通过诱导实现蛋白质删除 子宫内 电穿孔法在转基因模型中界定神经元迁移缺陷

摘要

神经元迁移受到多种细胞自主性和非细胞自主性因素的调控。本方案展示了如何 在子宫内 电穿孔可用于确定转基因小鼠的表型是源于细胞内在机制的破坏，还是源于神经元与其环境之间相互作用的受损。

摘要

利用转基因小鼠品系中的 Cre-Lox 系统进行基因删除是研究蛋白质功能的有力工具。然而，除了极少数特定的 Cre 模型外，在整个组织或细胞群体中广泛删除某种蛋白质通常会因多种相互作用的机制而产生复杂的表型。要判断某一表型是由细胞自主性机制（即细胞自身内在的机制）破坏所致，还是由非细胞自主性机制（即由该细胞所处环境受损引起）导致，往往难以区分。为了深入了解蛋白质在 in vivo 条件下的功能，胚胎内电穿孔技术（in utero electroporation, IUE）能够在发育中的大脑皮层或其它选定脑区内的少数细胞中实现基因删除。IUE 可用于靶向特定脑区，包括背侧端脑、内侧端脑、海马或神经节隆起。该方法使得在健康环境背景下观察细胞自主性基因删除所导致的后果成为可能。本实验方案的目标是展示如何利用 IUE 分析在 floxed 转基因小鼠品系中出现的放射状迁移缺陷，并重点区分蛋白质删除的细胞自主性与非细胞自主性效应。通过比较在整个皮层中进行基因删除所导致的表型与通过 IUE 在有限细胞群体中实现基因删除所产生的表型，可以获得比单独使用任一技术更深入的关于蛋白质在脑发育中功能的认识。

引言

径向迁移是早期皮层发育的核心过程。该过程依赖于多种细胞自主性因素，如正确的有丝分裂退出和神经元分化、细胞极性、细胞骨架动态的调控以及跨膜受体的表达，同时也依赖于非细胞自主性因素，例如放射状胶质支架的形成和迁移导向分子的分泌^1-3。由于这些机制中任何一项的破坏都可能导致转基因小鼠模型中神经元迁移受损^4-8，因此确定迁移缺陷的根本原因可能是一个复杂且困难的过程。在体电穿孔（IUE）可用于辅助并简化对基因敲除模型表型的解释，从而阐明径向迁移所必需的关键机制^7,9-11。

在体电穿孔（IUE）是一种将携带目的基因和报告基因的质粒注入小鼠或大鼠胚胎脑室，再通过电流作用使质粒进入脑室壁细胞内的技术^12-14。该技术使研究者能够分析目的基因表达上调或下调对电穿孔神经元发育或功能的影响。IUE处理后，脑组织可用于免疫组织化学分析^7,9-11、电生理记录¹⁵或细胞培养^16,17。IUE的主要优势在于可实现对基因表达的高度特异性操控。此外，通过定向电流，IUE还可靶向发育中脑的特定区域（图2）。通过使用不同启动子调控的质粒或质粒激活系统（如四环素诱导的基因表达系统），IUE还可实现对特定细胞类型的靶向操控^10,18-21。

方案

注意：所有实验均经渥太华大学动物护理伦理委员会批准，遵循加拿大动物护理委员会的指南。

1. 术前准备和材料

1. 质粒制备：
   1. 根据制造商的说明书，使用Qiagen MegaPrep试剂盒制备质粒。接种至少400 ml LB液体培养基于转化后的细菌中，以确保获得高产量的DNA，并过夜培养。
   2. 将质粒重悬于100–200 µl TE缓冲液中，终浓度至少为5 µg/µl。分装DNA并储存于-20 °C。若浓度太低，不要进行沉淀和重悬操作，以免引入杂质；应重新开始新的质粒制备。
   3. 手术前，将单个质粒（例如Cre-GFP）用无菌水稀释至2 µg/µl，并在每10或20 µl稀释后的质粒溶液中加入1 µl 0.1% (w/v) Fast Green染料。若GFP和目的基因需通过两个独立的质粒共电穿孔，则应以1:4的比例注射GFP质粒和携带目的基因的质粒，以最大化所有GFP标记细胞同时被两种质粒共转染的可能性。
2. 使用标准的拉针仪，以62 °C单步拉制法拉制玻璃毛细管（外径1 mm，后文简称针头）。
3. 对包含以下物品的手术包进行高压灭菌：持针器、伤口牵开器、镊子、手术剪、针头剪、缝合器、缝合钉、纱布、伤口覆盖物和手术单（图1A、B；材料表）。
4. 准备其他所需工具....

结果

通过改变桨状电极在胚胎头部的位置方向，可以针对大脑的不同区域进行电穿孔（图2）。对于前脑的所有区域，需将质粒注射至侧脑室（若要靶向后脑，则应注射至第四脑室）。通常情况下，应放置电极，使两电极之间的直线穿过目标区域，并使DNA向正极方向迁移。若要靶向外侧皮层（图2A），应将正极置于绿色新月形区域上方，并略微向前倾斜一定角度。对于内侧皮层（图2B），则调换电极方向，使正极位于对侧未注射的脑室上方，此时向前倾斜的角度应更大。若要靶向海马体（图2C），应将正极置于对侧，但使正极向尾侧倾斜（电穿孔操作必须在神经前体细胞仍位于皮层镰部位、尚未迁移到海马体最终位置的发育阶段进行）。若要靶向神经节隆起（图2D），应将电极桨片与胚胎耳部对齐放置，正极略低于负极。上述各电穿孔区域的代表性图像见于图2。

验证电转脑组织中Cre介导的切除效应至关重要。理想的方法是对目标转录本或蛋白进行原位杂交或免疫组织化.......

讨论

进行该操作时的两个主要挑战 在子宫内 电穿孔过程中，1）防止胚胎死亡，以及2）降低电穿孔之间的变异是两个关键因素。防止胚胎死亡最重要的因素之一是针头质量，因为钝的针头会对胚胎造成更大的损伤。在切割针头时，应尽可能保留较长的针尖，同时确保踩下脚踏泵后能观察到0.1–0.2 µl液体形成可见液滴。 （图1J）如果针头过于钝化或针 shaft 过短，可能导致组织损伤而杀死胚胎。相反，若针尖过于精细，则需要较长时间才能注入足够的质粒体积；针头在脑内停留过久会因操作者手部不可避免的震动以及胚胎的轻微旋转而造成损伤。此外，可使用微切削仪制备具有锋利斜面针尖的注射针，以便对更年轻、更脆弱的胚胎进行注射，但对于 E13.5 及更晚期的胚胎通常无需如此。

怀孕雌性个体的应激水平是影响胚胎存活的另一个关键因素。母体的应激水平越高，越容易发生流产。因此，在手术前后应尽量缩短麻醉时间，并尽可能减少环境更换。遗传背景品系也会影响应激水平，必要时可将易产生焦虑行为的品系与CD1等品系进行杂交，前提是所研究的表型在不同遗传背景品系之间保持一致。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 方波电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus	45-0052	仅电穿孔仪 – 电缆需单独购买（45-0204）
ECM 830 用 1250FS 脚踏开关	BTX Harvard Apparatus	45-0211	脚踏板是实现免手操作电穿孔的必要配件
镊式电极（Tweezertrodes）	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)	铂金镊状电极
Femtojet	Eppendorf	920010504	显微注射仪
Griphead 0	Eppendorf	920007414	用于固定拉制好的玻璃针
通用毛细管夹持器	Eppendorf	920007392	连接 Griphead 与管路
注射管	Eppendorf	920007431	连接毛细管夹持器与 Femtojet
脚踏控制器	Eppendorf	920005098	用于免手操作注射的脚踏板
Microloader 吸头	Eppendorf	930001007	用于向拉制毛细管中加样
质粒大提试剂盒	Qiagen	12181	含 5 个 QIAGEN-tip 2500、试剂和缓冲液
亮蓝 FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	无毒染料
超精细 Bonn 剪刀	Fine Science Tools	14084-08	用于修剪注射针
Bonn 斜视剪刀	Fine Science Tools	14084-09
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11050-10	直型
Colibri 牵开器	Fine Science Tools	17000-03
缝合器	Fine Science Tools	12031-07	用于 7 mm 夹子
Castroviejo 针持	Medical Tools	SNH-6737	直型，带锁扣
玻璃微电极拉制仪	Narishige	PC-10	用于拉制微毛细管
微毛细管	Drummond	1-000-800	内径 0.4 mm 的玻璃毛细管