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人源INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的生成与纯化

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DOI：

10.3791/51720

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2014年10月23日

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

本文内容

摘要

本方案描述了生成和纯化人源INO80染色质重塑复合物的野生型及突变型的方法。INO80亚基的表位标签版本在HEK293细胞中稳定表达，并通过免疫亲和层析纯化完整的复合物以及缺失特定亚基组合的复合物。

摘要

INO80 染色质重塑复合物通过催化 ATP 依赖的核小体重塑来调控核小体动态性和 DNA 可及性。人类 INO80 复合物由 14 个蛋白质亚基组成，其中包括 Ino80，一种 SNF2 类 ATP 酶，它既是催化亚基，也是复合物组装的支架。其他亚基的功能及其对 INO80 复合物染色质重塑活性贡献的机制仍不清楚，部分原因在于难以在人类细胞或异源表达系统中生成 INO80 亚复合物。本 JoVE 实验方案描述了一种可用于纯化缺失一个或一组亚基的人类 INO80 染色质重塑亚复合物的方法。通过 Flp 介导的重组，将 N 末端带有 FLAG 表位标签的 Ino80 cDNA 稳定地导入人胚肾（HEK）293 细胞系中。若需删除 INO80 复合物中的某组亚基，则表达缺乏这些亚基组装所需平台的突变型 Ino80 蛋白。若需耗竭单个亚基，则将靶向该亚基的 siRNA 转染至稳定表达 FLAG 标签 Ino80 ATP 酶的 HEK 293 细胞系中。制备核提取物后，进行 FLAG 免疫沉淀，以富集含有 Ino80 衍生物的蛋白组分。随后可通过免疫印迹、银染及质谱等方法分析纯化的 INO80 亚复合物的组成。根据本实验方案生成的 INO80 及其亚复合物可进一步用于多种生化分析，相关方法详见配套的 JoVE 实验方案。此处描述的方法可适用于研究任何哺乳动物多亚基染色质重塑和修饰复合物的结构与功能特性。

引言

在进化上保守的SNF2家族染色质重塑复合物是染色质结构组织和DNA可及性的关键调控因子1。这些重塑复合物通常包含一个核心的SNF2样ATP酶亚基，在某些情况下，该亚基会与多种辅助蛋白组装，形成多亚基的大分子复合物。为了研究ATP依赖性染色质重塑过程的分子机制，理解特定亚基组合和/或结构域对复合物功能的贡献至关重要。此类分析需要能够制备出高度纯化的突变型复合物，即缺失特定蛋白亚基或结构域的复合物。

以往对ATP依赖性染色质重塑复合物的结构-功能研究广泛集中于酵母模型系统，原因是酵母基因组具有优越的可操作性（例如，参见文献1-4）。鉴于同源重塑复合物在亚基组成和功能上的保守性，对酵母重塑复合物结构与功能的研究为理解高等真核生物中相应复合物提供了重要启示。然而，不同物种间的重塑复合物确实存在显著的特异性差异，这些差异源于物种特异性亚基的获得或丢失、保守亚基中物种特异性结构域的获得或丢失，以及保守亚基中保守结构域内的序列变异。原则上，这些差异可能是由于高等真核细胞需要适应新的分子和细胞环境所驱动的。因此，理解高等真核生物重塑复合物的各个亚基如何参与核小体重塑过程具有重要价值，因为这不仅有助于阐明ATP依赖性染色质重塑过程的基本机制，还可能为揭示高等真核生物中染色质结构和基因表达调控的机制提供宝贵见解。

迄今为止，对多亚基哺乳动物染色质重塑复合物的结构与功能研究仍十分有限，部分原因在于难....

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方案

1. 表达全长或突变型 FLAG 表位标签 Ino80 或其他 INO80 复合物亚基的 HEK293 稳定细胞系的构建与培养

  1. 将编码全长或突变型人源 Ino80 ATP 酶或其他 INO80 亚基的 cDNA 克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA5/FRT 中，确保其带有同读框的 N 端 FLAG 表位标签。
  2. 在进行后续实验前，通过 DNA 测序确认插入的 cDNA 序列正确无误。
  3. 进行转染时，将 Flp-In HEK293 细胞在含 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）、5% 谷氨酰胺和 10% FBS（胎牛血清）的培养基中，于 10 cm 组织培养皿中培养。
  4. 当细胞融合度达到约 70% 时，向每个组织培养皿中加入 800 μl 的混合液，其中包含 40 µl FuGENE6 转染试剂、0.5 µg 相应的 pcDNA5/FRT 表达质粒以及 9.5 µg 编码 Flp 重组酶的 pOG44 质粒。
  5. 48 小时后，用胰酶消化细胞，并以 1:30 的比例分种至新的 10 cm 培养皿中，在含 5% 谷氨酰胺、10% FBS 和 100 µg/ml 潮霉素 B 的 DMEM 培养基中继续培养 3–4 周。当培养基开始变黄时（通常每 3–5 天）更换新鲜培养基。
  6. 为筛选表达 FLAG 标签蛋白水平最高的阳性克隆，挑取单个抗潮霉素 B 的菌落，并转移至 24 孔板中的单个孔内。
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结果

图1 展示了一个流程图，总结了用于生成、纯化和表征人源INO80依赖ATP的染色质重塑复合物的实验步骤。

如图2和图3所示，这些方法可用于生成野生型INO80以及缺失不同亚基的INO80亚复合物，从而进一步对这些缺失亚基对INO80酶活性的贡献进行生化分析。图2描述了我们用于解析INO80复合物结构并生成INO80亚复合物的两种策略。第一种策略如图2A所示，通过带有FLAG标签的野生型亚基（Ies2或INO80E）纯化完整的INO80复合物。而亚复合物则可通过表达缺失特定结构域的突变型Ino80蛋白（这些结构域是不同亚基组装所依赖的位点）并进行表位标签纯化获得。如图3A所示，通过银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶评估所得复合物的纯度，而复合物的组成则通过针对不同INO80亚基的抗体进行Western印迹分析（图3B）或质谱分析（数据未显示）加以确认。采用该.......

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讨论

来自高等真核生物的多亚基哺乳动物染色质重塑复合物的结构与功能研究，一直受到难以制备出足够生化用量的突变亚基复合物或完全缺失特定亚基的复合物的限制。这一领域存在若干技术障碍：首先，在哺乳动物细胞中进行遗传操作在技术上具有挑战性且耗时较长。与酵母细胞不同，后者的基因组可通过重组工程技术轻松编辑和靶向，而哺乳动物基因组结构更为复杂，对重组工程技术的敏感性较低。因此，在培养细胞或动物中删除或修饰哺乳动物基因的过程更加耗时，并需要更专业的技术 expertise。结果，携带结构突变或缺失部分亚基的突变型哺乳动物复合物的构建成为研究的限速步骤。其次，利用异源蛋白表达系统进行生化重建的方法常用于生成明确的多蛋白组装体。然而，对于非常大的复合物而言，这类方法在技术上面临困难，因为其亚基可能需要以正确的化学计量比同时表达，和/或在特定顺序下组装，并依赖特定的分子伴侣或辅助因子协助。这些问题在INO80复合物的研究中尤为突出，因为其Ino80 ATP酶亚基在昆虫细胞或E. coli细胞中难以以生化可用的量有效表达。在对INO80染色质重塑复合物的研究中，采用本实验方案所述策略可部分克服上述挑战。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者实验室的工作得到了美国普通医学科学研究所（GM41628）资助以及堪萨斯城大社区基金会海伦·尼尔森医学研究基金对斯托尔斯医学研究所的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）Cellgro10-013-CV
Glutamax-I（稳定型谷氨酰胺）Life Technologies35050-079
胎牛血清SAFC12176C
FuGENE6 转染试剂PromegaE2312
潮霉素B，PBS中无菌溶液AG ScientificH-1012-PBS
pcDNA5/FRT 载体Life TechnologiesV6010-20
Flp-In HEK293 细胞Life TechnologiesR780-07
pOG44 Flp-重组酶表达载体Life TechnologiesV600520
EZview 红色 ANTI-FLAG M2 亲和凝胶SigmaF2426
小牛血清SAFC12138C
TARGETplus SMARTsiRNA 混合物Dharmacon / Thermo Scientificvarious
5x siRNA 重悬缓冲液Dharmacon / Thermo Scientific#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAXLife Technologies13778
Opti-MEM 低血清培养基Life Technologies51985-091
PBSCellgro45000VWR
TrypLE（胰蛋白酶）Life Technologies12604
1x FLAG 肽段SigmaF3290
微型 Bio-Spin 层析柱Bio-Rad737-5021
Amicon Ultra 离心过滤装置（50k 截留分子量）AmiconUFC805024Fisher Scientific
Zeba 脱盐柱Thermo Scientific89882
抗 FLAG M2 抗体，小鼠来源SigmaF3165
抗 FLAG M2 抗体，兔来源SigmaF7425
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340
苯并核酸酶（benzonase）Novagen70664
仪器设备
J6 离心机中的 JS-4.2 转子Beckman-Coulter339080
JA-17 转子Beckman-Coulter369691
10 ml 聚碳酸酯管Beckman-Coulter355630
70 ml 聚碳酸酯瓶Beckman-Coulter355655
Type 45 Ti 转子Beckman-Coulter339160
Type 70.1 Ti 转子Beckman-Coulter342184
BD Clay Adams Nutator 混合器BD Diagnostics15172-203VWR
Glas-Col 试管/小瓶旋转混合器Glas-Col099A RD4512
PCR 扩增仪 PTC 200MJ ResearchPTC 200
滚瓶培养箱Bellco biotechnology353348
Immobilon-FL 转印膜 7 x 8.4MilliporeIPFL07810
润滑型 1.5 ml 微量离心管Costar3207

参考文献

  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-r....

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INO80 FLAG HEK 293 FLAG

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