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高产量纯化Plasmodium falciparum裂殖子用于调理抗体检测

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DOI：

10.3791/51590

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2014年7月17日

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1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

本文内容

摘要

检测抗体功能对于理解Plasmodium falciparum疟疾的免疫机制至关重要。本方法描述了可存活裂殖子的纯化，以及通过流式细胞术检测依赖调理作用的吞噬作用。

摘要

Plasmodium falciparum 裂殖子抗原正在被开发为潜在的疟疾疫苗。针对疟疾的免疫反应的一个方面是吞噬细胞从血液中清除游离裂殖子。然而，由于裂殖子的半衰期较短以及原代吞噬细胞的变异性，评估裂殖子特异性调理抗体的功能效力具有挑战性。本文详细描述了一种利用蛋白酶抑制剂 E64 生成有活力裂殖子的方法，以及使用前单核细胞系 THP-1 检测裂殖子依赖调理素的吞噬作用的实验方法。E64 可防止裂殖体破裂，同时允许裂殖子发育，随后通过过滤处理后的裂殖体释放裂殖子。 用溴化乙锭标记的裂殖子与人血浆样本进行调理处理后加入 THP-1 细胞中。吞噬作用通过标准化的高通量实验流程进行评估。有活力的裂殖子是评估P. falciparum 多种生物学特性的宝贵资源，包括免疫功能的评估。本实验所测得的抗体水平与自然暴露个体对疟疾的临床免疫性相关。该实验方法也可用于评估疫苗诱导产生的抗体。 

引言

抗体对免疫的重要性  到 恶性疟原虫 40年前，通过将高免疫成人来源的免疫球蛋白被动转移给患有重症疟疾的儿童，证明了疟疾的病情可得到缓解。1因此，大量研究致力于鉴定具有保护性疟疾免疫作用的靶点，主要通过检测抗体滴度来实现 通过ELISA检测针对肽段或细菌表达蛋白的抗体。基于ELISA的血清学检测在不同研究间的变异度较高，且无法评估抗体的功能性。2许多疟疾抗原可诱导产生亲细胞型IgG1和IgG3抗体谱型，尤其是裂殖子表面抗原。3这种亚类偏向性表明，抗体Fc段与吞噬细胞Fc受体（FcR）的相互作用对于调理性抗裂殖子抗体的效应功能具有重要意义4目前正在开发的多种裂殖子抗原疫苗旨在诱导吞噬细胞的效应功能5,6 尽管在啮齿类疟疾模型中，抗体与Fc受体相互作用的重要性已有大量证据支持7-9，最近有几项研究支持功能性抗体和吞噬细胞效应功能在人类疟疾免疫中的重要性10,11该领域仍缺乏深入研究。针对裂殖子特异性调理抗体的研究受到两个因素的限制：一是难以分离出高质量的裂殖子；二是原代细胞的吞噬作用反应存在变异性。

直到最近，人们通常采用高速离心或Percoll密度梯度法从裂解中的裂殖体培养物上清液中分离裂殖子。这些裂殖子很少具有活性，且在用于检测前通常还需经过密度梯度离心和多次洗涤12，或冷冻保存11等进一步处理。这些操作可能导致许多与裂殖子表面外周结合的蛋白质脱落，而这些蛋白质正是已知的疟疾免疫抗原靶点13。近年来，研究人员开始使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰胺基-(4-胍基)丁烷（E64）来制备具有活性的裂殖子。E64可抑制裂殖体破裂，从而形成由膜包裹的裂殖子14，再通过过滤破坏该膜结构，即可释放出具有活性的裂殖子15,16。该技术已帮助实现多种蛋白质在红细胞侵袭过程中的空间定位解析15,17-19，并阐明了多种抗疟药物在特定发育阶段的作用机制16,20。然而，活性裂殖子的制备在技术上仍具挑战性。为了促进该技术的推广及其在免疫功能检测中的应用，本文详细描述了一种活性裂殖子纯化的实验方案，并介绍了其在标准化功能性检测中的应用，用于研究抗体与细胞在调理作用及吞噬作用中的协同效应。

该技术相较于以往方法展现出显著进步 体外 裂殖子调理作用检测，例如中性粒细胞呼吸爆发、抗体依赖性细胞抑制（ADCI）以及替代性裂殖子吞噬检测。由于寄生虫接种量的差异以及原代吞噬细胞活性的波动，这些检测方法的可重复性较差。11,21. 污染性血红素可能也会严重影响吞噬细胞功能22一种近期报道的稳定且可重复的裂殖子吞噬作用检测方法23 利用人单核细胞白血病细胞系 THP-124这是一种理想的高通量流式细胞术检测细胞类型，因其具有非贴壁特性，并能特异性地执行Fc受体介导的吞噬作用。25,26研究吞噬作用时的另一个复杂因素在于，吞噬程度取决于裂殖子相对于THP-1细胞的数量以及血浆浓度。为确保实验间的可重复性，应对裂殖子进行计数，并使用确定的浓度。由于裂殖子体积较小，需采用流式细胞术进行定量。

本文所述方法可去除疟色素并获得可存活的裂殖子，并介绍了一种利用这些裂殖子进行流式细胞术计数，继而进行调理作用和吞噬作用分析的应用。尽管这些技术操作上具有挑战性，但其可能有助于阐明裂殖子表面特异性抗体反应在自然获得性免疫及疫苗诱导免疫中的作用。

方案

注意：除离心和流式细胞术外，所有步骤均应在层流罩内进行，以保持无菌状态。处理人源样本时，应采取适当的防护措施。该检测方法对少量血浆非常敏感。所提供的稀释比例适用于检测来自巴布亚新几内亚（PNG）半免疫儿童血浆样本中5%至78%范围内的反应，为最佳条件。不同血浆样本集的最佳稀释比例可能有所不同，因此建议对血浆进行滴定，以确定每种应用的最佳实验条件。实验中必须设置两个阴性对照：不含血浆的THP-1细胞与裂殖子共孵育；以及用来自疟疾无暴露史个体混合血浆调理的裂殖子与THP-1细胞共孵育。上述对照可控制裂殖子与THP-1细胞的非特异性黏附，并有助于严格设定流式细胞术中吞噬事件的门控策略。

使用巴布亚新几内亚血浆样本的研究已获得巴布亚新几内亚卫生部医学研究咨询委员会以及沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所人类研究伦理委员会（项目编号 04/04）的批准。所有参与者的父母或监护人均已签署书面知情同意书。

1. THP-1 细胞培养

  1. 将人单核细胞系 THP-1 维持在添加了 10% 胎牛血清（FCS）和 55 μM 2-巯基乙醇（THP-1 培养基）的 RPMI-1640 培养基中，并在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。
  2. 将细胞密度维持在低于 5 x 105 个细胞/ml。注意：过度生长将导致细胞分化为贴壁细胞，并下调 Fc 受体的表达。当细胞传代约 10 次后，应解冻新的细胞冻存管以维持细胞表型。

2. 抗体样品的制备与稀释

  1. 将待检测血浆和疟疾阴性对照血浆在56 °C孵育30分钟以进行热灭活。
  2. 用THP-1培养基将血浆样本连续稀释至1/2,000。
  3. 将稀释后的血浆储存在-20 °C。

3. 高度同步的P. falciparum培养

注意：由于表达GFP的疟原虫株D10-PfPHG27具有48小时的生活周期，有助于疟原虫的同步化以及精确控制E64的添加时间，因此本实验选用该品系。此外，由于该品系在胞质中表达GFP，可通过流式细胞术检测GFP来检测寄生率及游离裂殖子。然而，GFP的荧光强度不足以在THP-1细胞内实现可视化，因此需使用溴化乙锭（EtBr）对裂殖子进行复染。只要能够实现高度同步化，也可使用其他疟原虫株。可通过山梨醇处理裂解成熟形态28，并结合肝素抑制入侵15，以实现疟原虫的同步化。

  1. 在补充有 25 mg/ml HEPES、50 μg/ml 次黄嘌呤、10% 混合人血清、2 mg/ml 碳酸氢钠和 20 μg/ml 庆大霉素（寄生虫培养基）的 RPMI-1640 培养基（pH 7.4）中，将 P. falciparum 寄生虫维持于 O+ 型人红细胞（RBC）中，血细胞比容为 3%。在培养基中加入 5 mg/ml 盐酸杀稻瘟菌素以筛选 GFP+ 寄生虫。
  2. 将培养物置于密闭培养盒中，或使用双层密封的培养瓶，在 37 °C、含 1% O2、4% CO2 和 95% N2 的气体环境中孵育。
  3. 制备薄血涂片，用 100% 甲醇固定 10 秒，然后用 10% 吉姆萨染液（溶于 6.7 mM、pH 7.1 的磷酸缓冲液中，即吉姆萨染液）染色 10 分钟，以监测寄生率。染色后，用水冲洗玻片并自然晾干。使用 100 倍油镜评估寄生率。 
  4. 通过分瓶传代并根据需要添加未感染的红细胞，将寄生虫培养物的寄生率维持在 5% 感染红细胞以下。 
  5. 如需使用肝素同步化，向环状体阶段的培养物中加入 20 IU/ml 医用级肝素。
  6. 当大多数寄生虫处于裂殖体阶段时，在 300 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞，弃去含肝素的培养基，并将细胞重悬于寄生虫培养基中，以允许裂殖体破裂并释放裂殖子进行侵袭。
  7. 4 小时后，向培养物中重新加入 20 IU/ml 肝素，以阻断后续裂殖子的侵袭。注意：可能需要多次进行山梨醇和肝素处理，才能实现充分的同步化。 为获得足够数量的裂殖子，需准备 150 ml 寄生率为 3–5% 的寄生虫培养物。

4. 晚期P. falciparum滋养体的分离

  1. 在将肝素重新加入培养物后36小时，以300 × g离心5分钟收集培养的细胞，并将沉淀重悬于寄生虫培养基中，红细胞压积调整为25%。
  2. 将一个大磁柱（基质体积为6.3 ml）固定在磁铁上，用寄生虫培养基平衡磁柱，确保完全去除所有气泡。
  3. 将重悬的P. falciparum培养物加入磁柱中，并调节流速至每秒一滴。
  4. 待培养物完全通过磁柱后，用寄生虫培养基洗涤磁柱，直至流出液澄清。
  5. 用30 ml 37 °C的寄生虫培养基从磁柱中洗脱寄生虫。
  6. 制备寄生虫的薄血涂片，用100%甲醇固定10秒，再用吉姆萨染液染色3分钟。在显微镜下观察涂片，确认寄生虫几乎充满红细胞，且处于早期裂殖体阶段。若寄生虫尚未达到适当的成熟阶段，则将纯化的寄生虫放回37 °C培养箱中，在含1% O2、4% CO2和95% N2的气体环境中继续培养至合适发育阶段。注意：为确保红细胞不会污染裂殖子制备物，感染红细胞的纯度需高于90%。
  7. 用10 μM E64（环氧琥珀酰-L-亮氨酸酰胺(4-胍基)丁烷（E64））处理分离的裂殖体，孵育6–10小时。注意：可延长E64孵育时间，但所产生的裂殖子将不再具有侵袭能力。

5. 分离 P. falciparum 裂殖子

  1. 用 E64 孵育后，涂片寄生虫，用 100% 甲醇固定细胞，并用吉姆萨溶液染色，以评估膜包被的裂殖子形成情况。注意：若超过 50% 的寄生虫已形成膜包被的裂殖子，则可获得良好的裂殖子产量。
  2. 在 1,900 × g 条件下离心 E64 处理的裂殖体 8 分钟。用 50 ml 室温 RPMI-1640 培养基（pH 7.4）洗涤，该培养基中添加 25 mg/ml HEPES、50 μg/ml 次黄嘌呤、2 mg/ml 碳酸氢钠和 20 μg/ml 庆大霉素（洗涤培养基），以去除残留的人血清。
  3. 将沉淀物重悬于 2 ml 洗涤培养基中。注意：使用含胎牛血清（FCS）的 THP-1 培养基会在过滤过程中产生泡沫。
  4. 将 2 ml 重悬的 E64 处理裂殖体通过 1.2 μm/32 mm 注射器滤器过滤。将滤液收集至 10 ml 离心管中。注意：滤液中含有裂殖子和疟色素晶体，未破裂的裂殖体和碎片则留在滤器中。
  5. 将小型磁性柱固定在磁铁上，并用 500 μl THP-1 培养基平衡。
  6. 将滤液通过磁性柱，收集穿流液。注意：疟色素会结合在柱上，而裂殖子则穿过柱体。
  7. 将穿流液再重复通过磁性柱两次，以进一步去除疟色素，每次均收集穿流液。
  8. 用 2 ml 室温 THP-1 培养基冲洗磁性柱，以收集残留的裂殖子。
  9. 加入溴化乙锭（EtBr）至终浓度 10 μg/ml，在室温避光染色 30 分钟。注意：确保所有被 EtBr 污染的液体和塑料废弃物按照细胞毒性化学品的处理规范进行处置。此孵育后裂殖子不再具有侵袭性。
  10. 在 4,000 × g 条件下离心裂殖子 10 分钟。
  11. 将上清液弃入适当的废液容器中。
  12. 将裂殖子沉淀物重悬于 4 ml THP-1 培养基中，并在 4,000 × g 条件下离心 10 分钟。
  13. 加入 THP-1 培养基至总体积 15 ml，并避光保存。

6. 通过流式细胞术定量疟原虫裂殖子浓度

  1. 将计数微球恢复至室温。
  2. 配制含0.5% BSA的PBS，用于稀释裂殖子。
  3. 对裂殖子进行三个稀释度的计数：1:100、1:50 和 1:25。分别准备三支流式管，每管中加入940、930 和 910 μl 的 PBS + 0.5% BSA。然后分别向各管中加入10、20 和 40 μl 纯化的裂殖子。
  4. 将计数微球涡旋振荡30秒，然后每管稀释后的裂殖子样品中加入50 μl 微球。
  5. 使用配备488 nm激光器的流式细胞仪检测三个稀释度的裂殖子样品。根据EtBr和GFP的双荧光信号对裂殖子设置严格门控，并在另一通道中通过荧光信号对计数微球进行门控。采集数据直至收集到2,000个微球事件。 注意：本说明适用于经EtBr复染的GFP+裂殖子计数。若未使用表达GFP的寄生虫，则应根据侧向散射光和EtBr荧光信号设置裂殖子门控。
  6. 通过将裂殖子事件数除以2,000个计数微球事件数，计算每个稀释度下裂殖子与微球的数量比。根据所用批次计数微球的产品说明书，确定每管加入的50 μl 微球中的微球数量。 
  7. 将50 μl 微球中的微球数量乘以稀释倍数，再乘以该稀释度下的裂殖子:微球比值，所得数值即为每毫升裂殖子的浓度。对每个稀释度均执行此计算。
  8. 取三个稀释度测得的裂殖子浓度的平均值。注意：若1:100、1:50 和 1:25 三个稀释度测得的浓度标准差超过10%，表明样品制备过程中存在技术误差。
  9. 将裂殖子重悬于THP-1培养基中，浓度为8 × 106 个裂殖子/ml，以确保每个THP-1细胞对应四个裂殖子。注意：也可使用其他裂殖子与THP-1细胞的比例，相应调整浓度即可。

7. 吞噬作用检测

  1. 向96孔U型底板的每孔中加入200 μl热灭活FCS，在室温下封闭过夜。孵育后，吸除FCS，并用200 μl无菌PBS洗涤每孔两次。吸除PBS后，将板置于4 °C保存，待用时取出。
  2. 根据待检测的血浆样本及对照样本数量，计算所需THP-1细胞总数，每样本设三个复孔，每孔接种1 × 105个THP-1细胞。
  3. 取10 µl细胞培养液滴加至血细胞计数板，在显微镜下计数血细胞计数板四个角落16格区域中的细胞数量，共计四组，取平均值。将平均细胞数乘以10,000，计算出每毫升的细胞浓度。
  4. 将所需数量的THP-1细胞在500 × g离心5分钟，弃上清，用THP-1培养基重悬细胞，调整浓度至6.7 × 105个细胞/ml。
  5. 向已用FCS封闭的96孔U型底板中，每孔加入150 μl THP-1培养基中的THP-1细胞悬液，使每孔细胞数为105个。每个待测样本准备三孔。加样后将培养板放回培养箱，待加入裂殖子时取出。
  6. 在另一块已用FCS封闭的96孔U型底板中，每孔加入150 μl浓度为8 × 106/ml的裂殖子悬液。每个待测样本准备一孔。
  7. 向含有裂殖子的孔中，每孔加入10 μl已稀释的血浆样本，并充分混匀，确保溶液均匀。
  8. 从培养箱中取出THP-1细胞板，向每孔含THP-1细胞的孔中加入50 μl裂殖子/血浆混合液，每个血浆样本设三个复孔。
  9. 充分混匀后，将板置于37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中孵育40分钟。用铝箔覆盖以避光。
  10. 孵育40分钟后，将样本在预冷至4 °C的离心机中以500 × g离心5分钟，以终止吞噬作用。
  11. 吸除上清液，用预冷的含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS（FACS缓冲液）洗涤细胞两次。注意：EDTA有助于维持细胞单悬状态，便于后续流式细胞术分析。
  12. 用含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS配制的90 μl 2%多聚甲醛（PFA）固定液重悬细胞（FACS固定液）。冰上避光保存，直至上机检测。

8. 流式细胞术

  1. 使用配备 488 nm 激光器和高通量微孔板读板附件的流式细胞仪采集样本。注意：此方法可使一次裂殖子制备物用于检测多达 400 个血浆样本。也可将细胞转移至离心管中进行手动上样。
  2. 根据前向散射光和侧向散射光圈选有活力的 THP-1 细胞。
  3. 以“含裂殖子但无血浆的 THP-1 细胞”对照组为依据，设定溴化乙锭（EtBr）阳性门控。 
  4. 每份样本至少采集 10,000 个事件。

9. 数据分析

  1. 使用流式细胞术分析软件分析数据，并对溴化乙锭（EtBr）阳性事件设置严格的门控。
  2. 计算每个样本的吞噬百分比：该样本中EtBr阳性细胞的百分比减去非免疫血浆组阳性细胞的百分比。
  3. 对三个重复样本的结果取平均值。注意：若三个重复样本的标准差超过10%，则提示实验存在不准确性。由于裂殖子可能黏附在THP-1细胞表面，部分背景性的EtBr阳性信号可能被观察到，但在所有含有裂殖子的样本中应保持一致。通过“THP-1细胞与裂殖子共孵育但无血浆”对照组设定门控，并减去“THP-1细胞与非免疫血浆”对照组的背景信号，所得吞噬百分比仅反映因内化/吞噬裂殖子而产生的荧光信号。

结果

在使用 E64 处理之前，寄生虫的成熟阶段对于形成膜包被的裂殖子至关重要。图 1Ai 显示了添加 E64 时裂殖体应处于的适当成熟阶段。此时寄生虫体积较大，几乎充满整个红细胞。吉姆萨染色呈现斑驳状表明裂体增殖已经开始，此时添加 E64 可获得膜包被的裂殖子（图 1Aii）。若在更早的滋养体阶段即加入 E64，即使处理 12 小时后也无法形成膜包被的裂殖子；相反，寄生虫会呈现异常形态，例如消化泡增大（图 1Bi 和 图 1Bii），且不形成裂殖子。若在更晚的裂殖体阶段添加 E64，则由于裂殖体破裂未受抑制，也无法获得膜包被的裂殖子（图 1Ci 和 图 1Cii）。实验需要高度同步的寄生虫群体，否则在 E64 处理后将同时观察到上述三种结果。

去除疟色素是纯化裂殖子的另一个关键步骤。如果裂殖子未与疟色素分离，则会形成裂殖子-疟色素聚集体，这些聚集体无法通过移液操作分散。这些聚集体在流式细胞仪中表现为单个事件，尽管其前向散射和侧向散射特性与单个裂殖子不同，从而导致通过流式细胞术计数裂殖子时结果不准确（图 2A）。由于 THP-1 细胞也能吞噬疟色素，这些裂殖子-疟色素聚集体也可能被吞噬（图 2B）。这些聚集体具有强烈的溴化乙锭（EtBr）荧光，因其包含多个裂殖子。聚集体被吞噬后，THP-1 细胞的 EtBr 荧光信号与吞噬多个单个裂殖子时相似。因此，若未去除疟色素，THP-1 细胞的 EtBr 荧光强度将高估待测血浆的调理活性。另有报道指出，疟色素可显著改变吞噬细胞的功能。为增强被 THP-1 细胞吞噬的裂殖子的可视化效果，对表达 GFP 的裂殖子使用 EtBr 进行复染。根据本实验方案所述条件，所有 GFP 阳性的裂殖子均可被 EtBr 复染，而 EtBr 具有更强的荧光强度（图 3A）。通过检测 EtBr 荧光评估吞噬作用，相较于 GFP 荧光，能更清晰地区分裂殖子的吞噬情况（图 3B）。

加入检测的裂殖子数量将影响所观察到的吞噬作用水平。因此，通过流式细胞术进行准确计数至关重要。随着裂殖子与THP-1细胞比例的增加，在无血浆存在的情况下，裂殖子与THP-1细胞的黏附也会增加（图4A）。当裂殖子被调理时，提高裂殖子与THP-1细胞的比例也会导致吞噬反应增强（图4B）。建议采用4:1的裂殖子与THP-1细胞比例，以获得较强的吞噬反应。使用该比例及指定的血浆稀释度，本检测能够区分低、中、高三种水平的调理抗体。在使用巴布亚新几内亚（PNG）血浆样本及其他所述实验条件下，观察到的吞噬反应水平介于0%至78%之间。此类反应最近已被证实与自然获得的疟疾临床免疫相关10。 图5展示了来自巴布亚新几内亚个体的吞噬反应四分位数示例。

显示 E64 处理前后细胞形态的显微镜示意图；包含比例尺。
图 1. 添加 E64 的时间对于生成膜包裹的裂殖子至关重要。(A) 寄生虫在 i) E64 处理前的适当成熟阶段，以及 ii) 经 6 小时 E64 处理后产生的膜包裹裂殖子。(B) 若将 E64 添加至未成熟寄生虫，则无法生成膜包裹的裂殖子；i) 晚期滋养体，以及 ii) 经 12 小时 E64 处理后。(C) 若将 E64 添加至晚期分节裂殖体，则无法抑制裂殖体破裂；i) 晚期裂殖体，以及 ii) 经 6 小时 E64 处理后。比例尺代表 10 μm。

流式细胞术与含铁血红素对细胞影响的显微镜观察；前向散射与侧向散射图、细胞图像。
图 2. 去除含铁血红素对于制备单细胞裂殖子悬液至关重要。 在滤过膜包被的裂殖子后，若未通过磁性分离去除含铁血红素，则会形成裂殖子-含铁血红素聚集体。（A） 去除与保留含铁血红素的裂殖子的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图。（B） 裂殖子-含铁血红素聚集体可被 THP-1 细胞吞噬。将 THP-1 细胞与经 PNG 血浆调理的裂殖子制剂（含或不含含铁血红素）共孵育后，进行 Diff-Quick 染色的细胞甩片。比例尺为 10 μm。

流式细胞术图谱：GFP阳性裂殖子、溴化乙锭染色、细胞分析、荧光强度、数据图。
图3. 溴化乙锭染色可显著提高裂殖子吞噬作用的分辨能力。 对D10-GFP纯化的裂殖子使用EtBr进行复染，以增强荧光强度。（A） 纯化裂殖子的流式细胞术直方图，圈选GFP阳性裂殖子，并显示该圈选群体中EtBr荧光的点状图。（B） THP-1细胞在吞噬GFP与EtBr双荧光标记裂殖子后，前向散射光与GFP、前向散射光与EtBr的散点图。圈门依据THP-1细胞与裂殖子共孵育组及无血浆对照组设定。

流式细胞术图谱及显示经PNG/非免疫血浆调理后细胞的溴化乙锭荧光强度。
图4. 裂殖子与THP-1细胞的比例影响所观察到的吞噬作用程度。（A） 显示五种裂殖子:THP-1细胞比例：50:1、20:1、10:1、4:1 和 1:1。仅细胞对照表示由THP-1细胞引起的背景荧光。针对经巴布亚新几内亚（PNG）血浆混合物或非免疫澳大利亚血浆调理的裂殖子，分别标示各比例下THP-1细胞的溴化乙锭（EtBr）荧光强度。（B） 不同裂殖子:THP-1细胞比例下，经PNG血浆混合物或非免疫澳大利亚血浆调理后THP-1细胞的平均荧光强度（均值±标准误）。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术数据，EtBr 与 FSC 的关系图，显示细胞群体百分比（8.2%、26%、51%、76%）。
图 5. 可检测多种不同调理抗体的反应。裂殖子使用来自巴布亚新几内亚（PNG）个体的血浆进行调理，并与 THP-1 细胞共孵育。图中展示了四个典型的吞噬反应结果。设门依据为仅含 THP-1 细胞与裂殖子但无血浆的对照组，数值表示减去非免疫血浆对照组后所得的吞噬百分比。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

为了测量裂殖子的吞噬作用，需要掌握两种技术：裂殖子的纯化和THP-1细胞吞噬实验。将这两种技术结合时最关键的步骤包括：1）高度同步化的寄生虫；2）在正确的时间加入E64以获得膜包裹的裂殖子；3）去除疟色素以避免形成聚集体；4）通过流式细胞术准确计数裂殖子；5）所用血浆的稀释度；以及6）保持THP-1细胞的低密度和较低传代次数。仔细考虑这些关键因素将确保观察到稳定的吞噬反应。

尽管本文描述的是为评估吞噬作用而制备裂殖子的方法，但该技术也可广泛应用于多种其他用途。无论后续采用何种方法，高质量裂殖子的制备都依赖于准确把握E64的添加时间，以确保生成裂殖子。本文所述的E64方法已被证明可产生具有侵袭能力的裂殖子，适用于侵袭事件的高分辨率显微镜观察以及药物敏感性检测15-20。虽然在吞噬实验中裂殖子的活性并非必需，但其表面包被的完整性至关重要。因此，本文所描述的E64方法能够制备出高质量的裂殖子，用于评估针对表面包被的抗体反应。如图1所示，若E64添加过早或过晚，均无法形成由膜包裹的裂殖子。因此，必须使用高度同步化的疟原虫培养物。本文介绍了利用山梨醇和肝素处理，将D10-GFP疟原虫培养物严格同步至2小时时间窗内的方法。肝素可能在其他实验室分离株中促进配子体形成，因此应谨慎使用。也可采用其他同步化方法（如丙氨酸处理），前提是能够获得高度同步化的疟原虫29。若将E64添加至不同步的疟原虫培养物中，则生成的膜包裹裂殖子比例将显著降低，其余感染红细胞的疟原虫将正常裂解或呈现异常形态。未发育为膜包裹裂殖子的疟原虫会堵塞滤膜，从而显著降低裂殖子的收获量。 

在过滤膜包裹的裂殖子过程中，疟色素会从消化泡中释放出来，并以游离晶体形式存在于溶液中。疟色素具有强烈的促炎性，已有报道表明其可调节单核细胞和巨噬细胞的吞噬作用30,31。除了调节吞噬作用外，如图2所示，疟色素在溶液中还可与裂殖子形成聚集体。由于THP-1细胞能够吞噬这些聚集体，这可能严重影响抗体介导的吞噬作用实验结果的准确性。因此，在本实验中必须去除疟色素，以避免其对吞噬细胞生物学行为带来额外干扰。此外，在利用该技术制备游离裂殖子用于其他实验时，若未去除疟色素，也可能造成不利影响，尤其是在需要对裂殖子进行定量的应用中。

如图4所示，加入检测体系的裂殖子数量会影响THP-1细胞对其吞噬的程度。尽管流式细胞术可用于测定裂殖子浓度，但仍需精确移液并进行重复计数，以提高准确性。当需要平行测试多个寄生虫株系时，这一点尤为关键。先前已有研究证实，来自巴布亚新几内亚（PNG）半免疫儿童的血浆在抗体反应下降前可进行显著稀释23。本文所述为一组5至12岁PNG儿童血浆的最优稀释度（血浆终稀释度为1/120,000），该稀释度产生了图5中描述的广泛吞噬反应范围。此范围使反应可被分为四组（0–19%、20–39%、40–59% 和 60–79% 吞噬率），回归模型分析显示，调理吞噬反应与临床疾病保护及高密度寄生虫血症的防护相关10。对于不同的队列研究，可能需要调整血浆稀释度，以确保THP-1细胞的吞噬作用既未达到饱和，也未低于检测限。

流式细胞术能够实现比显微镜技术更快且更具定量性的吞噬作用检测，且准确性更高。本方案采用基于96孔板的高通量、自动化采集方法，用于研究天然获得性体液免疫。该方法需用溴化乙锭对裂殖子进行染色，但也可使用其他替代性DNA染料，如SYBR Green、DAPI和碘化丙啶，或膜染料及蛋白染料。该检测适用于原代单核细胞或中性粒细胞，并可根据需要调整以研究吞噬细胞或FcR生物学特性。可使用原代细胞或经诱导分化的THP-1细胞 体外 使用PMA可用于研究疟疾及其他病原体的吞噬作用12,32-34然而，使用原代细胞可能存在挑战，因为这些细胞具有贴壁性，且表现出非抗体介导的吞噬作用35此外，原代吞噬细胞在纯度、活力和功能方面的变异性是其应用中的一些关键限制因素。介导裂殖子吞噬作用的Fc受体尚未明确，因此使用针对特定Fc受体的阻断抗体有助于阐明每种Fc受体在裂殖子吞噬过程中的作用。由于THP-1细胞的吞噬作用依赖于FcR，这使得所观察到的吞噬现象易于解释。该检测方法还可用于研究调理抗体的抗原特异性，可通过使用裂殖子表面抗原基因敲除的寄生虫，或使用针对裂殖子表面蛋白的亲和纯化人源抗体来实现。此外，目前尚缺乏对裂殖子吞噬后细胞因子反应的深入研究，而本实验体系可为此类研究提供支持。

这两种技术为功能性抗裂殖子抗体的研究带来了显著进展。高质量裂殖子的纯化方法相较于使用冷冻保存的裂殖子或包被裂殖子抗原的荧光微球具有优势。尽管该检测方法已被用作评估自然获得性免疫的工具，但它也可能成为研究疫苗诱导免疫应答的重要手段。虽然最近的研究表明，吞噬作用或调理化的裂殖子与临床疟疾的保护作用相关，但尚无法从中得出直接结论 体外 THP-1 吞噬作用 体内 在本实验中，裂殖子的吞噬作用是在静态条件下且无竞争性红细胞存在的情况下发生的，因此该方法的潜在改进可能为深入理解疟疾及裂殖子吞噬作用提供一种多功能工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨向儿童和成年血浆捐献者以及巴布亚新几内亚医学研究所的工作人员致以谢意。作者感谢Amandine B Carmagnac、Catherine Q Nie、Danny W Wilson、Ivo Mueller和Diana S Hansen在本技术开发过程中所做出的贡献，并感谢澳大利亚红十字会提供的血液和血清制品。本工作得益于维多利亚州政府运营基础设施支持以及澳大利亚政府国家健康与医学研究委员会（NHMRC）研究基础设施计划（IRIISS）的资助。本研究获得了国家健康与医学研究委员会基金项目 #1031212 和 #637406，以及美国国立卫生研究院基金项目 #AI089686 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
THP-1 细胞系American Type Culture CollectionTIB-202
RPMI-1640Gibco31800-089
胎牛血清（FCS）Invitrogen10099-141
2-巯基乙醇 Sigma-AldrichM6250-100ML在通风橱中使用
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）SigmaP0781
HEPESSAFC90909C细胞培养级
次黄嘌呤Calbiochem4010
人血清 澳大利亚红十字会捐赠可商业获取（例如 Invitrogen）
碳酸氢钠（NaHCO3）Merck1.06329.0500
庆大霉素Pfizer61022027注射级
肝素钠 BP（5000 IU/ml）Pfizer猪源性
杀稻瘟菌素 S 盐酸盐Sigma-Aldrich15205
D-山梨醇Sigma-Aldrich50-70-4
E64 蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichE3132-10MG
KH2PO4Sigma-Aldrich98281-100G用于磷酸盐缓冲液
Na2HPO4.2H20Merck10383.4G用于磷酸盐缓冲液
吉姆萨伊红亚甲蓝溶液Merck1.09204.0500用 6.7 mN 磷酸盐缓冲液稀释至 1:10（每次染色时新鲜配制）
乙二胺四乙酸二钠盐Merck10093.5V0.1 M，pH 7.2
Acrodisc 注射器滤器 1.2-μm/32-mmPall Life Sciences4656
QuadroMACS 分离器（用于小型柱）MACS Miltenyi BioTec130-091-051可与 MidiMACS 互换使用
VarioMACS 分离器（用于大型柱）MACS Miltenyi BioTec130-090-282
MACS 多功能支架MACS Miltenyi BioTec130-042-303
LS 柱（小型磁性柱）MACS Miltenyi BioTec130-042-401
大型磁性柱MACS Miltenyi BioTec130-041-305
溴化乙锭Bio-Rad1510433具有细胞毒性
CountBright 绝对计数微球InvitogenC36950
BD FACSCalibur 流式细胞仪配备 HTS 微孔板读板器BD Biosciences
乙二胺四乙酸二钠盐Merck10093.5V0.1 M，pH 7.2
FlowJo 流式细胞术分析软件Tree Star

参考文献

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E64 THP 1
高产量纯化Plasmodium falciparum裂殖子用于调理抗体检测
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