这些研究报道了腺病毒基因载体可逆性地附着于支架及模型网状圆盘的无涂层金属表面。通过水解用于固定载体的交联剂，实现具有转导活性的病毒颗粒的持续释放，从而在血管细胞和置入支架的动脉中产生持久的位点特异性转基因表达。
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本文内容
摘要
摘要
支架内再狭窄是目前广泛用于恢复冠状动脉和外周动脉严重狭窄节段血流的支架血管重建术的主要并发症。能够可控释放具有抗再狭窄活性基因的血管内支架，可能为当前使用的药物洗脱支架提供一种替代策略。为了实现临床转化，基因洗脱支架必须表现出可预测的支架固定基因载体释放动力学，并实现血管壁的靶向转导，同时避免因聚合物涂层物理包埋载体所常引发的过度炎症反应。本文详细描述了一种无需涂层即可将腺病毒基因载体锚定于支架的实验方法，该方法基于腺病毒颗粒通过可水解交联剂（HC）可逆地结合于经聚烯丙胺双膦酸盐（PABT）修饰的不锈钢表面。本文介绍了一系列双功能（胺基和巯基反应性）HC试剂，其平均分子量为1/2 使用了水解时间在5至50天之间的链内酯键水解来将载体与支架连接。载体固定过程通常在9小时内完成。 包括多个步骤：1）将金属样品在PABT水溶液中孵育（4小时）；2）使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）脱除PABT中引入的巯基保护基团（20分钟）；3）通过将样品与含吡啶二硫基（PDT）修饰的聚乙烯亚胺（PEI）反应，扩增金属表面的巯基反应能力（2小时）；4）用二硫苏糖醇（DTT）将PDT基团转化为巯基（10分钟）；5）用HC修饰腺病毒（1小时）；6）通过尺寸排阻柱色谱法纯化修饰后的腺病毒颗粒（15分钟）；7）将具有巯基反应活性的腺病毒颗粒固定于巯基化钢表面（1小时）。该技术具有广泛的潜在应用前景，不仅限于支架，还可通过基底介导的基因递送至与植入异物材料接触的细胞，促进生物假体装置的表面工程，从而提高其生物相容性。
引言
基因治疗作为一种治疗手段，其有效性受到基因治疗载体靶向能力差的限制1,2。缺乏适当的靶向性会导致目标部位的转基因表达水平低于治疗所需，同时导致载体广泛扩散至非靶器官3，包括那些能够对载体本身及所编码治疗产物产生免疫应答的器官4,5。一种可能克服转导非特异性并促进靶向性的策略，是将基因载体以阻止其通过血液和淋巴系统自由扩散的形式递送至目标部位。通常，这类方法依赖于可局部注射的递送系统，该系统由病毒或非病毒载体与纤维蛋白、胶原蛋白或透明质酸水凝胶基质混合组成6-10，通过将基因载体物理性包埋于聚合物网络中，从而在注射部位实现载体的短暂滞留。
另一种被广泛接受的局部基因治疗范式是将基因载体固定在植入性假体装置的表面11,12。每年有数千万患者使用永久性医疗植入物（如血管内、支气管、泌尿系统和胃肠道支架、起搏器、人工关节、外科及妇科补片等 etc）13。尽管这些装置总体上有效，但其相关并发症目前仍难以通过现有医疗手段充分控制14-17。可植入假体装置为实现局部基因治疗提供了一个独特的代理平台。从药代动力学角度来看，在医疗植入物表面进行修饰，仅需相对较低剂量的基因载体，即可在植入物与组织界面处实现基因载体的高局部浓度，并延缓其从此部位的清除速度。由于载体在局部滞留时间延长且靶向细胞群体对其摄取增强，固定化显....
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方案
1. 释放实验用Cy3标记腺病毒的制备
- 将 2 × 1012 个 Adempty 颗粒（约 2 × 1011 感染单位）悬浮于 650 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（CBB；pH 9.3）中。
- 将 1 小瓶（0.2 mg）胺反应性荧光染料（Cy3(NHS)2）溶于 1 ml CBB 中，终浓度为 0.2 mg/ml。
- 向病毒悬液中加入 100 µl 染料溶液，涡旋 5 秒，于 28 °C 振荡孵育 1 小时（100–200 rpm）。
- 用 PBS 平衡 20 ml Sepharose 6B 柱，将 750 µl Cy3 标记的 Ad 悬液逐滴加至凝胶床中心。
- 待病毒悬液完全渗入树脂后，加入 5 ml PBS，弃去流出液。
- 加入 0.5 ml PBS，并用标记的玻璃容器收集流出液。重复此步骤 10 次 ，共收集 10 份 0.5 ml 的组分。
- 通过分光光度法（260 和 280 nm）检测所收集组分中的病毒 DNA 含量。
- 合并在 260 nm 处光密度（OD）总和（F1 至 F10 之和）超过 10% 的组分。注：通常合并并混合 F3、F4、F5 和 F6 组分。
- 再次通过分光光度法（260 和 280 nm）检测混合后的合并组分，....
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结果
载体释放实验
将腺病毒载体固定在植入物表面（包括血管内支架等介入装置）可使载体更接近疾病部位，部分弥补了载体缺乏物理靶向性的不足。然而，为了通过转导靶组织实现治疗效果，载体必须从表面释放（图 2）。研究假设使用可水解交联剂可实现：1）将载体有效连接至经聚双膦酸盐修饰并引入巯基的金属植入物表面；2）通过交联剂的水解实现载体的持续释放。
通过使用针对 eGFP 的特异性引物对病毒 DNA 进行 PCR 检测，可确定在衍生化过程结束时与网状圆片结合的 AdeGFP 载体的基因组拷贝数（图 3）。根据所使用的特定交联剂，结合的 Ad 载体数量应在每片网状圆片 3.5 × 109 至 5.7 × 109 个颗粒之间。该数值与单个网状圆片（总面积为 0.25 cm2）以单层排列方式容纳 100 nm Ad 颗粒的理论最大容量（2.5 × 10.......
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讨论
本方案描述了一种通过腺病毒载体可逆性地结合无涂层不锈钢表面，实现基质介导基因递送的操作方法。该技术虽最初为支架介导的血管再狭窄基因治疗而开发，但在生物材料、生物医学植入物及基因治疗等领域具有更广泛的应用前景。
尽管已发表的研究仅使用不锈钢作为典型的金属基底，但PABT对其他金属合金（如钴/铬和镍钛诺）也具有相当的结合亲和力（未发表）。PABT与金属的非特异性相互作用显著拓展了该技术在生物医学领域的潜在应用范围31。此外，尽管需要通过其他方法在材料表面引入巯基，但使用HC连接的基因载体在其他类型的生物材料上也是可行的。
尽管腺病毒基因载体在多种人体细胞类型和组织中能够实现高效的转导，但其临床应用受到腺病毒科（Adenoviridae）所引发的强烈炎症和免疫反应的限制4。为此，近期研究显示（尚未发表），采用HC修饰的表达荧光素酶的腺相关病毒载体所制备的基因洗脱支架，可实现长达4个月的动脉内基因表达。
该方法具有较强.......
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披露
本论文中所述的方案开发与研究工作部分得到了美国心脏协会科学家发展基金（I.F. 0735110N 和 M.C. 10SDG4020003）、美国国家心肺血液研究所基金 HL 72108（R.J.L.）以及美国国家心肺血液研究所 T32 007915（S.P.F.）的支持。血管成形术导管由 NuMED 公司（纽约州霍普金顿）慷慨捐赠。作者谨此感谢 Susan Kerns 女士提供的秘书协助。
致谢
作者无须披露相互竞争的财务利益。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 316不锈钢网片 | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| 通用304级不锈钢支架 | Laserage | 定制订单 | |
| AdeGFP | 宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室 | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | 宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室 | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | 宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室 | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96孔板 | Costar | 3635 | |
| 荧光测定用96孔板 | Costar | 3915 | |
| 细胞培养用96孔板 | Falcon | 353072 | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP） | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| 分光光度计 | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| 荧光分光光度计 | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| 轨道摇床培养箱 | VWR | 1575R | |
| 水平气流烘箱 | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2离心机 | International Equipment Company | 426 | |
| 数字涡旋混合器 | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300荧光显微镜 | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD相机 | Leica | DC-500 | |
| 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | 无 | |
| IVIS Spectrum生物发光成像系统 | Perkins-Elmer | 无 | |
| 乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA dipotassium salt） | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| 牛血清白蛋白第五组分（BSA） | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont镊子 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10细胞系 | ATCC | CRL-1476 | |
| 牛主动脉内皮细胞 | Lonza | BW-6002 | |
| 荧光素钾盐 | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| 不含钙和镁的PBS | Gibco | 14190-136 | |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM高糖培养基 | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25%胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA微量提取试剂盒 | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR主混合液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp光学96孔反应板 | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp光学粘性封膜 | Applied Biosystems | 4360954 | |
| 头孢唑林 | Apotex | 无 | |
| Loxicom（美洛昔康） | Norbrook | 无 | |
| 肝素钠 | APP Pharmaceuticals | 无 | |
| Ketavet（氯胺酮） | VEDCO | 无 | |
| Anased（赛拉嗪） | Lloid | 无 | |
| Forane（异氟烷） | Baxter | 无 | |
| 弯头Moria虹膜镊 | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| 弯头超细Graefe镊 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas弹簧剪 | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| 精细剪刀 - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| 薇乔缝线（5-0） | Ethicon | J385 | |
| 缝合线（4/0丝线） | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel缝线夹 | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| 伤口扩张器（Lancaster眼睑撑开器） | KLS Martin | 34-149-07 | |
| 热珠灭菌器 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel缝线夹施加器 | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G静脉导管 | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty导管 | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| 特氟龙管 | Vention | 041100BST | |
| PTA导管 | NuMed | 定制订单 | |
| 纱布垫 | Kendall Healthcare | 9024 | |
| 棉签 | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| 生理盐水 | Baxter | 281321 | |
| 10 ml注射器（鲁尔锁） | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml注射器（鲁尔锁） | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| 配备#40刀头的剃毛器 | Oster | 78005-314 | |
| Transpore外科胶带 | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet眼膏 | Pharmaderm | 无 |
参考文献
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral ....
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重印与许可
