用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

摘要

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。

摘要

SNF2 家族 ATP 酶的成员通常作为多亚基染色质重塑复合物的组分，通过催化依赖 ATP 的核小体重塑，调控核小体动态和 DNA 可及性。为了从生物化学角度解析此类复合物中各个亚基在多步骤的 ATP 依赖性染色质重塑反应中的具体贡献，需要采用能够监测反应产物生成并测量反应中间体形成的实验方法。本 JoVE 实验方案描述了可用于测定包含不同亚基组合的染色质重塑复合物或亚复合物生化活性的多种检测方法。染色质重塑活性通过 ATP 依赖性核小体滑动实验进行测定，该方法采用基于电泳迁移率偏移分析（EMSA）的技术来监测核小体在 DNA 分子上的移动。核小体结合活性则通过类似的 EMSA 方法检测，用于观察重塑复合物结合的单核小体的形成。而 DNA 或核小体依赖的 ATP 酶活性则采用薄层色谱法（TLC）测定，在存在 DNA 或核小体的条件下，检测 ATP 转化为 ADP 和磷酸的速率。利用这些检测方法，可通过比较完整复合物与缺失一个或多个亚基的复合物之间的活性差异，来研究染色质重塑复合物中各亚基的功能。本文以人类 INO80 染色质重塑复合物为例进行说明；然而，此处描述的方法也可适用于其他染色质重塑复合物的研究。

引言

SNF2家族染色质重塑复合物包含一个中心SNF2样ATP酶亚基^1,2。某些SNF2样ATP酶以单亚基酶的形式发挥作用，而另一些则作为大型多亚基复合物的催化亚基发挥作用。要阐明染色质重塑复合物各个亚基如何在分子机制上贡献其活性，需要能够开展可解析重塑过程的生化实验。

人类INO80复合物及其他染色质重塑酶依赖ATP的核小体重塑过程可视为一个多步骤机制，起始于重塑酶与核小体的结合，随后激活其DNA和/或核小体依赖的ATP酶活性，接着重塑酶在核小体DNA上发生转位，最终实现核小体的重新定位 ^1,2理解ATP依赖性染色质重塑过程的分子细节，需要将重塑反应分解为各个独立步骤，并明确染色质重塑复合物中各个亚基在反应每一步骤中的作用。此类分析需要能够利用定义明确的分子底物来研究核小体重塑及其他相关活性。 体外.

在之前的一期JOVE实验方案中，我们描述了用于生成具有明确亚基组成的INO80染色质重塑复合物及其亚复合物的方法³。在此，我们介绍了三种生物化学检测方法，可用于定量分析此类复合物相关的核小体结合能力、DNA及核小体激活的ATP酶活性以及核小体重塑活性。

方案

1. ATP依赖性核小体重塑实验

为了检测ATP依赖的核小体重塑活性，将免疫纯化的INO80或INO80亚复合物与ATP以及单核小体底物共同孵育，该底物包含一个定位在216 bp、³²P标记的DNA片段一端的单个核小体。反应产物随后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析。

1. 为制备³²P标记的“601”DNA片段，以pGEM-3Z-601⁴为模板，使用引物5′-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG（正向）和5′-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG（反向），扩增一段包含末端定位的601核小体定位序列的216 bp DNA片段。
   1. 按照表1所述配制100 μl PCR反应体系。
   2. 在PCR仪中进行扩增，程序如下：96 °C预变性1 min；随后进行30个循环：94 °C变性45 sec，57 °C退火30 sec，72 °C延伸60 sec；最后72 °C终延伸7 min。
   3. PCR反应结束后，将反应产物通过无核酸酶的离心柱纯化两次，以去除未掺入的核苷酸。
   4. 取5 μl纯化后的PCR产物，在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，确认是否成功扩增出约216 bp的目标DNA片段。
   5. 将5 μl纯化后的PCR产物稀释20倍，使用紫外分光光度计测定DNA浓度。平均产量约为~40 ng/μl。
   6. 使用液体闪烁计数器测定1 μl纯化PCR产物的放射活性，通过计算cpm/ng评估标记效率。成功的标记反应应获得约15,000 cpm/ng的601 DNA片段。
2. 采用连续稀释法将Hela细胞核小体转移至标记的601 DNA上⁵。
   1. 将2 pmol的³²P标记601 DNA片段与6 µg Hela核小体（制备方法见文献⁵）混合于50 µl缓冲液中，缓冲液组成为1.0 M NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF和1 mM DTT，30 °C孵育30 min。
   2. 依次加入12.5 µl、20.8 µl和41.6 µl的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF和1 mM DTT缓冲液，将混合物逐步稀释至0.8 M、0.6 M和0.4 M NaCl，每次稀释后均在30 °C孵育30 min。
   3. 再加入125 µl、然后250 µl含有0.1% Nonidet P-40、20%甘油和200 µg/ml BSA的相同缓冲液，将混合物进一步稀释至0.2 M和0.1 M NaCl，两次稀释之间在30 °C孵育30 min。单核小体底物可于4 °C保存最多3个月。
3. 在总体积为10 µl的反应体系中进行ATP依赖性核小体滑动反应。反应组分见表2。由于INO80核小体重塑活性的最适NaCl浓度约为50 mM NaCl（未发表结果），需根据核小体和酶制剂中所含NaCl量，将各反应体系中的总NaCl浓度调整至50 mM。
   1. 在开始设置反应前，灌制天然聚丙烯酰胺凝胶（18 × 16 cm）。配制单块含5%丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 37.5:1）、0.5× TBE（45 mM Tris硼酸，1 mM EDTA）、0.01%过硫酸铵（APS）和0.001% N,N,N´,N´-四甲基乙二胺（TEMED）的凝胶，混合表3所列组分，室温下聚合至少2小时。
   2. 同时，为每个反应在预冷的硅化1.5 ml微量离心管中加入约20 nM INO80或INO80亚复合物（制备方法见文献³），并加入适量EB100缓冲液（表4），使总体积达4.75 μl。剩余含INO80的组分应立即用粉末干冰或液氮速冻保存。
   3. 将其余组分配制成主混合液（master cocktail），按“X”倍放大（X = 总反应数 + 3）。单个10 μl反应所需各组分的量见表5；根据实际反应数量按比例放大配制。通过轻弹管壁或移液器吹打充分混匀，并在台式微量离心机中短暂离心数秒。
   4. 将5.25 µl主混合液分别加入步骤1.3.2中已准备好的各反应管中，吹打混匀。将反应管转移至30 °C金属浴或水浴中，开始反应并孵育2小时。
   5. 同时，配制含有竞争性DNA和核小体的“终止反应混合液”（removing mix），按X倍放大（X = 总反应数 + 4）。单个反应需1.5 µl终止反应混合液，其各组分用量见表6；根据检测数量按比例放大配制。
   6. 向各反应管中加入1.5 μl终止反应混合液以终止反应，充分混匀后短暂离心，再于30 °C孵育30 min。
   7. 同时，在垂直电泳装置中，以0.5× TBE为电泳缓冲液，在4 °C、100 V条件下预电泳30 min，下层电泳槽中放置磁力搅拌子以保持缓冲液循环。
   8. 上样前，向样品中加入2.5 µl上样染料（含3× TBE、30%甘油、0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯蓝FF），充分混匀后短暂离心，使用专用上样吸头将样品加至凝胶加样孔中。
   9. 在4 °C、200 V条件下持续电泳4.5小时，保持缓冲液循环。
   10. 为检测信号，将凝胶转移至两张滤纸叠成的吸水垫上，用保鲜膜包裹滤纸和凝胶，于4 °C条件下曝光至磷屏成像仪存储屏上所需时间。
   11. 使用同位素成像扫描系统扫描存储屏，并用相应软件分析数据。

2. 单核小体结合实验

为了检测给定的INO80复合物与单核小体的结合亲和力，使用第1.2步生成的单核小体底物进行电泳迁移率变动分析（EMSA）。

1. 按照核小体重塑实验所述设置结合反应体系，但反应中省略ATP和去除混合物；在30 °C下孵育30分钟。
2. 向每种反应混合物中加入2.5 µl上样染料，并上样至含有3.5%丙烯酰胺（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 37.5:1）、1%甘油、0.5x TBE、0.01%过硫酸铵（APS）和0.001%四甲基乙二胺（TEMED）的非变性聚丙烯酰胺凝胶中。
3. 使用0.5x TBE作为电泳缓冲液，在4 °C下以200 V电压运行2.5小时，同时循环缓冲液，并将凝胶暴露于存储磷屏进行检测。

3. DNA 和核小体依赖性 ATP 酶活性检测

在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、60 mM NaCl、6.6 mM MgCl₂、0.8 mM EDTA、0.015% Nonidet P-40、2.5% 甘油、0.1 mg/ml BSA、1 mM DTT、0.1 mM PMSF、2 mM ATP 和 2 μCi [α-³²P] ATP（3,000 Ci/mmol）的5 μl反应体系中进行ATP酶活性检测。针对每种待测的INO80复合物或不同量的INO80复合物，设置三个平行反应：一个加入EB100缓冲液以检测DNA或核小体非依赖性ATP酶活性，一个加入闭合环状质粒DNA（5,000 bp，约30 nM）以检测DNA依赖性ATP酶活性，另一个加入HeLa寡核小体（约185 nM）以检测核小体依赖性ATP酶活性。所有反应均需在冰上设置。

1. 每个反应中，将10–50 nM经免疫纯化的INO80或INO80亚复合物与适量EB100缓冲液混合，使总体积达到2.2 μl，置于预冷并润滑的1.5 ml微量离心管中。立即将任何含INO80的组分在粉末干冰或液氮中重新冷冻。
2. 配制主混合液。单个反应所需各组分的用量见表7。将配方按3(X+2) +1倍放大，其中X = 需要检测的INO80样品数量。
3. 为制备仅含缓冲液、DNA或核小体的“次级混合液”，将2.5(X+2) μl主混合液分别加入三个独立的离心管中。向各管中分别加入0.3(X+2) μl EB100、闭合环状质粒DNA（1.5 µg/µl）或Hela寡核小体（1.5 μg/μl），并充分混匀。
4. 将2.8 μl相应的次级混合液加入第3.1步准备好的含酶反应管中。轻轻吹打混匀，避免产生气泡。
5. 为启动反应，将反应管转移至30 °C金属浴中。
6. 在孵育5、15、30和60分钟后，从每个反应体系中取0.5 μl反应混合物，沿直线点样于纤维素聚乙烯亚胺薄层色谱（TLC）板（20 × 10 cm）上，点样位置距离板底边缘至少1.5 cm。点样后立即将反应管放回30 °C金属浴，以便从同一反应管中采集多个时间点。点样完成后，使用吹风机彻底干燥TLC板。
7. 将TLC板转移至玻璃展开槽中，槽内加入足量0.375 M磷酸钾溶液（pH 3.5），使TLC板底部约0.5 cm浸入溶液中。
8. 盖上展开槽盖子，待液相前沿迁移至TLC板顶端时停止展开。立即使用吹风机将板彻底干燥。
9. 将干燥后的TLC板在室温下暴露于储存型磷屏。使用同位素成像扫描系统扫描磷屏，并测定放射性ATP底物和ADP产物的量。
10. 计算水解ATP的量时，将ATP水解百分比乘以起始反应混合物中ATP的总量，计算公式如下：水解ATP的pmol数 = 起始反应中10 pmol ATP × [ADP/(ATP+ADP)]

结果

图中展示了用于表征INO80活性的生化实验的代表性结果，包括核小体滑动（图1）和结合（图2）实验，以及DNA或核小体依赖性ATP酶实验（图3）。

实验如图所示 图1 比较通过 FLAG-Ies2 或 FLAG-INO80E 纯化的完整 INO80 复合物，以及通过 FLAG-Ino80ΔN 或 Ino80ΔNΔHSA 纯化的 INO80 亚复合物，催化组装于 216 bp 放射性标记 DNA 片段上的单核小体发生重塑的能力。核小体在 DNA 片段上的位置影响其电泳迁移率；位于侧位的核小体在凝胶中的迁移速度比位于中心位置的核小体更快。由于 INO80 染色质重塑复合物优先将单核小体向 DNA 片段的中心位置移动^6,7,8通过观察电泳迁移率降低的一组核小体的出现，来监测重塑活性。反应结束后，需向反应体系中加入过量的HeLa寡核小体以及鲑鱼精子DNA或其他DNA作为竞争性抑制物，以去除与底物结合的INO80或INO80亚复合物，因为...

讨论

为了确保在实验中观察到的核小体重塑和ATP酶活性依赖于INO80复合物的催化活性，而非来自污染的重塑酶和/或ATP酶，我们通常会平行纯化出与野生型INO80采用相同方法制备的催化失活型INO80复合物，并常规检测其核小体重塑活性和ATP酶活性。在检测核小体重塑活性时，还应设置一个不含ATP的阴性对照反应，以检测是否存在污染的ATP和/或ATP非依赖性重塑活性，这些因素可能会影响对不同制备批次的INO80复合物或亚复合物活性比较实验结果的解释。催化失活型的INO80或INO80亚复合物应不表现出任何核小体重塑或ATP酶活性。此外，若检测到DNA或核小体非依赖性的ATP酶活性，则表明酶组分中存在污染的ATP酶。如果在使用催化失活型Ino80的情况下仍检测到活性，或即使按照“代表性结果”部分所述优化了纯化步骤后，仍存在显著的DNA或核小体非依赖性ATP酶活性，则可进一步通过离子交换层析、凝胶过滤层析或梯度沉降等额外步骤对复合物进行进一步纯化。

在测定核小体重塑和ATP酶活性时，建议使用不同时间长度以及多种浓度的INO80或INO80亚复合物进行实验，以确保在产物-时间曲线和剂量-反应曲线...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340
10x PCR反应缓冲液	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA聚合酶	Roche Applied Science	11435094001
NucAway无核酸酶离心柱	Ambion	货号 # AM10070
超纯ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
牛血清白蛋白	Sigma	A9418
40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1	Amresco	0254-500ML
超声处理的鲑鱼精子DNA	GE Healthcare	27-4565-01
10%过硫酸铵（APS）	Thermo Scientific	17874
苯甲酸酶	Novagen	货号 No. 70664
dCTP，[α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR热循环仪 PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer垂直电泳装置	Hoefer	SE600X-15-1.5
润滑型1.5 ml微量离心管	Costar	3207
储存式磷屏	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM滤纸	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon磷光成像仪	GE Healthcare	8600
ImageQuant软件	GE Healthcare	ver2003.02
TLC玻璃板，PEI-纤维素F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL转印膜 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
通用型辐射巡测仪，配备端窗或薄饼型GM（盖革-米勒）探头	Biodex	Model 14C