间中，由于荧光染料的相当大一部分必须被光漂白的集体信号丢失之前。可以设想，这种技术将提供独特的见解RNA生物学和允许的范围广泛的RNA的行为，从测量日的研究RNA贩卖电子响应各种外界刺激，观察靶RNA的独特的亚细胞定位模式，研究RNA的命运和寿命，并提供洞察RNA的调控。此外，它可能可以跟踪更改（ 即上调和下调）的RNA表达。虽然这种能力还没有被验证，我们以前曾表明，RNA的拷贝数可以相当准确地定量长达24小时，在活细胞22。此外，RBMBs似乎不影响基因的表达水平。组合，这些结果提供了改变过此时间期间的基因表达进行了精确跟踪，在一个小区由小区的基础上，并且该RBMBs没有导致增加R.......

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披露

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马克博士Behlke和凌黄博士是由IDT采用它提供的寡核苷酸出售类似的一些手稿中描述的化合物。 IDT的是，然而，并不是一家上市公司，他们个人不拥有任何股份/股权IDT。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了美国国家科学基金会成就奖（0953583）和健康NCI / R21-CA116102的研究所，NCI / R21-CA125088，NIBIB / R01-EB012065，NCI / R01-CA157766支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无核酸酶水Life TechnologiesAM9932无 DEPC 处理
DPBSLife Technologies14190-144无 Ca2+ 和 Mg2+
Cary 100 紫外-可见分光光度计Agilent Technologies
磷酸氢钾Fisher ScientificP290-500
磷酸二氢钾Fisher ScientificP284-500
磷酸二氢钠Fisher ScientificS381-500
微量离心管Eppendorf223641111.5 ml
色谱柱Kimble Chase Life Science420400-07200.7 x 20 cm
Superdex 75 prep gradeGE Healthcare17-1044-01
注射泵Braintree ScientificBS-300
BD 注射器30103560 ml，Luer-lok 尖端
离心过滤装置MilliporeUFC501096MW 10,000 截止
离心机 5418Eppendorf
Poly-D-赖氨酸Sigma-AldrichP7280-5MG冻干粉，g 辐照
8 孔室盖玻片Fisher Scientific155409工作体积 0.2-0.5 ml
HT1080ATCCCCL-121人纤维肉瘤细胞系
细胞培养瓶康宁43063925 cm2
DMEMLife Technologies11965084
不含酚红的高葡萄糖 DMEMLife Technologies21063029高葡萄糖
胎牛血清Sigma-AldrichF2442-500ML
青霉素/链霉素Life Technologies15140122
胰蛋白酶Life Technologies253000540.05% 胰蛋白酶-EDTA
Neon 转染系统Life TechnologiesMPK5000
Neon 转染系统试剂盒Life技术MPK1096
血细胞计数器Fisher Scientific02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 倒置荧光显微镜奥林巴斯
SOLA 光引擎流明
分子器件软件控制显微镜
Immersol oil 518FFisher Scientific12-624-66B

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-....

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